Белки-маркеры IgA-нефропатии и фокальносегментарного гломерулосклероза по данным масс-спектрометрии Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

© Н.А.Броновицкая, М.М.Батюшин, И.В.Сарвилина, Д.Г.Пасечник, 2014 УДК [616.61-002+616.153.962]-073.584

Н.А. Броновицкая2, М.М. Батюшин1,2, И.В. Сарвилина4, Д.Г. Пасечник3

БЕЛКИ-МАРКЕРЫ IGA-НЕФРОПАТИИ И ФОКАЛЬНО-СЕГМЕНТАРНОГО ГЛОМЕРУЛОСКЛЕРОЗА ПО ДАННЫМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

N.A. Bronovitskaya, M.M. Batyushin, I.V. Sarvilina, D.G. Pasechnik

PROTEIN MARKERS IGA-NEPHROPATHY, AND FOCAL SEGMENTAL GLOMERULOSCLEROSIS BY MASS SPECTROMETRY

1Кафедра внутренних болезней с курсом физиотерапии, 2нефрологическое отделение №2, 3Центральная научно-исследовательская лаборатория Ростовского государственного медицинского университета, "Медицинский центр «НОВОМЕДИЦИНА», г. Ростов-на-Дону, Россия

РЕФЕРАТ

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Поиск неинвазивных методов диагностики IgA-нефропатии и фокально-сегментарного гломерулосклероза (ФСГС) на основе протеомного исследования мочи. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. В исследование включен 61 пациент: первая группа - 31 больной с ФСГС, вторая группа - 30 больных с IgA-нефропатией. Всем пациентам были выполнены общеклинические методы исследования (общий анализ крови, общий анализ мочи, концентрация креатинина крови с определением скорости клубочковой фильтрации) и масс-спектрометрия мочи РЕЗУЛЬТАТЫ. Выявлены клинико-лабораторные признаки гломерулонефрита: артериальная гипертензия, азотемия, протеинурия, микро- или макрогематурия, снижение скорости клубочковой фильтрации. Определены патогенетические особенности IgA-нефропатии и ФСГС, позволившие выделить функциональные группы белков-маркеров, отражающих возможные пути возникновения и прогрессирования гломерулонефрита. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Анализ протеомного спектра мочи пациентов с IgA-нефропатией и ФСГС позволяет использовать полученные белки в качестве потенциальных маркеров возникновения и прогрессирования гломерулонефрита. Ключевые слова: хронический гломерулонефрит, протеомика, молекулярные маркеры.

ABSTRACT

THE AIM: to search noninvasive diagnostic IgA-nephropathy and focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) based at proteomic studies of urine. PATIENTS AND METHODS. The study included 61 patients, who were divided into two groups. The first group included 31 patients with FSGS and 30 patients with IgA- nephropathy. All patients underwent general clinical research methods (complete blood count, urinalysis, blood creatinine concentration with the definition of the glomerular filtration rate) and mass spectrometry of urine. RESULTS. It was identified clinical and laboratory signs of glomerulonephritis: hypertension, azotemia, proteinuria, hematuria, decreased glomerular filtration rate. It was identified pathogenetic features of IgA-nephropathy and FSGS, with highlighting the functional groups of protein markers that reflect the way the progression of glomerulonephritis. CONCLUSION. Proteomic analysis of the spectrum of urine of patients with IgA-nephropathy and FSGS allows to use the proteins as potential markers of the progression of glomerulonephritis.

Key words: chronic glomerulonephritis, proteomics, molecular markers.

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на большое количество исследований по модернизации диагностических и лечебных технологий, накопленных на протяжении последних десятилетий, диагностика и лечение хронического гломерулонефрита остается актуальной задачей современной нефрологии. Согласно регистру ERA-EDTA, хронический гломерулонефрит в 14% случаев становится причиной терминальной

Батюшин М.М. 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, д. 29. Тел.: 8-918-501-88-01, 8(863)201-44-23, E-mail: [email protected]

хронической почечной недостаточности (ТХПН) в странах Европы [1]. По данным Всемирной организации здравоохранения - из 30-35 млн лиц, ежегодно умирающих от всех хронических заболеваний, 1 млн погибают от патологии почек и мочевых путей [2]. Причем в 80% случаев, наблюдается малосимптомное начало заболевания, случайно диагностируемое в ходе исследования мочевого осадка [3].

Исследования молекулярных механизмов развития хронического гломерулонефрита связаны с

открытиями в области генома и протеома человека, изучением ультраструктурных клеточных изменений, тканевого и органного ремоделирования при хроническом гломерулонефрите, освоением новых технологий, позволяющих выявлять биомаркеры патогенеза болезни [4].

Одним из наиболее важных факторов риска развития ТХПН при нефропатиях, в частности, является тубулоинтерстициальный фиброз (ТИФ), развитие которого во многом определяет процесс ремоделирования почечной паренхимы

[5]. Для диагностики ТИФ при гломерулопатиях единственным методом является пункционная нефробиопсия с последующим гистологическим исследованием. Вместе с тем, в последние годы в нефрологии начинают применяться методы постгеномных исследований, направленные на поиск взаимосвязей между белками-маркерами и патологическими изменениями, обнаруживаемыми при гистологическом исследовании нефробиоптата

[6] . Целью этих исследований является поиск неинвазивных методов оценки состояния почечной паренхимы. Определение таких маркёров в дальнейшем позволит стать альтернативой нефро-биопсии в случае невозможности ее проведения, а также при мониторинге риска развития почечных повреждений в процессе лечения пациента [7]. В настоящее время масс-спектрометрия считается наиболее востребованным и чувствительным методом анализа органических молекул [8], который позволяет выявлять белки, участвующие в процессах воспаления, фиброза, ремоделирования, межклеточного взаимодействия. Применение масс-спектрометрии при изучении протеомного паттерна разных форм хронических гломеруло-нефритов и патологических изменений в нефро-биоптате поможет сформировать представление о маркёрах-кандидатах, определение которых в дальнейшем позволит верифицировать не только форму нефрита, но и особенности гломерулярного и тубулоинтерстициального повреждения, расширив возможности неинвазивной диагностики

[9, 10].

Цель исследования: поиск неинвазивных методов диагностики ^А-нефропатии и фокально-сегментарного гломерулосклероза (ФСГС) на основе протеомного исследования мочи.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование одномоментное, скрининговое, когортное, открытое, состояло из двух этапов. На первом этапе из числа больных с хроническим гломерулонефритом (п=85), прошедших

процедуру пункционной нефробиопсии, был отобран 31 пациент с ФСГС и 30 пациентов с ^А-нефропатией, проводился детальный сбор клинико-анамнестических данных, а также стандартное физикальное и лабораторно-инструментальное обследование. На втором этапе всем пациентам с ФСГС и ^А-нефропатией проводилась масс-спектрометрия мочи.

Критериями исключения были пациенты с хронической болезнью почек (ХБП) 5 стадии, сахарным диабетом, ишемической болезнью сердца, хронической сердечной недостаточностью (ФК 2-4). Контрольную группу составили добровольцы при отсутствии признаков соматической патологии, в том числе - изменений в анализе мочи (п=30). В контрольной группе проводилась масс-спектрометрия мочи.

В группу пациентов с хроническим гломеру-лонефритом был отобран 61 пациент: 29 мужчин (47%) и 32 женщины (53%). Средний возраст обследованных составил 34,4±0,9 года. В целом продолжительность гломерулонефрита составила 0,64±0,31 года и колебалась от 1,2 мес до 2 лет. Подробно собирали анамнез заболевания, оценивали длительность течения и клинические проявления нефрита, наличие сопутствующей патологии, проводимые диагностические исследования и особенности лечения. Оценивали следующие параметры:

а) клинические данные - наличие отечного синдрома и артериальной гипертензии (АГ);

б) показатели инструментальных методов исследования - УЗИ почек, ЭКГ;

в) показатели лабораторных методов исследования - общий анализ крови, общий анализ мочи, суточную протеинурию, биохимический анализ крови (мочевая кислота, общий белок, общий холестерин, мочевина, креатинин, калий и натрий);

г) показатели иммуноморфологического исследования на материале пункционных биоптатов почек: морфологическое исследование гистологических препаратов, которые были окрашены гематоксилином и эозином по Ван-Гизону и Шифф-реактивом и исследованы в цифровом микроскопе; ультраструктурное исследование почек с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-1000; иммуноморфо-логическое исследование почечных биоптатов с использованием меченных FITC антител кролика к ^в, М, А, С3 и фибрину на люминесцентном микроскопе <ЛаЪог1их Б»; оценка степени фиксации иммуноглобулинов и комплемента в срезах осуществлялась полуколичественным методом по

Таблица 1

Сравнение показателей лабораторных исследований у пациентов с IgA-нефропатией и ФСГС

Показатель Группа пациентов с IgA-нефропатией (n=30) Группа пациентов с ФСГС (n=31)

Общий анализ крови

Эритроциты, 1012 /л 4,19±0,7 4,17±0,7

Гемоглобин, г/л 126±7 125±8

Лейкоциты, 109/л 6,5±0,6 6,6±0,7

Скорость оседания эритроцитов, мм/ч 12±1,5 14±1,5

Биохимия крови

Креатинин, мкмоль/л 101±20 119±226

Мочевина, мммоль/л 5,18±1,3 6±1,5

Мочевая кислота, ммоль/л 233,6±7,5 280±17

СКФ, мл/мин/1,73 м2 77±17* 66±18

Моча

Протеинурия, г/л 0,8±1,1 2±2,5*

Эритроцитурия, в п/зр 24,5±28* 5±1,6

Суточная протеинурия, г/сут 1,06±1,7 3,4±2*

Примечание. * р<0,05, СКФ - скорость клубочковой фильтрации.

градации интенсивности свечения и распространения в тканях [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ

У обследованных пациентов артериальная гипертензия встречалась в группе ФСГС в 54%, а при IgA-нефропатии в 45% случаев. Результаты ла-бораторныхз исследований представлены в табл. 1. Существенных различий между группами не отмечалось, за исключением протеинурии, степень которой была достоверно выше при ФСГС.

У пациентов в группе ФСГС снижение СКФ наблюдалось на 14,3% чаще, чем у пациентов в группе с IgA-нефропатией (р<0,05).

При анализе масс-спектрограмм использовались соответствующие базы данных белков. Пример молекулярного спектра пептидных фрагментов белков мочи пациентов с ФСГС и IgA-нефропатией представлен на рис. 1 и 2. Молекулярный спектр отражает различия по показателю m/z пептидных фрагментов белков мочи в диапазоне Mr - от 800 Да до 10 кДа, которые позволили уже на этапе графической регистрации диагностических молекулярных паттернов выявить отличия в качественном составе молекул белков мочи у пациентов с ФСГС, IgA-нефропатией и здоровых лиц.

В ходе анализа встречаемости белков протеом-ного паттерна при нефротическом синдроме были установлены следующие факты. С нефротиче-ским синдромом были ассоциированы такие белки, как рецептор-переносчик потенциального ка-тионного канала, а-цепь коллагена, тропомиозин 1. Это может быть обусловлено как универсальным механизмом развития нарушения процессов

почечной фильтрации посредством усиления работы актинового комплекса в клетке, обеспечивающего транспорт везикул с активными компонентами и сокращение гладкомышечных волокон, так и нарушением процесса селективной по молекулярной массе и размерам ультрафильтрации субстанций крови на уровне почек.

Артериальная гипертензия встречалась в 64% случаев у пациентов с ФСГС и в 56% у пациентов с ^А-нефропатией. Белками-маркерами развития ТИФ при наличии артериальной гипертен-зии являлись: в2-микроглобулин, белок рецептор-переносчик потенциального катионного канала, тканевой фактор роста в (ТФР в), белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 3, МАК белок и тимозин в4.

В группе пациентов с ФСГС отмечалось более быстрое прогрессирование хронической болезни почек (ХБП). При равной продолжительности нефрита (в среднем около 6 мес) в группе пациентов с ФСГС в 19% встречалась ХБП ЗА ст., в группе с ^А-нефропатией - в 7% случаев. По мере прогрессирования хронического повреждения почек в моче появляются белки-маркеры ТИФ, определение которых может иметь диагностическое значение: при ХБП 3 ст. - аннексии АЗ, ЗБ (а-цепь фибриногена), при ХБП 4 стадии - а-цепь фибриногена, а1-антитрипсин, сосудистый белок клеточной адгезии, молекула повреждения почечной ткани-1. Раннее выявление в моче данных субстанций, обладающих профи-бротической активностью, может быть сигналом для проведение более активной нефропротектив-ной терапии.

В ходе протеомного анализа были выделены

Рис. 1. Пример масс-спектрограммы пептидных фрагментов и белков мочи у пациента Г., 52 года, с ФСГС (диапазон Мг= 4 кДа-10 кДа).

Рис. 2. Пример масс-спектрограммы пептидных фрагментов и белков мочи у пациента К., 39 лет, с 1дА-нефропатией (диапазон Мг= 800 Да-3 кДа).

Таблица 2

Протеомный спектр мочи у пациентов с IgA-нефропатией и ФСГС

№ Название белка Встречаемость белков, % Р

|дА ФСГС

1 в2-микроглобулин 53,33 80,65 <0,005

2 РППКК 10,0 58,06 <0,005

3 ТФР-р 10,0 61,29 <0,005

4 БСИФР-1 26,67 19,35 н.д.

5 Глутатион - S - трансфераза 23,33 19,35 н.д

6 Ингибитор активатора плаз-миногена 60,0 48,39 н.д

7 МАК-белок 0,00 12,90 <0,005

8 а-цепь фибриногена 46,67 45,16 н.д

9 а-цепь коллагена 51,61 23,33 <0,005

10 а1-антитрипсин 46,67 45,16 н.д

11 Цистатин В 36,67 54,84 н.д

12 БСИФР-3 43,79 41,94 н.д.

13 Тимозин р-4 0,00 32,26 <0,005

14 Тропомиозин1 10,0 32,26 <0,005

15 ЯАПК 3,33 25,81 <0,005

16 Аннексин А3 53,33 25,81 <0,005

17 в актин 1 16,67 22,58 н.д

18 МСР-1 16,67 9,68 н.д

19 Эпидермальный фактор роста 30,0 3,23 <0,005

20 Аминопептидаза Н 33,33 16,13 <0,005

21 Сосудистый белок клеточной адгезии 12,90 43,33 <0,005

22 МППТ-1 43,33 12,90 <0,005

23 ИЛ-6 46,67 0,00 <0,005

24 Гепарансульфат 2 43,33 0,00 <0,005

25 Индуктор апоптоза, идентичный ТФР-р 13,33 0,00 <0,005

26 Гепцидин 23,33 0,00 <0,005

Примечание. н.д. - различия между группами недостоверны; РППКК - рецептор-переносчик потенциального катионного канала; БСИФР - белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста; ЯАПК - ядерный антиген пролиферации клеток; МСР-1 - моноцитарный хемотаксический фактор-1; МППТ-1 - молекула-1 повреждения почечной ткани; ИЛ-6 - интерлейкин 6.

функциональные группы белков, составивших молекулярные профили мочи у пациентов с ^А-нефропатией и ФСГС, которые отражают универсальные пути ее возникновения и прогресси-рования: белки, регулирующие тонус сосудов почек и активность свертывающей и противосвер-тывающей систем крови; участники систем де-токсикации; сократительные белки нефротелия, эндотелия почечных сосудов; белки-участники метаболизма в нефроцитах; белки, регулирующие клеточный рост, реакции протеолиза в клетке, процессинг нейрогормональных факторов, процессы ангиогенеза и адгезии клеток; структурные белки почечной ткани; белки, регулирующие активность ядра клетки; белки-участники

иммуновоспалительных процессов и тубулоин-терстициального повреждения почечной ткани; транспортные белки.

Нами обнаружены различия в протеомном профиле мочи у пациентов с ФСГС и IgA-нефропатией, что позволило выделить белковый спектр мочи, характерный для определенной группы нефрита (табл. 2).

Необходимо отметить, что молекулы пептидов и белков, экспрессия которых была обнаружена в моче у пациентов с ФСГС и ^А-нефропатией, не регистрировались в протеомном профиле мочи у здоровых лиц.

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании были обнаружены белки, которые, с учетом их молекулярных связей, удалось классифицировать на функциональные группы:

• белки, регулирующие тонус сосудов;

• белки, регулирующие активность свертывающей и противосвертывающей систем крови;

• белки, регулирующие СРО-АОС на уровне почечной ткани,

• белки-участники систем детоксикации и элиминации;

• сократительные белки нефротелия и эндотелия почечных сосудов;

• белки-участники метаболизма в нефроцитах;

• регуляторные белки, контролирующие клеточный рост; активность реакций протеолиза; про-цессинг нейрогормональных факторов; процессы ангиогенеза и адгезии клеток;

• структурные белки почечной ткани;

• белки-транскрипционные факторы, регулирующие активность ядра клетки;

• белки-участники иммуновоспалительных процессов;

• транспортные белки.

В настоящее время обсуждается возможная патогенетическая роль молекул, ответственных за нарушение сосудистой проницаемости и «по-доцитоз» при ФСГС и ^А-нефропатии [11]. При идентификации белковых молекул в моче у пациентов с ^А-нефропатией выявлены а-цепь коллагена, МСР-1, эпидермальный фактор роста, молекула повреждения почечной ткани-1, интер-лейкин-6, гепарансульфат 2, индуктор апоптоза, идентичный ТФР-Ь, гепцидин, аминопептидаза Н, аннексин А3. Некоторые из выявленных белков были ранее описаны при гломерулонефритах. Так, МСР-1 был впервые идентифицирован как продукт секреции моноцитарных лейкемических клеток, стимулированных липополисахаридом, а

также мононуклеарных клеток периферической крови [12]. У пациентов с ^А-нефропатией уровень МСР-1 с мочой коррелирует с выраженностью мезангиальной пролиферации, количеством полулуний и макрофагов в клубочках, степенью интерстициального повреждения (инфильтрацией CD68+-макрофагами, тубулярной атрофией, ин-терстициальным фиброзом) [13]. Эпидермальный фактор роста, молекула повреждения почечной ткани-1, интерлейкин-6, гепарансульфат 2, индуктор апоптоза, идентичный ТФР-Ь, обладающие протеолитической и сигнальной активностью, в основном изучались при диабетической не-фропатии [14]. Нами было отмечено, что а-цепь коллагена, гепарансульфат 2 при ^А-нефропатии также ассоциированы с процессами фиброза ин-терстиция.

В группе пациентов с ФСГС с высокой вероятностью выявляются такие белки, как рецептор-переносчик потенциального катионного канала, МАК-белок, цистатин В, тимозин-в4, тропомио-зин-1, ядерный антиген пролиферирующих клеток, сосудистый белок клеточной адгезии, ТФР в. Цистатин В является новым потенциальным маркером активности склеротических процессов в почечной ткани при гломерулонефрите, наиболее выраженных при ФСГС. Увеличение синтеза цистатина В сопровождается увеличением экспрессии цистатина С, который секретируется в клетках проксимальных канальцев нефрона и определяет интенсивность скорости клубочковой фильтрации [15]. Нарушение функционирования катионного канала подсемейства С при гломерулонефрите сопровождается прекращением работы и внутриклеточного контроля со стороны вторичной системы мессенджеров, связанной с фосфатидил-инозитолом, который взаимодействует с подоцином в подоцитах, нарушая процесс селективной по молекулярной массе и размерам ультрафильтрации крови [16].

В нашем исследовании высокая экспрессия рецептора-переносчика потенциального кати-онного канала свидетельствовала, вероятно, о прогрессировании процессов склероза в гломеру-лярном аппарате почек. Увеличение экспрессии тропомиозина 1 в моче, выявленное нами в первую очередь при ФСГС, может свидетельствовать об усилении работы актинового комплекса в клетке, обеспечивающего транспорт везикул с активными компонентами и сокращение гладкомышечных волокон [17]. ТФР-в секретируется многими типами клеток, включающих макрофаги, на поверхности которых обнаруживается латентный комплекс ТФР-в. Посредством связывания через CD36 с

лигандом тромбоспондином-1 воспалительные стимулы активируют макрофаги, увеличивают высвобождение активного ТФР-в, что стимулирует образование плазмина [18]. В нашем исследовании выявлена высокая экспрессия данного белка наиболее характерна для ФСГС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявленная нами экспрессия белков в моче при ФСГС и IgA-нефропатии позволила сформировать молекулярный «портрет» этих гистохимических типов гломерулонефрита. Обнаруженные нами молекулярные паттерны мочи при ФСГС и IgA-нефропатии могут быть использованы в процессе дифференциальной диагностики данных типов гломерулонефрита. Каждая молекула белка в функциональной группе взаимодействует с множеством других молекул белков, реализуя межмолекулярные взаимодействия. В перспективе целесообразным является изучение биологической активности и функциональной роли каждой молекулы в межмолекулярных взаимодействиях (интерактомика) при развитии поражения ткани почек у пациентов с различными морфологическими формами не-фропатий.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease, 2012

2. Батюшин ММ, Повилайтите ПЕ. Клиническая нефрология 2009; 682

3. Галишон П, Гертиг А. Эпителиально-мезенхимальная трансформация как биомаркер почечного фиброза: готовы ли мы применить теоретические знания на практике? Нефрология 2013; (4): 9-16

4. Мухин НА, Тареева ИЕ, Шилов ЕМ, Козловская ЛВ. Диагностика и лечение болезней почек 2011; 383

5. Kassianos AJ, Wang X, Sampangi S, Muczynski K et al. Increased tubulointerstitial recruitment of human CD141(hi) CLEC9A(+) andCD1c(+) myeloiddendritic cell subsetsin renal fibrosis and chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol 2013; 1391-1401

6. Yang J, Lin SC, Chen G et al. Adiponectin promotes monocyte-to-fibroblast transition in renal fibrosis. J Am Soc Nephrol 2013; 23-32

7. Norman JT, Fine LG. Intrarenal oxygenation in chronic renal failure. Clin Exp Pharmacol Physiol 2013; 989-996

8. Писарев ДИ. Масс-спектрометрия: история и перспективы использования. Молодой ученый 2012; (10): 99-104

9. Небыльцова ОВ, Климова ЖА, Носенко ГА. Лабораторный справочник СИНЭВО 2011; 420

10. Bowling CB, Muntner P. Epidemiology of Chronic Kidney Disease. Among Older Adults: A Focus on the Oldest Old. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2012; 72-87

11. Donderski R, Szczepanek J, Domagalski K et al. Analysis of Relative Expression Level of VEGF, HIF-1a and CTGF Genes in Chronic GlomerulonephritisPatients. Kidney Blood Press Res 2013; 22-38

12. Baggioli M, Dewald B, Moser B. Interleukin-8 and related chemotactic cytokines-CXC and CC chemokines. Adv Immunol 1994; (55): 97-179

13. Wada T, Furuichi K, Segawa C et al. MIP-1a and MCP-1

contribute crescents and interstitial lesions in human crescentic glomerulonephritis. Kidney Int 1999; (56): 995-1003

14. Лебедева НО, Викулова ОК. Маркеры доклинической диагностики диабетической нефропатии у пациентов с сахарным диабетом 1 типа. Сахарный диабет 2012; (2):38-45

15. Jarvinen M, Rinne A, Hopsu-Havu VK. Human cystatins in normal and diseased tissues - a review. Acta Histochem 2008; 5-18

16. Islam MS. Transient Receptor Potential Channels. Advances in Experimental Medicine and Biology 2011;700

17. Zare M, Jazii F, Soheili Z, Moghanibashi M. Downregula-

tion of tropomyosin-1 in squamous cell carcinoma of esophagus, the role of Ras signaling and methylation. Mol Carcinog 2012; (10): 796-806

18. Taylor AW. Review of the activation of TGF-beta in immunity. Leukoc Biol 2009; 29-33

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Поступила в редакцию: 17.04.2014 г.

Принята в печать: 26.06.2014 г.