CC BY
84
https://doi.org/10-1 7116/molgen201 8360411 91
Бактериальный синтез наночастиц сульфидов кадмия и цинка. Характеристика и перспектива их применения
О.А. ЖУРАВЛЕВА1' 2, Т.А. ВОЕЙКОВА1, М.Х. ХАДДАЖ2 3, Н.В. БУЛУШОВА1, Т.Т. ИСМАГУЛОВА4, А.В. БАХТИНА3, С.А. ГУСЕВ5, И.А. ГРИЦКОВА3, Т.Н. ЛУПАНОВА6, К.В. ШАЙТАН4' 7, В.Г. ДЕБАБОВ1
1ФГБУ Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов «Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», 117545, Москва, Россия; 2Аграрно-технологический институт РУДН, 117198, Москва, Россия; 3ФГБОУ ВПО «Московский технологический университет», Институт тонких химических технологий, 119571, Москва, Россия; 4Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Россия; 5ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России», 119435, Москва, Россия; 6Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, Россия; 7Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991, Москва, Россия
Показано, что наночастицы сульфида кадмия (NpCdS) и сульфида цинка (NpZnS) образуются в присутствии бактерий Shewanella oneidensis MR-1, локализованы в культуральной жидкости и имеют сферическую форму. Наночастицы характеризуются узким диапазоном распределения по размерам, максимальный размер NpCdS и NpZnS составляет порядка 5—6 нм, при этом более 70% имеет размер около 2—4 нм. Эффективный диаметр NpCdS и NpZnS составляет 158,9 и 219,3 нм соответственно. Величина ^-потенциала NpCdS и NpZnS определена как -22,43 и -31,46 мВ, что характеризует водные суспензии этих наночастиц как метастабильные. Установлена избирательность адсорбции определенных белков на поверхность наночастиц из общего пула белковых молекул, синтезируемых штаммом S. oneidensis MR-1 в процессе культивирования. Показано, что вне зависимости от химической природы частиц (NpCdS и NpZnS) набор белковых молекул, адсорбированных на их поверхности, близок по значениям молекулярной массы. Впервые биогенные NpCdS и NpZnS использованы для создания модельной композиционной системы путем иммобилизации на поверхность аминосодержа-щих полиглицидилметакрилатных (ПГМА) микросфер.
Ключевые слова: биосинтез, Shewanella oneidensis Мк-1, наночастицы CdS и ZnS, белковое покрытие, потенциал, полимерные микросферы.
Bacterial synthesis of cadmium and zinc sulfide nanoparticles. Characteristics and perspective of their application
O.A. ZHURAVLIOVA1- 2, T.A. VOEIKOVA1, M. KHADDAZH2 3, N.V. BULUSHOVA1, T.T. ISMAGULOVA4, A.V. BAKHTINA3, S.A. GUSEV5, I.A. GRITSKOVA3, T.N. LUPANOVA6, K.V. SHAITAN4' 7, V.G. DEBABOV1
1NRC «Kurchatov Institute» — GOSNIIGENETIKA (State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms of NRC «Kurchatov Institute»), 117545, Moscow, Russian Federation; Agricultural Technology Institute, RUDN (People's Friendship University of Russia), 117198, Moscow, Russian Federation; 3FGBOU VPO «Moscow technological University» Institute of fine chemical technology, 119571, Moscow, Russian Federation; 4Lomonosov Moscow State University, 119991, Moscow, Russian Federation; 5FSBI «Federal research and clinical center of physico-chemical medicine FMBA of Russia», 119435, Moscow, Russian Federation; 6Institute of Gene Biology of the RAS, 119334, Moscow, Russian Federation; 7Semenov Institute of Chemical Physics, RAS, 119991, Moscow, Russian Federation
It is shown that nanoparticles of cadmium sulphide (NpCdS) and zinc sulphide (NpZnS) that are formed in the presence of She-wanella oneidensis MR-1 bacteria, are localized in the culture liquid, and have a spherical shape. Nanoparticles are characterized by a narrow range of size distribution; the maximum size of NpCdS and NpZnS is of the order of 5—6 nm, with more than 70% having a size of about 2—4 nm. The effective diameter of NpCdS and NpZnS is 158.9 nm and 21 9.3 nm, respectively. The value of the zeta potential of NpCdS and NpZnS is defined as —22.43 mV and —31.46 mV, respectively, that characterizes the aqueous suspensions of these nanoparticles as metastable. The selectivity of adsorption of certain proteins on the surface of nanoparticles from a common pool of protein molecules synthesized by S. oneidensis MR-1 strain during the cultivation process was established. It is shown, that independent of the chemical nature of the particles (NpCdS and NpZnS), protein molecules adsorbed on their surface have similar molecular weight. For the first time, biogenic NpCdS and NpZnS were used to create a model composite system by immobilizing amine-containing polyglycidyl methacrylate (PGMA) microspheres onto the surface.
Keywords: biosynthesis, Shewanella oneidensis MR-1, nanoparticles of CdS and ZnS, capping agents, zeta potential, polymeric microspheres.
Для корреспонденции: Журавлева Ольга Алексеевна, аспирант Аграр-но-технологического института РУДН, младший научный сотрудник лаборатории белковой инженерии НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика; e-mail: zhuravlevaolgga@gmail.com For correspondence: Zhuravliova Olga Alekseevna, graduate student of ATI PFUR, junior researcher scientist of the Laboratory of Protein Engineering NRC «Kurchatov Institute» — GOSNIIGENETIKA; e-mail:
© Коллектив авторов, 201 8 zhuravlevaolgga@gmail.com
Введение
Нанокристаллические соединения сульфидов цинка и кадмия (далее NpCdS и NpZnS) известны своей широкозонной полупроводниковой природой, что обеспечивает им исключительные оптические свойства и относит к флу-орофорам, а малые размеры (1 — 10 нм) классифицируют их как квантовые точки (КТ). Эти нанокристаллы находят применение в оптоэлектронике, лазерной технике, а также в биомедицине. Наравне с другими полупроводниковыми КТ NpCdS и NpZnS используются в качестве флуоресцентных меток для прижизненной визуализации различных биологических процессов, а также в диагностике раковых заболеваний [1, 2].
Традиционно NpCdS и NpZnS получают физическими и химическими методами, гарантирующими контроль размеров частиц и воспроизводимость результатов синтеза. Однако существует проблема токсичности реагентов, трудоемкости технологического процесса, а также стабилизации синтезируемых наночастиц в водных растворах и их биосовместимости, что затрудняет внедрение в область биологических исследований. Поэтому все чаще в научной литературе можно встретить публикации, в которых представлены результаты альтернативного метода получения наночастиц металлов и их соединений (в частности, сульфидов) — так называемого зеленого синтеза, основными биологическими компонентами которого могут быть микроорганизмы, экстракты растений, водоросли, грибы, дрожжи. Однако пока еще мало публикаций, касающихся изучения механизма получения наночастиц биологическим методом. До сих пор неясно, какие метаболиты и структуры клеток участвуют в формировании и стабилизации на-ночастиц.
Стабилизация наночастиц при «зеленом синтезе», по мнению многих авторов, осуществляется за счет адсорбции на их поверхности различных биополимерных молекул — белков, аминокислот, полисахаридов, поставляемых бактериальными клетками. В литературе часто встречается термин «белковая корона», указывающий на присутствие на поверхности наночастиц слоя белковых молекул, стабилизирующих их в водных суспензиях. В последнее время большую роль в формировании слоя молекул, покрывающего поверхность наночастиц gapping agents), отводят так называемой области внеклеточной биополимерной субстанции (extracellular polymeric substances, EPS), соприкасающейся с клеточной стенкой. Авторы отмечают, что EPS способна не только стабилизировать биогенные наноча-стицы [3, 4], но и обеспечивать бактериальным клеткам защиту от проникновения в них токсичных ионов путем их восстановления до наночастиц металлов [5, 6].
Наличие белок/пептидных связей на поверхности NpAg2S, обнаруженных методом ИК-спектроскопии, продемонстрировано в работе [7]. В работе [8] при получении кристаллов CdS в присутствии биосурфактантов штамма B. licheniformis выявлена важная роль аминокислот и белков. Полисахаридам также свойственно влиять на синтез наноструктур, им присущи гидрофильность, биосовместимость и нетоксичность, что выгодно отличает их от химических аналогов [9, 10].
В обзорной статье [11] представлены примеры внутриклеточного и внеклеточного биосинтеза NpZnS и NpCdS в присутствии микроорганизмов различных таксономических групп. Однако нет сведений о внеклеточном синтезе наночастиц NpZnS и NpCdS в аэробных условиях с помо-
щью широко используемого для получения наночастиц бактериального штамма Shewanella oneidensis MR-1. Кроме того, методы получения NpZnS и NpCdS отличаются сложностью и многоэтапностью проведения экспериментов, включают анаэробные условия и использование многокомпонентных реакционных сред. В одной из ранних публикаций о «зеленом синтезе» ZnS рассматривается низкотемпературный процесс отложения сфалерита в биопленках, в которых преобладала Desulfobacteriaceae sp. M. Labrenz и соавт. [12] отмечали способность микробов контролировать концентрации ионов металлов в грунтовых водах и заболоченных местах, переводя их в наночастицы. При биосинтезе NpZnS с использованием Serratia nematodiphila и Klebsiella pneumonia была выявлена прямая зависимость размера биогенных наночастиц от фазы роста бактерий [13]. Интересно, что синтезированные наночастицы проявляли антибактериальную активность в отношении Bacillus subtilis и Klebsiella planticola, что характеризует их как мощный антимикробный продукт [14]. В работе [15] исследовали возможность очистки сточных вод, содержащих ZnSO4, с использованием металл-восстанавливающей бактерии S. oneidensis MR-1 в анаэробных условиях. В результате были получены NpZnS, расположенные на поверхности клеток и в среде, размером около 5 нм.
Первый биосинтез квантовых полупроводниковых кристаллитов CdS был проведен C. Dameron и соавт. в присутствии Candida glabrata и Schizosaccharomyces pombe [16]. Обнаруженная ими прямая зависимость эффективности формирования NpCdS от фазы роста микроорганизмов позднее подтвердилась в работе с использованием Klebsiella pneumonia, в которой было доказано, что более длительные периоды роста культуры приводят к увеличению размера биосинтезируемых частиц [17], а также при исследовании внутриклеточного механизма синтеза NpCdS в Escherichia coli, где наибольший выход наночастиц достигался в стационарной фазе [18].
Большой интерес представляет изучение оптических, фотокаталитических и фотолюминесцентных свойств биогенных NpCdS и NpZnS по сравнению с аналогами, полученными физико-химическими способами [19]. Показано, что у биогенных наночастиц NpZnS [15] оптические спектры поглощения и ширина запрещенной зоны отличаются от аналогичных показателей для частиц, полученных химическими методами [20]. Результаты исследования оптических свойств квантовых точек ZnS описаны L. Yue и соавт. [21]. Биосинтез проводили с использованием клеток Clostridiaceae spp. Регулирование концентрации вводимого диспергатора (гидроксипропилкрахмала) в реакционной среде привело к изменению размеров и преобразованию кристаллической структуры. Одна из форм наночастиц имела лучшее поглощение в видимой области и высокую активность флуоресценции. P. Qi и соавт. [22] сообщают о росте интенсивности флуоресценции NpCdS с увеличением времени культивирования бактерии Desul-foribrio caledoiensis. Готовые наночастицы использовали в качестве флуоресцентных меток для обнаружения суль-фатвосстанавливающих бактерий.
Немалый интерес представляет иммобилизация нано-наполнителя на поверхность микросфер различной полимерной природы. Во-первых, нанокомпозит приобретает требуемые свойства, характерные для присутствующих в его составе наночастиц. Во-вторых, обеспечиваются безопасность и сохранность параметров готового нанокомпо-зитного материала в условиях дальнейшей эксплуатации
за счет стабилизирующего эффекта микросфер. Такие полимерные носители флуоресцентных меток используются, например, в визуализации клеток и тканей живого организма [23]. Полимерные частицы также служат носителями биолигандов, что существенно при создании высокочувствительных диагностических тест-систем [24]. В обзорной статье К.И. Бражник и соавт. [1] подробно описаны суспензивные системы, состоящие из микросфер, оптически кодированных флуорофорами. Такие модели широко распространены в методах маркировки, визуализации и скрининге белков и ферментов, вызывающих аллергические реакции, инфекционные заболевания. Х. Gao и соавт. [25] приводят разработку «конструкции» полимер/полупроводниковые КТ/лиганд, нацеленную на диагностику и лечение раковых опухолей.
Таким образом, полимерные микросферы, модифицированные иммобилизованными в них биогенными нано-частицами и содержащие на своей поверхности биолиганд определенного состава, могут выступать в качестве самостоятельного лечебно-диагностического объекта. В связи с этим необходимо решить вопрос, связанный с подбором оптимальных условий для создания модельных систем (по-лимер/наночастица, полимер/наночастица/биолиганд), характеризующихся устойчивостью при использовании в различных биотехнологических процессах и длительным сроком хранения. Также потребуется разработать различные методы анализа для оценки степени проникновения нанонаполнителя в полимерный носитель.
Целью работы являлось a) проведение анализа биогенных NpCdS и NpZnS, полученных в присутствии бактериальных клеток S. oneidensis MR-1 в аэробных условиях по оптимизированной нами ранее методике [26]; б) получение характеристик NpCdS и NpZnS в отношении формы и размера, элементного химического состава; в) проведение оценки эффективного диаметра и заряда поверхности (Z-потенциала) частиц в водных суспензиях; г) определение молекулярных масс белковых молекул, входящих в состав стабилизирующего слоя на поверхности наночастиц; д) создание модельной композиционной системы, включающей аминосодержащие полиглицидилметакрилатные микросферы и биогенные NpCdS и NpZnS, иммобилизованные на их поверхности.
Материал и методы
Штамм. В работе использовали бактериальный штамм Shewanella oneidensis MR-1, предоставленный Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгене-тика, полученный из коллекции микроорганизмов Института Пастера (№CIP106686, Франция).
Культивирование штамма S. oneidensis MR-1
Отдельные колонии бактериальной культуры S. oneidensis MR-1 выращивали на агаризованной питательной среде Luria-Bertani Agar (LBA) в течение 24 ч при 30 °С. Далее биомассу штамма микробиологической петлей переносили в колбу объемом 750 мл, содержащую 100 мл жидкой LB среды, и культивировали на круговой качалке (220 об/мин) при температуре 28 °С в течение 24 ч. Полученную культуральную жидкость, содержащую клетки штамма S. oneidensis MR-1, использовали для биосинтеза NpCdS и NpZnS.
Биосинтез NpCdS и NpZnS. Для получения NpCdS и NpZnS использовали водные растворы солей Na2Sx9H2O+ CdCl2x2,5H2O и Na2Sx9H2O+ZnCl2. Раствор каждой из со-
лей данной пары вводили в колбы, содержащие 100 мл куль-туральной жидкости с клетками штамма S. oneidensis MR-1, до концентрации 2 мМ Na2Sx9H2O к 2 мМ CdCl2x2,5 H2O (ZnCl2), согласно оптимизированной методике, описанной для биосинтеза NpAg2S в работе Т.А. Воейковой и соавт. [26].
Готовую реакционную смесь инкубировали аэробно на круговой качалке (220 об/мин) при 28 °С в течение 48 ч. Клетки осаждали на высокоскоростной центрифуге (MSE High speed 18, Англия) в режиме 10 000 g в течение 30 мин. Образовавшийся супернатант пропускали через стерильный фильтр с диаметром пор 200 нм (Nucleopore). Нано-частицы были выделены из фильтрата с использованием ультрацентрифуги («Beckman», США) при 100 000 g в течение 1 ч; выпавший осадок наночастиц двукратно отмывали стерильной деионизированной водой Milli Q («Millipore», США), при центрифугировании с соблюдением прежних условий. Осадки суспендировали в 1 мл деионизированной воды Milli Q до однородного состояния. Хранили в эппен-дорфах при 4 °С.
Синтез контрольных образцов CdS, ZnS. В отсутствие бактериальных клеток попарно вносили водные растворы солей Na2Sx9H2O+CdCl2x2,5H2O и Na2Sx9H2O+ZnCl2 в LB-среду до концентрации 2 мМ:2 мМ. Дальнейшие этапы синтеза соответствовали вышеописанным.
Просвечивающая электронная микроскопия. Форму и размер наночастиц оценивали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Подготовка образцов включала нанесение 3 мкл суспензии наночастиц на медную сетку с подложкой из дырчатого углерода, покрытого ультратонким углеродным слоем («Ted Pella Inc», США), с последующим выдерживанием на воздухе в течение 30 с, удаление избытка жидкости и сушку.
Методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (ЭДС) в режиме сканирующей ПЭМ выявляли элементный состав NpCdS и NpZnS. Выборочный участок суспензии сканировали электронным лучом диаметром 10 нм. Использовали просвечивающий электронный микроскоп модели JEM2100 c катодом из гексаборида лантана (JEOl, Япония), оснащенным рентгеновским детектором X-Max, управляемым программным пакетом INCA («Oxford Instruments», Великобритания) при ускоряющем напряжении 200 кВ. Регистрацию энергодисперсионных рентгеновских спектров проводили в диапазоне энергий рентгеновского излучения от 0 до 10 кэВ с разрешением 10 эВ на канал. Для вычисления размеров наночастиц применяли программное обеспечение для обработки изображений Image J, измеряя наименьший и наибольший линейный размер частиц на полученных ПЭМ-изображени-ях. Для обеспечения достоверной статистики в программе MS Excel for Windows обрабатывали порядка 100 частиц от каждого образца. В прикладной программе Origin 8.5 строили гистограммы распределения частиц по размерам.
Электрофорез белков в денатурирующих условиях. Основываясь на методе Лэмми [27], электрофорез белков проводили в 12,5% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфат-натрия («Sigma», США). В качестве стандартов молекулярной массы использовали предокра-шенные белковые маркеры #SM0671 («Fermentas», Литва).
Электрофоретические измерения биосинтезированных наночастиц (Z-потенциал, эффективный диаметр и полидисперсность). Измерения проводили, основываясь на методе электрофоретического светорассеяния с анализом фаз. Образец объемом 1 мл вносили в стеклянную кювету с тефло-новым уплотнителем объемом 180 мкл и помещали в ана-
лизатор Z-потенциала ZetaPALS («Brookhaven Instruments Corporation», США). Полученные данные обрабатывали при помощи программного обеспечения Brookhaven 90Plus.
Иммобилизация на полимерные микросферы NpCdS и NpZnS
Для проведения процесса иммобилизации NpCdS и NpZnS на полимерную поверхность использовали амино-содержащие полиглицидилметакрилатные микросферы (ПГМА микросферы) со средним диаметром 3,5 мкм (Z-по-тенциал +15,6±0,1 мВ, угол смачивания 47,2±1°), синтез которых подробно изложен в [28]. Активация аминогрупп используемых ПГМА микросфер была проведена заранее посредством введения водного раствора карбодиимида (КДИ). Процесс иммобилизации начинали со смешения готовой полимерной суспензии с водными растворами NpCdS или NpZnS в равных объемах (по 100 мкл), инкубировали на ротационном шейкере Multi Bio RS-24 («Bio-san», Латвия) при постоянном перемешивании 24 ч при комнатной температуре. Спустя 1 сут реакционную суспензию отмывали 3 раза дистиллированной водой, используя центрифугу MiniSpin Plus («Eppendorf», Германия) в режиме 3000 об/мин.
Сканирующая электронная микроскопия. Наличие биогенных наночастиц на поверхности аминосодержа-щих ПГМА микросфер определяли методом сканирующей электронной микроскопии. Микрофотографии полимерных микросфер до и после проведения процесса иммобилизации снимали с помощью сканирующего электронного микроскопа S-570 («Hitachi», Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ. Пробоподготовка образцов включала нанесение 100 мкл полимерной суспензии с концентрацией 0,1% (масс.) на предметный столик и сушку в течение 24 ч; высушенный образец помещали в вакуумную камеру ионного напылителя IB-3 (EIKO ENGINEERING, Япония) для нанесения платино-пал-ладиевого слоя толщиной 100 Â.
Результаты и обсуждение
Характеристики биогенных NpCdS и NpZnS
Для получения биогенных наночастиц была использована разработанная нами ранее оптимизированная методика биосинтеза NpAg2S, позволяющая увеличить выход наночастиц на 15—20% [26]. Данная методика была основана на введении водных растворов реакционных солей AgNO3 и Na2S2O3x5H2O непосредственно в культу-ральную жидкость, содержащую клетки S. oneidensis MR-1 и белки, синтезированные штаммом в процессе культивирования. Кроме того, концентрации реакционных солей были увеличены. Наночастицы NpCdS и NpZnS были получены нами в присутствии бактериальных клеток в питательной среде LB, содержащей соль соответствующего металла — хлорид цинка или хлорид кадмия и источник серы — сульфид натрия в соотношении 2мМ:2мМ (далее — реакционная смесь). Была использована культуральная жидкость, содержащая бактериальные клетки S. oneidensis MR-1, находящиеся в стационарной фазе роста. Процесс биосинтеза наночастиц проводили в аэробных условиях. Выделение NpCdS и NpZnS проводили из фильтрата надосадочной жидкости реакционной смеси после удаления клеток с помощью центрифугирования, поэтому можно утверждать, что установлена внеклеточная локализация биосинтеза наночастиц.
У свежеполученных водных суспензий биогенных NpCdS и NpZnS наблюдали частичное выпадение оранжево-желтого или белого осадка, характерного для данных соединений. Это свидетельствует о метастабильном состоянии водных суспензий этих наночастиц. Следует отметить, что стабильность NpAg2S в водных суспензиях, ранее полученных нами в присутствии этого же штамма (5. oneiden-sis MR-1), была очень высокой, и частицы не агломерировали в течение многих месяцев [29]. В качестве контрольного эксперимента получали и ZnS в тех же условиях, но в отсутствие бактериального штамма. При этом не происходило образование наночастиц, а выпадал плотный осадок, состоящий из агломерированных частиц сульфидов кадмия или цинка. Разработанный нами метод выгодно отличается от анаэробного способа получения NpZnS с использованием той же бактерии 5. oneiden-sis MR-1 [15].
Исследование NpCdS и NpZnS с использованием ПЭМ-анализа показало, что для них характерна сферическая форма. В качестве примера на ПЭМ-изображе-нии представлены NpZnS, кристаллические решетки которых отчетливо видны (рис. 1, а). Наночастицы имеют узкий диапазон распределения по размерам, максимальный размер NpCdS и NpZnS составляет порядка 5—6 нм, при этом более 70% имеет размер около 2—4 нм. Следует отметить, что NpCdS и NpZnS окружены густым неструктурированным матриксом, о чем свидетельствует наличие пиков N О и Р в ЭДС-спектрах (см. рис. 1, б, в). Вследствие малого размера наночастиц и наличия органического матрикса возникает проблема фокусировки изображений, из-за чего границы между частицами четко не выявляются.
Методом ЭДС подтвержден элементный состав каждого синтезированного образца: для NpZnS в спектрах от наночастиц — пики Zn и S (см. рис. 1, б), для NpCdS в спектрах от наночастиц — пики Cd и S (см. рис. 1, в). В спектрах от полученных наночастиц также выявляли пики ^ О, N Р и Ca. Пики C и О происходят от углеродной подложки сеточки для ПЭМ, а пики N Р, Ca, а также C и О — от органического матрикса, окружающего частицы. В представленной работе из-за сложностей с выбором стандартов, содержащих идентичный набор элементов (Cd или Zn, а также S, ^ О, N Р, Ca) с известным атомным соотношением, количественную оптимизацию ЭДС-спектров полученных наночастиц не проводили [30]. В связи с чем из полученных ЭДС-спектров можно получить достоверную информацию только о качественном составе образцов, получение достоверной информации об атомном соотношении выявляемых элементов из представленных ЭДС-спектров не представляется возможным. Выявленные кристаллические решетки полученных наночастиц, а также наличие в спектрах от полученных частиц пиков Cd и S или Zn и S позволяют сделать вывод о том, что полученные наночастицы являются наночастицами CdS или ZnS соответственно.
Исследование состава стабилизирующего поверхностного слоя NpCdS и NpZnS. Белковый электрофорез в поли-акриламидном геле (ПААГ). Как указывалось выше, стабилизация наночастиц в водных суспензиях обусловливается наличием на их поверхности белковых молекул, которые поставляет клетка в процессе формирования наночастиц в растворе солей. В литературе отсутствуют данные по идентификации состава покрывного слоя на поверхности NpCdS и NpZnS. Поэтому было проведено исследование состава белков, сорбированных на поверхности биосин-
тезированных наночастиц, и сопоставления белков, выделяемых бактериальными клетками 5. oneidensis MR-1 в питательную LB-среду (культуральную жидкость). Нами был проведен сравнительный анализ молекулярных масс белковых фрагментов, которые были выявлены методом белкового электрофореза в ПААГ. На электрофореграм-мах представлены треки, содержащие белки, синтезируемые при культивировании штамма 5. oneidensis MR-1 в LB-среде (рис. 2, а); белки, покрывающие поверхность NpAg2S (см. рис. 2, б), полученные с использованием того же штамма. Белки, адсорбированные на поверхности NpCdS и NpZnS соответственно, представлены на треках В и Г (см. рис. 2). Как видно (см. рис. 2, а), бактериальный штамм выделяет в питательную среду значительное количество белков различной молекулярной массы. Однако на поверхности наночастиц сорбируется только часть из них. Таким образом, существует избирательность адсорбции определенных белков на поверхность наночастиц из общего пула белковых молекул, синтезируемых клетками в процессе культивирования. Кроме того, для всех трех образцов — NpAg2S, NpCdS и NpZnS характерен схожий набор большинства белковых фрагментов, находящихся в близких значениях молекулярной массы. При этом есть незначительные отличия. Так, на треке Б для NpAg2S присутствует яркая (мажорная) полоса порядка 20 кД, еле различимая у остальных образцов. Поверхность NpCdS и NpZnS адсорбирует белковую молекулу весом ~30 кД, в то время как трек для NpAg2S пустует в интервале 23—34 кД.
Эти результаты указывают на то, что спектр белковых молекул, адсорбирующихся на поверхности наночастиц, определяется штаммом, используемым для биосинтеза, и не строго зависит от химического состава частиц.
Электрофоретическая характеристика поверхности
биогенных наночастиц
В научной литературе отсутствуют данные по оценке Z-потенциала поверхности биогенных NpCdS и NpZnS, эффективного диаметра и полидисперсности. Эти параметры чрезвычайно важны для определения стабильности водных суспензий наночастиц и возможности их использования в практических целях.
В настоящей работе методом электрофоретического рассеяния света измеряли следующие параметры наночастиц: Z-потенциал на поверхности NpCdS и NpZnS, от величины которого зависит стабильность водных суспензий наночастиц; эффективный диаметр, под которым подразумевается диаметр частицы с учетом матриксного окружения (capping agents). Величина эффективного диаметра рассчитывается усреднением максимальных (пиковых) значений размеров частиц в каждой отдельной фракции. Полидисперсность — параметр, показывающий соотношение количества разноразмерных молекул в образце, что дает представление о возможном разбросе размеров частиц в водном растворе.
Из таблицы следует, что NpAg2S уступают по величине эффективного диаметра (106,8 нм) NpZnS и NpCdS, харак-
д н о о И я S о И о н И
S
llllfl
800 700
400 300 200 100 0
i
Са
0
600 500 400 300 200 100 0
С h
N
- Си S BEI
■ 0 Na 1 / pi k
2 3 4 0 б Энергия (кэВ)
2 в
Рис. 1. Результаты анализа образцов биогенных NpZnS и NpCdS.
а — ПЭМ-изображение NpZnS; б — типичный энергодисперсионный рентгеновский спектр NpZnS; в — типичный ЭДС-спектр от NpCdS. Величина масштабной метки на ПЭМ-изображении составляет 5 нм. Для ЭДС-спектров по оси абсцисс указана энергия характеристического рентгеновского излучения (кэВ). По оси ординат — интенсивность рентгеновского излучения (количество импульсов).
а
1
3
4
1
А Б В Г Д
Рис. 2. Электрофореграмма в полиакриламидном геле белков.
А — белки, выделяемые бактериальными клетками 5. oneidensis МЯ-1 в питательную LB-среду; Б — белки, адсорбированные на поверхности NpAg2S; В — белки, адсорбированные на поверхности NpCdS; Г — белки, адсорбированные на поверхности NpZnS; Д — маркеры молекулярной массы белков (кД).
теризующимся значительным белковым слоем. Эти данные подтверждают ранее полученные результаты ПЭМ-изображений образца NpZnS, где четко различимы участ-
Рис. 3. Электронные микрофотографии.
а — исходные аминосодержащие ПГМА микросферы; б зации в них NpZnS.
ки органического вещества, окружающие наночастицы. Однако параметр полидисперсности NpAg2S превышает аналогичный показатель для NpCdS и NpZnS, что свидетельствует о наличии в суспензии крупных частиц или их агломератов. Отметим, что величина полидисперсности водной суспензии NpCdS меньше примерно в 1,4 раза (см. таблицу), чем у NpZnS, а это значит, что для образца CdS характерен меньший разброс частиц по размерам.
Показано, что ¡¡-потенциал трех образцов — NpAg2S, NpCdS и NpZnS имеет отрицательные заряды: -21,82, -22,43 и -31,46 мВ соответственно. Величина ¡¡-потенциала является очень важной характеристикой стабильности коллоидов, суспензий, эмульсий. Чем выше абсолютное значение ¡¡-потенциала, тем больше устойчивость частиц. Из данных литературы известно, что при значениях ¡¡-потенциала ниже ±30 мВ суспензии наночастиц характеризуют как мета-стабильные. Учитывая величины ¡¡-потенциала и значения полидисперсности NpAg2S, NpCdS, NpZnS, данные суспензии также можно оценить как метастабильные. Мы предполагаем, что значения ¡¡-потенциала поверхности наночастиц, диспергированных в водном растворе, связаны с природой, концентрацией и зарядом функциональных групп белковых молекул, составляющих стабилизирующий слой. Это позволит подобрать полимерные микросферы, наиболее подходящие для успешной иммобилизации биогенных наночастиц при создании модельного полимерного нанокомпо-зитного материала.
Создание модельного нанокомпозитного материала. В научной литературе отсутствуют какие-либо сведения относительно иммобилизации наночастиц биогенного происхождения на поверхность полимерных микросфер. Наличие на поверхности наночастиц белковых молекул, способных взаимодействовать с функциональными группами полимерных микросфер, позволяет предположить их ко-валентное связывание и электростатическое взаимодей-[- ствие в составе нанокомпозита. Возможность использова-
- ния биогенных NpCdS и NpZnS в качестве квантовых точек
- открывает перспективу создания новых высоконаполнен-
— после иммобилизации в них NpCdS; в — после иммобили-
Результаты электрофоретических измерений NpAg2S, NpCdS и NpZnS
Наночастицы Параметры
Z-потенциал (мВ) Эффективный диаметр (нм) Полидисперсность
CdS -22,43 158,9 Ö7T2
ZnS -31,46 219,3 0,17
Ag2S -21,82 106,8 0,3
ных полимерных наноматериалов. В этом случае композитные частицы представляют собой полимерные микросферы, в оболочке поверхностного слоя которых содержатся нанополупроводниковые частицы. В данной работе впервые использовали аминосодержащие ПГМА микросферы, на поверхность которых иммобилизовали NpCdS и NpZnS. Результаты фиксировали с помощью сканирующего электронного микроскопа (рис. 3).
На первой микрофотографии изображены исходные аминосодержащие ПГМА микросферы (см. рис. 3, а), на второй и третьей — полимерные микросферы после иммобилизации NpCdS и NpZnS (см. рис. 3, б, в). При этом четко различимы неравномерно локализованные агрегаты иммобилизованных наночастиц, причем NpZnS более склонен к проявлению флокуляции на полимерной поверхности (см. рис. 3, в). Такое поведение, вероятно, связано как с состоянием самих суспензий NpCdS и NpZnS, близким к метаста-бильному, так и с расположением функциональных групп в исходной полимерной микросфере. Отметим, что на всех изображениях видно, что до и после проведенного процесса иммобилизации ПГМА микросферы уложены в монослой, т.е. наличие наночастиц на поверхности микросфер не приводило к агломерации нового композиционного материала. Ранее мы продемонстрировали возможность иммобилизации биогенных NpAg2S (диаметр 8±2 нм) на поверхность аминосодержащих полистирольных микросфер (диаметр 5±2 мкм). Было показано, что более 60% наноча-
стиц, находящихся в реакционном объеме, иммобилизуется на полистирольных микросферах. Полученная комбинированная система была стабильна и не агрегировала [31].
Таким образом, первые результаты иммобилизации наночастиц, полученных микробным синтезом, на поверхность полимерных микросфер показали возможность использования биогенных наночастиц сульфидов металлов для создания новых композитных материалов. Последующие эксперименты будут направлены на усовершенствование методики введения биогенных наночастиц в полимерные материалы, определение эффективности связывания компонентов комбинированной системы, разработку методов оценки их взаимодействия, создание полноценного полимерного нанокомпозита и изучение его биологических и физико-химических характеристик.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант №16-0400471).
Исследования по электронной микроскопии объектов проведены при финансовой поддержке Программы президиума РАН (№24). Исследования с использованием методов аналитической ПЭМ выполнены на оборудовании ЦКП МГУ им. М.В. Ломоносова при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ. В работе использовалось оборудование ЦКП ИБГ РАН.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Бражник К.И., Барышникова М.А., Соколова З.А., Набиев И.Р., Суханова А.В. Новые направления в исследовании и ранней диагностике рака с применением детекционных систем на основе флуоресцентных нанокристаллов. Российский биотерапевтический журнал. 2013;12(3):11-24. [Brazhnik KI, Baryshnikova MA, Sokolova ZA, Nabiev IR, Suhanova AV. New directions in the study and early detection of cancer using detection systems based on fluorescent nanocrystals. Rossijskij bioterapevticheskij zhurnal. 2013;12(3):11 -24. (In Russ.)].
2. Iravani S. Bacteria in nanoparticle synthesis: current status and future prospects. International Scholarly Research Notices. 2014; 1-18.
3. Xiong Y, Fredrickson JK, Romine MF, Marshall MJ, Lipton MS, Beyenal H, et al. Extracellular polymeric substances from Shewanella sp. HRCR-1 biofilms: characterization by infrared spectroscopy and proteomics. Environmental Microbiol. 2011;13(4):1018-1031.
4. Ikuma K, Decho AW, Lau BLT. When nanoparticles meet biofilms-interactions guiding the environmental fate and accumulation of nanoparticles. Front Microbiol. 2015;6:1-6.
5. Kang F, Alvarez PJ, Zhu D. Microbial extracellular polymeric substances reduce Ag+ to silver nanoparticles and antagonize bactericidal activity. Environ Sci Technol. 2014;48(1):316-322.
6. Tanzil AH, Sultana ST, Saunders SR, Shi L, Marsili E. Biological synthesis of nanoparticles in biofilms. Enzyme and Microbial Technology. 2016;95:4-12.
7. Suresh AK, Doktycz MJ, Wang W, Moon J-W, Gu B, Meyer III HM, et al. Monodispersed biocompatible silver sulfide nanoparticles: facile extracellular biosynthesis using y-proteobacterium Shewanella oneidensis. Acta Biomateriala. 2011;7:4253-4258.
8. Bakhshi M, Hosseini MR, Rahimi M. 4th International Conference on Nanotechnology and Basic Science. 2016, Feb. 4—5; Dubai. 2016.
9. Duan H, Wang D, Li Y. Green chemistry for nanoparticle synthesis. Chem Soc Rev. 2015;44(16):5778-5792.
10. Boury B, Plumejeau S. Metal oxides and polysaccharides: an efficient hybrid association for materials chemistry. Green Chem. 2015;17(1):72-88.
11. Hosseini MR, Sarvi MN. Recent achievements in the microbial synthesis of semiconductor metal sulfide nanoparticles. Materials Science in Semiconductor Processing. 2015;40:293-301.
12. Labrenz M, Druschel GK, Thomsen-Ebert T, Gilbert B, Welch SA, Kemner KM, et al. Formation of sphalerite (ZnS) deposits in natural biofilms of sulfate-reducing bacteria. Science. 2000;290(5497):1744-1747.
13. Malarkodi C, Rajeshkumar S, Paulkumar K, Vanaja M, Gnanajobitha G, Annadu-rai G. Biosynthesis and. antimicrobial activity of semiconductor nanoparticles against oral pathogens. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2014;1-10.
14. Malarkodi C, Annadurai G. A novel biological approach on extracellular synthesis and characterization of semiconductor zinc sulfide nanoparticles. Appl Nanosc. 2013;3(5):389-395.
15. Xiao X, Ma X-Bo, Yuan H, Liu P-C, Lei Y-B, Xu H, Du D-L, Sun J-F, Feng Y-J. Photocatalytic properties of zinc sulfide nanocrystals biofabricated by metal-reducing bacterium Shewanella oneidensis MR-1. Journal of Hazardous Materials. 2015;288:134-139.
16. Dameron CT, Reese RN, Mehra RK, Kortan AR, Carroll PJ, Steigerwald ML, et al. Biosynthesis of cadmium sulphide quantum semiconductor crystallites. Nature. 1989;338:596-507.
17. Holmes JD, Richardson DJ, Saed S, Evans-Gowing R, Russell DA, Sodeau JR. Cadmium-specific formation of metal sulfide 'Q-particles' by Klebsiella pneumoniae. Microbiology. 1997;143:2521-2530.
18. Sweeney RY, Mao C, Gao X, Burt JL, Belcher AM, Georgiou G, et al. Bacterial biosynthesis of cadmium sulfide nanocrystals. Chem Biol. 2004;11(11):1553-1559.
19. Lu YX, Li L, Ding Y, Zhang F, Wang Y, Yu W. Hydrothermal synthesis of functionalized CdS nanoparticles and their application as fluorescence probes in the determination of uracil and thymine. J Lumin. 2012;132(1):244-249.
20. Yu X, Yu J, Cheng B, Huang B. One-pot template-free synthesis of monodisperse zinc sulfide hollow spheres and their photocatalytic properties. Chem Eur J. 2009;15(27):6731 -6739.
21. Yue L, Qi S, Wang J, Cai J, Xin B. Controllable biosynthesis and characterization of a-ZnS and (3-ZnS quantum dots: Comparing their optical properties. Materials Science in Semiconductor Processing. 2016;56:115-118.
22. Qi P, Zhang D, Zeng Y, Wan Y. Biosynthesis of CdS nanoparticles: A fluorescent sensor for sulfate-reducing bacteria detection. Talanta. 2016;147:142-146.
23. Левшенко Е.Н., Грицкова И.А., Гусев С.А., Гусев А.А., Волкова Е.В. Полимерные микросферы в качестве носителей флуоресцентной метки при построении трехмерной модели сосудистого русла экспериментальных животных. Биотехнология. 2013;6:65-70. [Levshenko EN, Gritskova IA, Gusev SA, Gusev AA, Volkova EV. Polymeric microspheres as carriers of the fluorescent label in the construction of a three-dimensional model of the vascular bed of experimental animals. Biotehnologija. 2013;6:65-70. (In Russ.)J.
24. Волкова Е.В., Лукашевич А.Д., Левачева И.С., Левачев С.М., Гусев С.А., Грицкова И.А. Выбор полимерных микросфер для проведения реакции латексной агглютинации в плашечном формате. Вестник МИТ-ХТ. 2013;8(6):68-72. [Volkova EV, Lukashevich AD, Levacheva IS, Levachev SM, Gusev SA, Gritskova IA. The choice of polymer microspheres for the latex agglutination reaction in a scaled format. Vestnik MITHT. 2013;8(6):68-72. (In Russ.)J.
25. Gao X, Cui Y, Levenson RM, Chung LW, Nie S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 2004;969-976.
26.
Воейкова Т.А., Журавлева О.А., Грачева Т.С., Булушова Н.В., Исмагу-лова Т.Т., Шайтан К.В. и др. Оптимизация микробного синтеза нано-
частиц сульфида серебра. Биотехнология. 2017;33(3):38-46. [Voeikova TA, Zhuravliova OA, Gracheva TS, Bulushova NV, Ismagulova TT, Shajtan KV, et al. Optimization of microbial synthesis of silver sulfide nanoparticles. Biotehnologija. 2017;33(3):38-46. (In Russ.)J.
27. Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227:680-685.
28. Бахтина А.В., Сиваев А.А., Левачев С.М., Гусев С.А., Лобанова Н.А., Лазов М.А. и др. Синтез аминосодержащих полимерных микросфер затравочной сополимеризацией для применения в биотехнологии. Тонкие химические технологии. 2017;12(4):75-84. [Bakhtina AV, Sivaev AA, Levachev SM, Gusev SA, Lobanova NA, Lazov MA, et al. Synthesis of amine-containing polymeric microspheres by seed copolymerization for applications in biotechnology. Tonkie himicheskie tehnologii. 2017;12(4):75-84. (In Russ.)].
29. Дебабов В.Г., Воейкова Т.А., Шебанова А.С., Шайтан К.В., Емельянова Л.К., Новикова Л.М. и др. Бактериальный синтез наночастиц сульфида серебра. Российские нанотехнологии. 2013;8(3-4):269-276. [Debabov VG, Voeikova TA, Shebanova AS, Shajtan KV, Emel'yanova LK, Novikova LM, et al. Bacterial synthesis of silver sulfide nanoparticles. Rossijskie nanotehnologii. 2013;8(3-4):269-276. (In Russ.)].
30. Williams DB, Carter CB. Quantitative X-ray Analysis. In: Williams D.B., Carter C.B. Transmission Electron Microscopy. A Textbook for Materials Science. 2nd ed. Boston: Springer; 2009.
31. Журавлева О.А., Хаддаж М.Х., Гусев С.А., Грицкова И.А., Басырева Л.Ю., Застрожная И.Ю. и др. Создание композиционных полимерных материалов, содержащих наночастицы биогенного происхождения. В кн.: Материалы Всероссийской конференции с международным участием «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы». М. 2016;159. [Zhuravliova OA, Haddazh MH, Gusev SA, Gritskova IA, Basyreva LYu, Zastrozhnaya IYu, et al. Creation of composite polymeric materials containing nanoparticles of biogenic origin. In: All-Russian conference with international participation «50 years of VSGB: successes and prospects». M. 2016;159. (In Russ.)].
Поступила в редакцию 12.12.17 После доработки 12.12.17 Принята к печати 07.04.18
Сведения об авторах:
Журавлева Ольга Алексеевна (Zhuravliova Olga) — аспирант Аграрно-технологического института РУДН, м.н.с. лаборатории белковой инженерии НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика; e-mail: zhuravlevaolgga@gmail.com
Воейкова Татьяна Александровна (Voeikova Tatiana) — к.б.н., главный научный сотрудник лаборатории белковой инженерии НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика
Хаддаж Мишаль Хаддаж (Khaddazh Mishal) — д.х.н., профессор МТУ ИТХТ, Аграрно-технологический институт РУДН Булушова Наталья Владимировна (Bulushova Natal'ya) — к.б.н., зав. лабораторией химии белка НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика
Исмагулова Татьяна Талгатовна (Ismagulova Tatiana) — аспирант биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Бахтина Анна Владимировна (Bakta^ Anna) — аспирант кафедры химии и технологии высокомолекулярных соединений им. С.С. Медведева МТУ ИТХТ
Гусев Сергей Андреевич (Gusev Sergej) — д.м.н., проф., заведующий лабораторией морфологии НИИ ФХМ ФМБА России Грицкова Инесса Александровна (Gritskova Inessa) — д.х.н., профессор кафедры химии и технологии высокомолекулярных соединений им. С.С. Медведева МТУ ИТХТ
Лупанова Татьяна Николаевна (Lupanova Tatiana) — младший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики внутриклеточного транспорта ИБГ РАН
Шайтан К.В. (Shaitan Konstantin) — профессор биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН
Дебабов Владимир Георгиевич (Debabov Vladimir) — д.б.н., академик РАН, научный руководитель НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика
