Научная статья на тему 'Белки человека SLURP-1 и SLuRP-2, действующие на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, замедляют пролиферацию клеток колоректальной аденокарциномы HT-29'

Белки человека SLURP-1 и SLuRP-2, действующие на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, замедляют пролиферацию клеток колоректальной аденокарциномы HT-29 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
315
79
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Acta Naturae (русскоязычная версия)
WOS
Scopus
ВАК
RSCI
PubMed
Ключевые слова
БАКТЕРИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ / НИКОТИНОВЫЙ АЦЕТИЛХОЛИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР / РЕНАТУРАЦИЯ / РАК КИШЕЧНИКА / LYNX

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Люкманова Е. Н., Шулепко М. А., Бычков М. Л., Шенкарев З. О., Парамонов А. С.

Белки человека SLURP-1 и SLURP-2, принадлежащие семейству Ly-6/uPAR, секретируются различными клетками, включая эпителиальные и иммунные. Эти белки действуют как ауто/паракринные гормоны, регулирующие рост и дифференцировку кератиноцитов, а также участвуют в контроле воспалительных процессов и злокачественной трансформации клеток. Предполагаемой мишенью SLURP-1 и SLURP-2 являются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) типа α7 и α3β2 соответственно. Детальные молекулярные механизмы, лежащие в основе действия SLURP-1 и SLURP-2, остаются в настоящее время не охарактеризованными. SLURP-2 один из наименее изученных белков семейства Ly-6/uPAR. В представленной работе разработаны система продукции SLURP-2 в клетках Escherichia coli и протокол ренатурации белка из цитоплазматических телец включения. Получены миллиграммовые количества рекомбинантного SLURP-2 и его 13С-15N-меченого аналога. Рекомбинантный белок охарактеризован методом ЯМР-спектроскопии, построена модель пространственной структуры SLURP-2. На клетках колоректальной аденокарциномы человека НТ-29, экспрессирующих нАХР только типа α7, проведено сравнительное исследование действия рекомбинантных белков SLURP-1 и SLURP-2. Показано, что SLURP-1 и SLURP-2 оказывают антипролиферативный эффект, вызывая значительное снижение популяции клеток в течение 48 ч, при этом методами флуоресцентной микроскопии не выявлено ни апоптотической, ни некротической гибели клеток. Полуэффективные концентрации (ЕС50) составили ~ 0.1 и 0.2 нМ для SLURP-1 и SLURP-2 соответственно. Максимальный эффект (~ 54 и 63% живых клеток относительно контроля) наблюдали при концентрации SLURP-1 и SLURP-2, равной 1 мкМ. Полученные данные указывают на нАХР типа α7 как на главный рецептор, ответственный за антипролиферативный эффект белков SLURP в эпителиальных клетках человека.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Люкманова Е. Н., Шулепко М. А., Бычков М. Л., Шенкарев З. О., Парамонов А. С.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Белки человека SLURP-1 и SLuRP-2, действующие на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, замедляют пролиферацию клеток колоректальной аденокарциномы HT-29»

УДК 577.112.6

Белки человека SLURP-1 и SLURP-2, действующие на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, замедляют пролиферацию клеток колоректальной аденокарциномы HT-29

Е. Н. Люкманова12*, М. А. Шулепко12, М. Л. Бычков1,2, З. О. Шенкарев1,2, А. С. Парамонов1,2, А. О. Чугунов12, A. С. Арсеньев1,3, Д. А. Долгих1,2, М. П. Кирпичников1,2 1Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы

3Московский физико-технический институт (Государственный университет), 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9 *E-mail: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru Поступила в редакцию 31.10.2014

реферат Белки человека SLURP-1 и SLURP-2, принадлежащие семейству Ly-6/uPAR, секретируются различными клетками, включая эпителиальные и иммунные. Эти белки действуют как ауто/паракринные гормоны, регулирующие рост и дифференцировку кератиноцитов, а также участвуют в контроле воспалительных процессов и злокачественной трансформации клеток. Предполагаемой мишенью SLURP-1 и SLURP-2 являются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) типа а7 и a3ß2 соответственно. Детальные молекулярные механизмы, лежащие в основе действия SLURP-1 и SLURP-2, остаются в настоящее время не охарактеризованными. SLURP-2 - один из наименее изученных белков семейства Ly-6/uPAR. В представленной работе разработаны система продукции SLURP-2 в клетках Escherichia coli и протокол ренатурации белка из цитоплазматических телец включения. Получены миллиграммовые количества ре-комбинантного SLURP-2 и его 13С-15^меченого аналога. Рекомбинантный белок охарактеризован методом ЯМР-спектроскопии, построена модель пространственной структуры SLURP-2. На клетках колоректальной аденокарциномы человека НТ-29, экспрессирующих нАХР только типа а7, проведено сравнительное исследование действия рекомбинантных белков SLURP-1 и SLURP-2. Показано, что SLURP-1 и SLURP-2 оказывают антипролиферативный эффект, вызывая значительное снижение популяции клеток в течение 48 ч, при этом методами флуоресцентной микроскопии не выявлено ни апоптотической, ни некротической гибели клеток. Полуэффективные концентрации (ЕС50) составили ~ 0.1 и 0.2 нМ для SLURP-1 и SLURP-2 соответственно. Максимальный эффект (~ 54 и 63% живых клеток относительно контроля) наблюдали при концентрации SLURP-1 и SLURP-2, равной 1 мкМ. Полученные данные указывают на нАХР типа а7 как на главный рецептор, ответственный за антипролиферативный эффект белков SLURP в эпителиальных клетках человека.

ключевые слова бактериальная экспрессия, никотиновый ацетилхолиновый рецептор, ренатурация, рак кишечника, Lynx.

сокращения вд-Lynxl - водорастворимый домен Lynxl человека; нАХР - никотиновый ацетилхолиновый рецептор.

введение

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) -лигандозависимый ионный канал, обнаруженный как в центральной и периферической нервной системе, так и во многих других тканях человека, в том

числе эпителии [1, 2]. Несколько лет назад у высших животных были обнаружены белки, принадлежащие семейству Ly-6/uPAR и модулирующие действие нАХР ^упх1, Lynx2, Lypd6, SLURP-1, SLURP-2) [3-7]. Консервативное расположение

остатков Cys (рис. 1), образующих дисульфидные связи, указывает на гомологию пространственной структуры белков Lynx и SLURP с трехпетельной структурой а-нейротоксинов из яда змей, высокоэффективных и специфичных ингибиторов нАХР [8].

Секретируемые белки SLURP-1 и SLURP-2 обнаружены во многих тканях человека, включая эпителий и клетки иммунной и нервной системы [5, 6, 9, 10]. Белки SLURP влияют на рост, миграцию и дифференцировку клеток эпителия, а также участвуют в контроле воспаления и опухолевого роста [6, 11, 12]. На линии кератиноцитов HetlA показано, что SLURP-1 обладает антипролиферативной активностью и способствует апоптотической гибели клеток [11], в то же время SLURP-2 ускоряет рост кератиноцитов, замедляя их дифференцировку и ослабляя ответ на проапоптотические сигналы [6]. Кроме того, белки SLURP регулируют заживление ран на коже и слизистых оболочках [13] и принимают участие в защите клеток кожи от онкогенной трансформации, вызванной нитрозаминами - производными никотина [14, 15]. Вероятно, SLURP-1 и SLURP-2 играют роль ауто/паракринных регуляторов, а их эффекты опосредованы взаимодействием с нАХР, представленными на поверхности клеточной мембраны кератиноцитов и иммунных клеток [10, 16]. Предполагаемой мишенью действия SLURP-1 и SLURP-2 являются нАХР типа а7 и а3Р2 соответственно [6, 11]. Недавно в клетках колоректальной аденокарциномы человека НТ-29 обнаружили экспрессию SLURP-1 и показали, что уровень эндогенной продукции SLURP-1 в этих клетках значительно снижается при обработке никотином [17]. В то же время клетки НТ-29 могут экспрессировать только рецепторы нАХР типа а7 [18].

В настоящее время структурно-функциональные свойства белков человека SLURP-1 и SLURP-2, а также механизм их действия изучены недостаточно. Основные проблемы в изучении SLURP-1 и SLURP-2 связаны с невозможностью получить достаточное количество препаратов белков из природных источников, а также со сложностью продукции рекомбинантных белков с нативной последовательностью и пространственной структурой. Вследствие этого, большая часть опубликованных ранее результатов получена с использованием гибридных конструкций, кодирующих не только белок SLURP, но и дополнительные полипептиды, которые могут значительно влиять на активность препарата. Например, SLURP-2 изучали с использованием слитой с белком SUMO конструкции (общая масса белка 22 кДа, из которых только ~ 8 кДа приходится на SLURP-2) [6].

В представленной работе впервые разработана эффективная система продукции белка SLURP-2 в клетках E. coli в виде цитоплазматических телец включения и предложен протокол его ренатура-ции. Полученный рекомбинантный аналог отличается от природного белка одним дополнительным остатком (N-концевой Met). Высокий выход (~ 5 мг ренатурированного белка c 1 л бактериальной культуры) позволил получить миллиграммовые количества рекомбинантного белка и его 13С-15П-меченого варианта. Разработка подобной системы открывает новые перспективы в структурно-функциональных исследованиях SLURP-2. Так, нами показан значительный антипролиферативный эффект SLURP-1 и SLURP-2 на клетки линии НТ-29. Это позволяет предположить, что главную роль в передаче сигналов к замедлению роста эпителиальных клеток под действием белков SLURP играет нАХР типа а7.

экспериментальная часть

Клонирование и бактериальная продукция SLURP-2

Ген slurp-2, кодирующий 75 аминокислотных остатков белка SLURP-2 человека (рис. 1А), был сконструирован из синтетических перекрывающихся олигонуклеотидов с использованием ПЦР и с учетом частоты встречаемости кодонов в Escherichia coli (ЗАО «Евроген», Москва). Ген slurp-2 был клонирован в экспрессионный вектор pET-22b(+) (Novagen) по сайтам рестрикции NdeI и BamHI. Клетки E. coli штамма BL21(DE3), трансформированные вектором pET-22b(+)/slurp-2 культивировали при 37°С на среде ТВ (12 г бактотриптона, 24 г дрожжевого экстракта, 4 мл глицерина, 2.3 г KH2PO4, 12.5 г K2HPO4 на 1 л среды, рН 7.4) в ферментере Bioflow 3000 (New Brunswick Scientific) в условиях автоматического поддержания относительного содержания кислорода в системе не менее 30% от максимально достижимого. Экспрессию гена slurp-2 индуцировали добавлением изопропил^-0-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 0.05 мМ при оптической плотности клеточной культуры 1.0 о.е. После индукции клетки культивировали в течение 8 ч.

Для продукции 13С-15П-меченого аналога SLURP-2 1 л клеточной культуры, предварительно выращенной на среде ТВ в колбах до клеточной плотности 1.0 о.е., центрифугировали в течение 20 мин при 1000 д. Клеточный осадок стерильно ресуспен-дировали в 1 л минимальной среды М9 (6 г Na2HPO4, 3 г KH2PO4, 0.5 г NaCl, 2 г NH4Cl, 240 мг безводного MgSO4, 11 мг CaCl2, 3 г глюкозы, 2 мг дрожжевого экстракта, 200 мкл 5%-ного тиаминхлорида на 1 л среды, рН 7.4), содержащей в качестве источников глюкозы

и азота 13С-глюкозу и 15N-NH4Cl (CIL) соответственно. Индукцию и дальнейшее выращивание проводили так же, как на среде ТВ.

Очистка и ренатурация рекомбинантного SLURP-2

Тельца включения, содержащие SLURP-2, выделяли и отмывали согласно протоколам, описанным ранее для SLURP-1 [19]. Отмытые тельца включения ресуспендировали в 30 мМ Трис-НС1-буфере, pH 8.7, содержащем 8 М мочевины, 0.4 М сульфита натрия, 0.15 М тетратионата натрия из расчета 10 мл буфера на 1 г телец включения. Суспензию дезинтегрировали ультразвуком (Branson Digital Sonifier) при выходной мощности 50 Вт и 4°C в течение 1 мин и оставляли на 8 ч при слабом перемешивании. Затем суспензию центрифугировали при 36000 g и 4°C в течение 30 мин, супернатант разводили в 10 раз 2 М мочевиной. После этого препарат сульфитированного SLuRP-2 наносили на колонку с DEAP-сферонит-ОН (совместная разработка ГНИИ ОЧБ, Санкт-Петербург и ИБХ РАН), предварительно уравновешенную буфером А (30 мМ Трис-HCl, pH 8.0). После нанесения белка колонку последовательно промывали буфером А, буфером А с добавлением 1 М Nacl, буфером А с добавлением 8 М мочевины. Сульфитированный SLuRP-2 элюировали буфером А с добавлением 8 М мочевины и 0.5 М Nacl. Во фракции, содержащие SLuRP-2, добавляли 1000-кратный (по отношению к белку) молярный избыток ДТТ. Восстановленный SLURP-2 очищали с помощью ВЭЖХ (Jupiter С4, A300, 10 х 250 мм, Phenomenex). SLURP-2 элюировали градиентом ацетонитрила (20-45%) в течение 40 мин в присутствии 0.1% ТФУ. Препарат восстановленного SLuRP-2 лиофилизовали и растворяли в буфере для ренатурации, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 9.0, 2 М мочевину, 0.5 M L-аргинин, 2 мМ GSH и 2 мМ GSSG, до конечной концентрации белка 0.1 мг/мл. Ренатурацию проводили при 4°C в течение 3 сут. Анализ и очистку SLuRP-2 после рена-турации проводили с помощью ВЭЖХ (Jupiter С4, А300, 4.6 х 250 мм, Phenomenex). Ренатурированный препарат SLuRP-2 лиофилизовали.

ЯМР-спектроскопия и моделирование структуры SLURP-2

ЯМР-спектры 13С-15П-меченого и немеченого SLuRP-2 (концентрация образцов 0.5 мМ) получали при температуре 30оС на спектрометре AVANCE-700 (Bruker).

Для моделирования структуры SLuRP-2 в качестве шаблона использовали белок вд-Lynx! (PDB 2L03). Выравнивание аминокислотных последовательностей было построено на веб-сервере Clustal

(www.clustal.org). Модель построена при помощи программы Modeller V8.2 [20].

Работа с клеточной линией НТ-29

Клетки колоректальной аденокарциномы НТ-29 (НИИ Цитологии РАН, Санкт-Петербург) поддерживали в среде RPMI1640 (ООО «ПанЭко», Москва) с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone, Thermo Fisher Scientific). Клетки поддерживали в гумидифицированной атмосфере (37°С, 5% СО2) и пересевали каждые 48 ч.

За 16 ч до эксперимента клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты из расчета 104 клеток на лунку. После адсорбции к клеткам добавляли препараты SLURP-1 и SLURP-2 (реком-бинантный препарат SLURP-1 получен согласно протоколу, описанному в [19]). Все препараты разводили в культуральной среде. Клетки инкубировали с препаратами SLURP-1 и SLURP-2 в течение 48 ч. Пролиферацию клеток изучали с помощью реагента WST-1 (water soluble tetrazolium salt 1, Santa Cruz). WST-1 растворяли в 20 мМ HEPES (pH 7.4), реактив для транспорта электронов 1-m PMS (1-me-thoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate, Santa cruz) растворяли в деионизованной воде, после чего растворы смешивали и добавляли в лунки планшета из расчета 0.5 мМ WST-1 и 20 мкМ 1-m PMS на лунку. После инкубации в течение 3 ч с WST-1 жизнеспособность клеток оценивали спектрофото-метрически по поглощению при 450 нм с выравниванием фона при 655 нм (спектрофотометр BioRad 680, BioRad Laboratories).

Флуоресцентная микроскопия

Морфологию ядер опухолевых клеток изучали с использованием красителя Hoechst 33342 (Sigma). Некротическую гибель клеток определяли, окрашивая клетки йодидом пропидия (Sigma). Клетки обрабатывали так же, как и при исследовании пролиферации, но по истечении времени инкубации с препаратами SLURP-1 и SLURP-2 к клеткам добавляли 1 мкМ красителя Hoechst 33342 и 0.5 мкМ йодида пропидия, после чего анализировали ядра с помощью микроскопа Nikon Eclipse TS100-f (Nikon Corp.) с использованием x40 объектива.

результаты и обсуждение

Бактериальная продукция и ренатурация SLURP-2

Ранее на примере «слабого» токсина WTX из яда кобры Naja kaouthia [21], водорастворимого домена белка человека Lynx1 (вд-Lynx!), модулирующего работу нАХР [22], и белка человека SLURP-1 [19] было

А

SLURP-2 75

SLURP-1 Б1

вд-Lynxl 73

WTX 65

Нейротоксин II 61

а-кобратоксин 71

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1 ' ' 10 ' 20 ' 30 40 ' 5о' 60 ' '"^70 ' ГОМОЛОГИЯ

IwfHQETG—FG- GC S HGSRßLRD S THCVTTATRVLSNT — Е D L PLVTKMÖH IG§PDIPSLGLGPYVS -1 AgSÖQT SIJgKHD

LKC Y TCKE PM1SASCRTITRCKPED ТАЁИТТЬУТУЕАЕ Y P FUQS PWTRS Ё S S S CVATD PDS IG - ДАНЬ I PCCFRDLCN SEL 23%

LDJjHVgAY—NGTjNCFN PMRC PAMVAYgMTTRT Y YT---PT—RMKVSKSOVPRCFETVYD G YSKHAS T TSCCQY DLCHG 32%

LTCLNCPT.MF----CGK FOICRNG Г КIС FKKL HORR---P--LSWRYIRGCAVTCPV------GKPY-MI^CCST Г-КСМК 28%

L-CHHOOSSO----PPTTK1G-SG~TNCYKKWWSCH------RGTIIKRGC—GCPK------VKPGVNLNjggTDRßNN 16%

IRgF---ITP----DIT BKPfcPMGH - VC YTKTWCT AFC — SIRGKRVD LGCAAT С PT------VKTGTOIOCCST DNCN PF PTRKRP 21%

петля I '-' петля II петля III

SLURP-2

SLURP-1

вд-Lynxl

петля I

петля III

петля II

Б

Рис. 1. Сравнение структур трехпетельных белков семейства Ly-6/uPAR. А — сравнение аминокислотных последовательностей SLURP-1, SLURP-2, вд-Lynxl человека, нейротоксина WTX из Naja kaouthia, нейротоксина II из N. oxiana и а-кобратоксина из N. kaouthia. Заряженные остатки и остатки Cys выделены цветом, дисульфидные связи показаны скобками. Фрагменты белков, образующие ß-тяжи, подчеркнуты. Гомология аминокислотной последовательности между SLURP-2 и другими трехпетельными белками рассчитана в программе CLUSTAL W2. Б - сравнение модели структуры SLURP-2 c пространственной структурой SLURP-1 (Шенкарев и др. в печати, PDB 2MUO) и вд-Lynxl ([23] PDB 2L03)

показано, что оптимальным способом получения ре-комбинантных трехпетельных белков, содержащих пятую дисульфидную связь в первой петле (рис. 1А), является продукция в виде цитоплазматических телец включения с последующей ренатурацией. Рекомбинантный белок SLURP-2 также получили с применением этого подхода. Выход белка SLURP-2 с восстановленными дисульфидными связями составил около 40 и 15 мг на 1 л бактериальной культуры на «богатой» (ТВ) и минимальной (М9) средах соответственно. Однако протоколы ренатурации, разработанные ранее для других трехпетельных белков [19, 21, 22], оказались малоэффективными для ренатурации SLURP-2.

С целью оптимизации условий ренатурации SLURP-2 были опробованы различные концентрации восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона (4 : 1 мМ, 4 : 2 мМ, 2 : 2 мМ, 3 : 0.3 мМ) и значения рН (7.0-9.0) ренатурирующего буфера (рис. 2А,Б). При оптимальных условиях (см.

«Экспериментальную часть») выход ренатуриро-ванного SLURP-2 и его 13С-15П-меченого аналога составил 4.6 и 3 мг с 1 л бактериальной культуры соответственно. Гомогенность препарата ренатури-рованного SLURP-2 была подтверждена с помощью электрофореза в ПААГ (рис. 2В), ВЭЖХ (рис. 2А) и масс-спектрометрии (рис. 2Г). Молекулярная масса рекомбинантного белка составила (8146 Да), что с учетом ошибки эксперимента соответствует теоретически рассчитанной массе SLURP-2 (8145 Да) с пятью замкнутыми дисульфидными связями и дополнительным П-концевым остатком метиони-на. Формирование дисульфидных связей также подтверждено с помощью реактива Элмана.

ЯМР-спектры и моделирование структуры SLURP-2

Анализ корреляционного 2D :Н-15П-ЯМР-спектра рекомбинантного SLURP-2 (рис. 3А) подтвердил гомогенность и чистоту полученного препарата.

о

00

<и ?

о с

о

л

1

Время элюции, мин

<и л_!

рН 8.0 ] (3 л___ <и

РН7 0^_ | 1 ^^ М

2 мМ ; 2 мМ

4мМ : 2 мМ

4 мМ : 1 мМ _

3 мМ : 0.3 мМ

30 40 Время элюции, мин

116 0

4000"

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

66 X

45 ь, т с 30®"

35 о н

в

25 си н 2000-

е

18 т н

14 X 1000-

а 0-

кДа -I 2

8146

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 m/z

Рис. 2. Анализ рекомбинантного препарата SLURP-2. А, Б - эффективность ренатурации SLURP-2 зависит от значения рН ренатурирующего буфера (А) и концентраций восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глу-татиона (Б). Звездочкой обозначен пик, соответствующий очищенному препарату ренатурированного SLURP-2. В — электрофоретический анализ SLURP-2, полученного из телец включения, после ренатурации и очистки с помощью ВЭЖХ. Г - масс-спектрометрический анализ ренатурированного SLURP-2

Б

В

Рис. 3. Анализ рекомбинантного препарата SLURP-2 методом ЯМР-спектроскопии. А - 2D 1H-15N-HSQC-спектр 0.5 мМ 13С-15^-меченого SLURP-2 (з0оС, рН 5.0). Б - фрагменты Ю 1Н-спектров немеченого SLURP-2 при рН 5.0 и 3.2

Значительная дисперсия :Нп-сигналов основной цепи (от 7 до 9.7 м.д.) указала на наличие Р-структурных регионов в белке. В ЯМР-спектрах наблюдался один набор сигналов, что свидетельствует об отсутствии конформационной гетерогенности, обусловленной цис-транс-изомеризацией пептидных связей Ххх-Рго. Этим белок SLURP-2 схож с вд-Lynx1, имеющим одну структурную форму в растворе [23], и отличается от SLURP-1, который в растворе находится в виде двух равно заселенных структурных форм, возникающих из-за «медленной» (по шкале ЯМР)

изомеризации пептидной связи Туг39-Рго40 [19]. В этой связи следует отметить, что, согласно анализу аминокислотной последовательности, SLURP-2 имеет большую гомологию с вд^упх1, чем с белком SLURP-1 (32 и 29% соответственно, рис. 1А). Интересно, что белки Lynx1 и SLURP-2 человека являются продуктами альтернативного сплайсинга одного гена, находящегося на хромосоме 8.

На схожесть структуры SLURP-2 и вд^упх1 указывает также присутствие в спектре ЯМР характерного :Нп-сигнала, смещенного в слабое поле

Рис. 4. Влияние препаратов SLURP-1 и SLURP-2 на морфологию ядер клеток колоректальной аденокарциномы НТ-29. А - клетки без добавления белков SLURP. Б, В - клетки в присутствии 1 мкМ SLURP-1 и 1 мкМ SLURP-2 соответственно после инкубации в течение 48 ч. Ядра клеток прокрашены красителями Hoechst 33342 и йодидом пропидия. Масштаб линейки 10 мкм

(11.6 м.д.) (обведен кружком, рис. 3А). Согласно опубликованной пространственной структуре вд^упх1 [23], значительное смещение сигнала НП-группы остатка Asn15 в слабое поле вызвано образованием водородной связи с боковой цепью His4. В структуре SLURP-2 подобная водородная связь может быть образована боковой цепью His4 и НП-группой основной цепи His14. При изменении значения рН препарата SLURP-2 от 5 до 3 значительно уменьшалась интенсивность сигналов в слабопольном регионе (8.7-9.7 м.д.) :Н-спектра ЯМР с одновременным увеличением интенсивности сигналов в районе 8 м.д. (рис. 3Б). Это свидетельствовало о частичном разрушении пространственной структуры белка, сопровождаемом переходами отдельных фрагментов из Р-структурной конформации в конформацию неупорядоченного клубка. Схожую рН-индуцированную денатурацию ранее наблюдали для вд^упх1, но не SLURP-1 (Шенкарев и др., неопубликованные данные).

Учитывая эти косвенные признаки сходства пространственной структуры, на основе известной структуры белка вд^упх1 была построена модель SLURP-2 (рис. 1Б). Эта модель демонстрирует характерную трехпетельную организацию и Р-структурное ядро, образованное пятью тяжами, формирующими два антипараллельных Р-листа.

Исследование активности препаратов SLURP-1 и SLURP-2 на клеточной линии НТ-29

Инкубация клеток колоректальной аденокарциномы НТ-29 с препаратами SLURP-1 и SLURP-2 в концентрации 1 мкМ в течение 48 ч приводила к значи-

тельному уменьшению количества клеток - до 54 ± 2% и 63 ± 2% относительно контроля соответственно. Анализ морфологии ядер клеток с помощью флуоресцентной микроскопии показал, что ни SLURP-1, ни SLURP-2 не вызывали апоптотической или некротической гибели клеток НТ-29 (рис. 4). Так, уменьшение плотности клеток не сопровождалось изменением морфологии большинства клеточных ядер по сравнению с контролем, а окрашивание йодидом пропидия не выявило увеличения фракции некротизированных клеток (3 ± 1% в контроле и в лунках, содержащих 1 мкМ SLURP-1 и SLURP-2). Таким образом, наблюдаемые эффекты SLURP-1 и SLURP-2 связаны с замедлением пролиферации клеток НТ-29.

Сравнительный анализ с помощью теста WSТ-1 выявил, что SLURP-1 и SLURP-2 значительно ин-гибируют рост опухолевых клеток НТ-29. Анализ кривой доза-эффект показал, что ингибирующий эффект SLURP-1 и SLURP-2 зависит от концентрации белков (рис. 5). Полуэффективная концентрация (ЕС50) для SLURP-1 составила ~ 0.1 нМ и ~ 0.2 нМ для SLURP-2. Максимальный ингибирующий эффект достигался при концентрации белков, равной примерно 1 мкМ (рис. 5).

Показано, что клетки НТ-29 содержат мРНК, кодирующие только а4-, а5-, а7- и Р1-субъединицы нАХР [18]. Так как из этого набора только а7-субъединицы способны образовывать функциональные рецепторы [1], предположили, что а7 - единственный рецептор семейства нАХР, представленный в клетках НТ-29 [18]. Вероятно, именно этот рецептор участвует в регуляции высвобождения

10090Ч 80

s¿ О н

Ш Ц

.0

СП

X

О Ц

и

X

т

ш о

X .0 с ш

н X

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

и о

X

SLURP-1, .q. SLURP-2

706050-

40-1-г-

-12 -11 -10 -9

-lg[SLURP, M]

Рис. 5. Влияние препаратов SLURP-1 и SLURP-2 на пролиферацию клеток колоректальной аденокарциномы НТ-29 по данным WST-1-теста. Приведены данные трех независимых экспериментов. Полученные данные (число живых клеток в % от контроля) аппроксимированы уравнением Хилла (у = А1 + (100% - А1)/(1 + ([SLURP]/EC50)nH). Рассчитанные параметры ЕС50, пН и А1 составили 0.11 ± 0.05 нМ, 0.4 ± 0.1 и 54 ± 2% для SLURP-1 и 0.19 ± 0.07 нМ, 0.5 ± 0.1 и 63 ± 2% для SLURP-2

интерлейкина-8 клетками НТ-29 под воздействием никотина [18]. Основываясь на этих данных, мы можем предположить, что мишенью белков SLURP-1 и SLURP-2 в клетках НТ-29 является нАХР а7-типа.

Ранее в экспериментах по конкуренции с 3Н-никотином и 3Н-эпибатидином на кератиноцитах линии НеИА, которые, в отличие от НТ-29, экспрес-сируют нАХР различных типов [24], было выдвинуто предположение, что мишенью SLURP-1 является а7-нАХР, а SLURP-2 действует преимущественно на а3Р2-нАХР [6, 11]. При этом SLURP-1 замедлял пролиферацию кератиноцитов [11], а SLURP-2 ее усиливал [6]. Таким образом, можно предположить,

что ингибирующий эффект SLURP-1 и SLURP-2, наблюдаемый на клетках HetlA и НТ-29, опосредован взаимодействием с а7-нАХР. Активирующий эффект SLURP-2 на кератиноциты был, по-видимому, обусловлен его взаимодействием с а 3 Р2-нАХР. Меньшая по сравнению со SLURP-1 антипролифе-ративная активность SLuRP-2 на клетках НТ-29 связана, возможно, с меньшим сродством этого белка к а7-нАХР.

выводы

В представленной работе разработана эффективная система продукции малоизученного белка человека SLuRP-2, получены миллиграммовые количества рекомбинантного препарата и его 13С-15П-меченого аналога. Рекомбинантный SLuRP-2 отличается от природного белка наличием дополнительного N-концевого остатка Met. Эта система открывает новые возможности для проведения структурно-функциональных исследований SLuRP-2, в том числе с помощью методов сайт-направленного мутагенеза. Впервые охарактеризован антипролиферативный эффект белков SLURP-1 и SLURP-2 на линии клеток колоректальной аденокарциномы человека НТ-29, выдвинуто предположение, что этот эффект опосредован взаимодействием с нАХР типа а7. Полученные данные позволяют по-новому взглянуть на роль никотинового ацетилхолинового рецептора и его отдельных подтипов в регуляции роста эпителиальных клеток. •

Разработка системы рекомбинантной продукции SLURP-2, получение рекомбинантного препарата

SLURP-2 и структурно-функциональные исследования SLURP-2 выполнены при финансовой

поддержке РНФ (соглашение № 14-14-00255). Продукция рекомбинантного препарата SLURP-1 и его функциональные исследования выполнены при поддержке РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология») и РФФИ (грант № 12-04-01639-а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Papke R.L. // Biochem. Pharmacol. 2014. V. 89. № 1. P. 1-11.

2. Sharma G., Vijayaraghavan S. // J. Neurobiol. 2002. V. 53. № 4. P. 524-534.

3. Miwa J.M., Ibanez-Tallon I., Crabtree G.W., Sánchez R., Sali A., Role L.W., Heintz N. // Neuron. 1999. V. 23. № 1. P. 105-114.

4. Tekinay A.B., Nong Y., Miwa J.M., Lieberam I., Ibanez-Tallon I., Greengard P., Heintz N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 4477-4482.

5. Chimienti F., Hogg R.C., Plantard L., Lehmann C., Brakch N., Fischer J., Huber M., Bertrand D., Hohl D. // Hum. Mol. Genet. 2003. V. 12. P. 3017-3024.

6. Arredondo J., Chernyavsky A.I., Jolkovsky D.L., Webber R.J., Grando S.A. // J. Cell Physiol. 2006. V. 208. P. 238-245.

7. Darvas M., Morsch M., Racz I., Ahmadi S., Swandulla D., Zimmer A. // Eur. Neuropsychopharmacol. 2009. V. 19.

P. 670-681.

8. Tsetlin V., Utkin Y., Kasheverov I. // Biochem. Pharmacol. 2009. V. 78. P. 720-731.

9. Moriwaki Y., Watanabe Y., Shinagawa T., Kai M., Miyazawa M., Okuda T., Kawashima K., Yabashi A., Waguri S., Misawa H. // Neurosci. Res. 2009. V. 64. P. 403-412.

10. Moriwaki Y., Yoshikawa K., Fukuda H., Fujii Y.X., Misawa H., Kawashima K. // Life Sci. 2007. V. 80. P. 2365-2368.

11. Arredondo J., Chernyavsky A.I., Webber R.J., Grando S.A. // J. Invest. Dermatol. 2005. V. 125. P. 1236-1241.

12. Chernyavsky A.I., Galitovskiy V., Shchepotin I.B., Grando S.A. // Biomed. Res. Int. 2014. V. 2014. P. 609086.

13. Chernyavsky A.I., Kalantari-Dehaghi M., Phillips C., March-enko S., Grando S.A. // Wound Repair Regen. 2012. V. 20. № 1. P. 103-113.

14. Arredondo J., Chernyavsky A.I., Grando S.A. // Life Sci. 2007. V. 80. P. 2243-2247.

15. Arredondo J., Chernyavsky A.I., Grando S.A. // Biochem. Pharmacol. 2007. V. 74. № 8. P. 1315-1319.

16. Chernyavsky A.I., Marchenko S., Phillips C., Grando S.A. // Dermatoendocrinol. 2012. V. 4. № 3. P. 324-330.

17. Pettersson A., Nylund G., Khorram-Manesh A., Nordgren S., Delbro D.S. // Auton Neurosci. 2009. V. 148. P. 97-100.

18. Summers A.E., Whelan C.J., Parsons M.E. // Life Sci. 2003. V. 72. № 18-19 P. 2091-2094.

19. Шулепко М.А., Люкманова Е.Н., Парамонов А.С., Лобас

А.А., Шенкарев З.О., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., Долгих ДА., Арсеньев A.C., Кирпичников М.П. // Биохимия. 2013. Т. 78. № 2. C. 276-285.

20. Webb B., Sali A. // Curr. Protocols Bioinformat. 2014. V. 47. № 5-6. P. 1-32.

21. Люкманова Е.Н., Шулепко М.А., Тихонов Р.В., Шенкарев З.О., Парамонов А.С., Вульфсон А.Н., Кашеверов И.Е., Устич Т.Л., Уткин Ю.Н., Арсеньев А.С. и др. // Биохимия. 2009.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Т. 74. № 10. C. 1142-1149.

22. Шулепко М.А., Люкманова Е.Н., Кашеверов И.Е., Долгих Д.А., Цетлин В.И., Кирпичников М.П. /У Биоорган. химия 2011. Т. 37. № 5. C. 609-615.

23. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Shulepko M.A., Mineev K.S., D'Hoedt D., Kasheverov I.E., Filkin S., Janickova H., Dolezal V., Dolgikh D.A., et al. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 10618-10627.

24. Grando S.A. // J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 1997. V. 2. № 1. P. 41-48.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.