CC BY
37
Бактериальный эндосимбиоз с эукариотами в эволюции бактерии
Э.М.Агаева, С.А.Мурадова, З.О.Караев
Азербайджанский медицинский университет, г.Баку
В настоящее время кандиды- одни из наиболее распространенных возбудителей оппортунистических микозов и системных инфекций у пациентов с иммунодефицитами [1,2,3].
Установлено, что геном кандид содержит до 6704 генов, из которых только 1000 являются необходимыми для их выживания в стандартных лабораторных условиях [4]. Удаление до 65% генов не снижает жизнеспособности микроорганизма. Другая часть регуляторных генов работает при тех или иных определенных условиях. 2460 генов имеют прокариотическое происхождение, обнаружено 952 генов эубактериальной гомологии, 216 генов архейной гомологии [4,5].
В настоящее время на дрожжах детально изучаются генетические механизмы регулирующие аутофагию. Аутофагия индуцибель-ный процесс происходящий с участием множества генов fatg). Так, для образования аутофагосом необходима активность многочисленных белков Atg-семейства (autophago-some - related proteins) [6,7,8].
Ген APG1 Candida albicans кодирует необходимый белок, расположенный в вакуолях и участвующий при аутофагии в эндоци-тозе [9]. Инактивация генов atg 6 и Beclin 1 обуславливает прекращение аутофагии в клетке. Рядом исследователей установлено, что мутация этого гена не приводит к изменению основных фенотипических признаков у патогена (скорость роста, морфология, резистентность к антибиотикам, вирулентность) [10,11,12].
Ранее рядом авторов и нами установлено явление аутофагии у эукариотических микроорганизмов, включая кандиду. Явление аутофагии возникает при уменьшении питательных веществ в субстратах, отсутствии факторов роста, наличие в цитоплазме поврежденных органелл, частично денатурированных белков и их агрегатов или при воздействие антибиотиков [13,14,15,16].
При аутофагии цитоплазматический компонент с захваченными биомолекулами изолируется в двойную мембранную отсеку, образуя аутофагосому, и попадает в полость вакуолей. Внутренный интравакулярный пузырек (аутофагическое тело) из аутофагосо-мы поступает в полость вакуолей.
Вакуоли Candida albicans - универсальные органеллы, участвующие во многих аспектах обмена белка, клеточного гомеостаза, в процессах питания, роста и дифференциации.
Отмечается роль вакуолей в вторжения бактерий в эукариотические клетки, в стрес-соустойчивости, необходимом для выживания симбионта и обеспечивания инвазивного роста гиф, а также для предотвращения воздействия клинико-терапевтических препаратов на симбионт. [17,18,19,20].
Некоторыми исследователями изучен эн-досимбиоз бактерий внутри эукариотических микроорганизмов, что считается значительным эволюционным явлением, приведшим к адаптации прокариот в эукариотах и использовании их в качестве экологических нищ [21, 22, 23, 24]. Однако отсутствие достаточной документированной литературы о взаимодействии симбионтов, их роли в патогенезе заболеваний, побудило нас к проведению данных исследований.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ/ Нами проведено микробиологическое исследование патологического материала, полученного от больных гингивитом (30 образцов), гастритом (28 образцов), уретритом (52 образцов), кожным кандидозом и онихомикозом (22 образцов).
Культуру микроорганизмов получали посевом патологического материала на соответствующие питательные среды (МПА, кровяной агар, среда Сабуро, сахарный агар). Нативные мазки - препараты «раздавленной капли» готовили из колонии кандид, суспензированных в физиологическом растворе, покрывали покровным стеклом и микроско-
пировали с увеличением 1500 (окуляр15, объектив 100).
Препараты для электронной микроскопии готовили согласно известным протоколам [25]. Готовые препараты исследованы трансмиссивным электронным микроскопом (ТЭМ) JEM 1400 (Япония).
Идентификацию эндобактерий проводили на автоматическом микробиологическом анализаторе Biomerieux Vitek 2 (Фрaнция).
Идентификацию эндосимбионтов в клетках кандид проводили методом ПЦР и се-квенацией рибосомальных последовательностей 16S РНК и нуклеотидных последовательностей 23 S рДНК iTS (регион). С этой целью нами произведено центрифугирование образцов при 1000 об/мин. получение надо-садочной жидкости с последующим ультрацентрифугированием супернатанта с использованием фенол-хлороформа (метода Pellet). Выделяли ДНК и далее ПЦР и секвенацией определяли 23 S рДНК iTS и 16S рРНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУДЖЕНИЕ. При бактериологическом исследовании патологического материала из слизистой оболочки ротовой полости больных гингивитом были идентифицированы Candida spp. 66,7%, H.pylori 22%, Pseudomonas 6,7%; из слизистой желудка больных гастритом 67,9% Candida spp и 57,17% H.pylori; из вагиналь-
Рис. 1. Эндосимбиоз бактерий внутри грибов рода Candida. (препарат «раздавленной
капли»)
ных тампонов у больных уретритом были выделены C.albicans 41% и E.coli 54%, что указывало на симбиоз этих микроорганизмов в патогенезе заболевания. Всего было изу-ченно 168 культур грибов рода Candida.
Нами было отмечено, что при посеве грибов рода Candida на среду Сабуро сплошным газоном выяляются стерильные зоны с наличием в них мелких нехарактерных для кандид колоний. При микроскопическом исследовании этих нехарактерных для кандид колоний определены клетки кандид.
При приготовлении из данных колоний мазков «раздавленная капля» обнаруживали активное хаотичное движение неизвестных бактерий внутри вакуолей кандид, вызывающих, по нашему мнению, лизис кандид и появление стерильных зон (рис.1). Эндосим-бионты были обнаружены во всех выделенных культурах грибов рода Candida, а также в старых культурах при их хранении на твердой питательной среде, в физиологическом растворе и в дистиллированной воде, т.е. их рост не зависил от наличия питательных веществ и они интенсивно продолжали размножаться внутри клеток кандид. Не-идентифицированные бактерии размножались внутри вакуолей кандид.
Взаимоотношения неидентифицирован-ных бактерий с грибами рода Candida в препарате «раздавленной капли» наблюдали в течение определенного времени. В первые дни в клетках грибов Candida образовывалась вакуоль, а через несколько дней внутри их отчетливо наблюдались
подвижные микроорганизмы (1-2 особей) (рис.1).
Растущие и подвижные особи неизвестных бактерий фиксировались на мембране вакуоли и оболочки клетки. Находящиеся на мембране вакуолей и оболочек клеток, они хорошо видны как в окрашен-
ных, так и неокрашенных препаратах (рис.2А, «раздавленная капля»).
Рис.2. А - Эндобактерии фиксированные на мембране вакуоли и клеточной мембране (препарат «раздавленной капли»): 1- бактерия внутри вакуоли, 2-бактерии фиксированные на мембране крупной вакуоли, 3,4-бактерии фиксированные на оболочке клетки кандид; В - Тонкий срез грибов рода Candida под световым микроскопом. 1-слияние вакуолей кандид, 2-нежизнеспособные клетки, 3- «молодые» клетки.
В последующие дни число вакуолей становилось больше (2-4 и выше) и они имели разную величину, затем сливаясь друг с другом образовывали единую крупную вакуоль, охватывающую всю клетку. Формировались «пустые» нежизнеспособные клетки (рис.2 Б, тонкий срез под световым микроскопом).
По мере выхода зрелых эндосимбионтов из клеток гриба, происходят основательные
изменения в клетках-хозяина; в первую очередь нарушение целостности и прочности клеточной мембраны. Изменяются контуры клетки, возникают шаровидные сфероплас-ты. На начальных стадиях развития бактерий, не смотря на изменение в клетках грибов, они ещё сохраняют жизнеспособность и могут размножаться. При этом эндобактерии передаются дочерним клеткам через вакуоли.
ЯШ тж ш HI
а. 6. в.
0 ' яВЯ^ЯШ jO
Рис.3. Выход эндобактерий из дрожжевых клеток (разные штамы грибов рода
Candida). ЭБ-эндобактерия
Рис.4. Последовательное увеличение эндосимбионтов в препарате «раздавленная
капля» (срок наблюдения - 30 дней)
Конечный результат развития эндосим-бионтов в клетках хозяина - это разрушенные остатки кандид, которые используются как питательная среда. При этом число клеток кандид уменьшается, а эндобактерий становится всё больше и больше (рис.4).
Таким образом, микроскопические исследования показали соотвестствующие изменения формы и размеров клеток кандид, а также их гибель, обусловленную эндосим-биозом бактерий.
Для подтверждения полученных результатов провели электронное микроскопирова-ние. Полученные данные подтвердили наши предположения. Размножение эндобактерий вызывает значительные изменения в клетках
Candida. Прежде всего наблюдается изменение пространственной реорганизации органелл с последующим образованием гомогенной структуры. По мере размножения бактерий и выхода их из клетки электронноплотная гомогенная структура кандид становится всё менее плотной. При выходе бактерий из клетки нарушается целостность клеточной стенки.
На рисунке 5 представлено электронно-микроскопическое изображение клеток грибов рода Candida и паразитирующих эндобактерий, выходящих из клетки кандиды. При этом происходит нарушение целостности клеточной стенки кандид.
А.
Г.
Рис.2.Электронно-микроскопическое изображение эндосимбионта. А-изображение двух эндобактерий внутри клетки кандиды; Б- фрагмент кандиды с 2-я эндобактериями; В и Г выход эндобактерий из кандида-клетки. (ЭБ-эндобактерия)
Оптическая и электронная микроскопия культуры гибов рода Candida показали изменения эукариотической клетки при размножении в них эндобактерий.
Следующим этапом исследований была идентификация бактерий- симбионтов, которые при посеве на питательные среды не давали роста. При исследовании эндосимбион-тов в 20-ти культурах грибов рода Candida, выделенных из различных биотопов, на анализаторе Vitek 2, в 10-ти (50%) культурах были идентифицированы Pseudomonas fluo-rescens, E.coli, Acinetobacter haemalyticus, Sphingomonas paucimobilis и Pasteurella pneumotropica. В 10-ти культурах грибов ро-
да кандид эндобактерии не идентифицированы. В некоторых культурах кандид идентифицированы ассоциации бактерий E.coli и Pseudomonas fluorescens, в двух культурах Pseudomonas fluorescens и Acinetobacter hae-malyticus, в одной E.coli и Pasteurella pneumotropica (Таблица 1).
Таким образом, на анализаторе Vitek 2 были идентифицированы эндосимбиотиче-ские бактерии, которые при последующих посевах на соответствующие селективные питательные среды не давали роста. Установлена ассоциация между грибами рода Candida и бактериями рода Pseudomonas, Escherichia, Sphingomonas, Acinetobacter, Pas-
teurella, которые могли выжить в вакуолях эукариотических клеток Candida, защищаясь от экологических стрессов или иммунной
системы хозяина и способствовать распространению бактерий в окружающей среде и внутри человеческой популяции.
Таблица 1. Идентификация культур рода candid и их эндосимбионтов (данные аппарата Vitek)
Патологический материал Номера штаммов Грибов рода Candida Идентифицированные грибы рода Candida Идентифицированные эндобактерии
Слюна 26 C.albicans H.pylori
Тампон из зев 2 C.albicans неидентифицировано
Тампон из зев 10 C.albicans неидентифицировано
Тампон из зев 11 C.tropicalis Sphingomonas paucimobilis
Тампон из зев 12 Candida spp. Sphingomonas paucimobilis
Тампон из зев 13 C.albicans E.coli Pasteurella pneumotropica
Тампон из зев 19 Candida spp. неидентифицировано
Тампон из зев 7 C.albicans E.coli
Макрота 6 C.albicans неидентифицировано
Макрота 14 Candida spp. Pseudomonas fluorescens Acinetobacter haemalyticus
Макрота 18 C.albicans E.coli Pseudomonas fluorescens
Фекалий 8 C.krusei неидентифицировано
Фекалий 9 C.albicans неидентифицировано
Фекалий 23 C.albicans Sphingomonas paucimobilis
Фекалий 24 C.albicans Sphingomonas paucimobilis
Вагинальный 1 C.dubliniensis E.coli
тампон Pseudomonas fluorescens
Вагинальный 3 C.albicans неидентифицировано
тампон
Вагинальный 5 C.albicans E.coli
тампон
Вагинальный 17 C.albicans неидентифицировано
тампон
Соскоб из ногтей 4 C.albicans Pseudomonas fluorescens Acinetobacter haemalyticus
Зубной налёт 28 C.albicans H.pylori
Дрожжи 25 Saccharomyces cere-visae неидентифицировано
Таблица 2. Результаты секвенирования генома микроорганизмов рода candida и их эндобактерий ___
Культура выделенная из Номера штаммов^ andida) iTS последовательности (2316S рДНК) 16S рРНК (rrs)
Вагинального 1 Candida dubliniensis Pseudomonas psychrotolerans
тампона
Вагинального 5 Candida albicans Pseudomonas psychrotolerans
тампона
Зева 7 Candida albicans Pseudomonas psychrotolerans
Фекалий 9 Candida albicans Pseudomonas psychrotolerans
Макроты 18 Candida albicans Pseudomonas psychrotolerans
Для подтверждения полученных данных методом молекулярного типирования проводили идентификацию эндосимбионтов. С этой целью ПЦР и секвенированием гена 16S РНК (rrs) и нуклеотидной последовательности между 16S - и 23рДНК (ÎTS регионы) было исследовано 14 культур грибов рода Candida, из которых в 5 культурах идентифицированы Pseudomonas psychrotolerans (97% гомологии). Анализ ДНК по данным ген банка представлен в таблице 2.
Было установлено, что у одних и тех же больных при различных патологиях, обусловленных C.albicans экспрессируются гены, кодирующие факторы патогенности эн-досимбионта с грибами рода Candida.
Грибы рода Candida являются патогенами и транзиторными микроорганизмами представляют экологическую нищу для ряда бактерий Pseudomonas fluorescens, E.coli, Acinetobacter haemalyticus, Sphingomonas paucimobilis и Pasteurella pneumotropica, Pseudomonas psychrotolerans. Наличие патогенетического эндосимбиоза между грибами и эндобактериями соответственно подтверждается выделением их в 80-90% случаев.
Располагаясь внутри кандид, бактерии приобретают устойчивость к измененным условиям среды (кислотность, желчные детергенты, температурные и др. стрессовые факторы).
Таким образом, внутриклеточный симбиоз прокариот внутри эукариот представляет собой эволюционное явление, обуславливающее адаптацию прокариот в экологических нищах, защиту от иммунной системы хозяина, стрессо- и антибиотикоустойчивость с последующим размножением и сохранением в течение длительного времени, а также передачей к новому хозяину. Всё это будет способствовать распространению бактерий в внешней среде и в человеческой популяции.
ЛИТЕРАТУРА
1.Melphine M., Harriott M., Noverr C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistence // Antimicrob. Agents Chemother, 2009, vol.53, з.3914-3922
2.Гурова М.М., Новикова В.П. Факторы, влияющие на антифунгальную резистент-
ность у детей с хроническими гастродуоде-нитами // Проб.Мед.Микол., 2010, №4, с.10-13.
3.Almirante B., Rodriguez D., Park B.J. et al. Epidemiology and predictors of mortality in cases of Candida bloodstream infection: results from population-based surveillance, Barselona, Spain, from 2002-2003 // J.Clin/Microbiol., 2005, vol.43, p.1829-1835
4. Maureen E.H. The Chemical Genomic Portrait of Yeast: Uncovering a Phenotype for All Genes // Science, 2008, vol. 320, p. 362365.
5.Cotton G.A., Mclnerney G.O. Eukaryotic genes of archaebacterial origin are more important than the more numerous eubacterial genes, irrespective of function // PNAS, 2010, vol.107, p.17252-17255
6.Boland B., Kumar A., Lee S. et all, Au-tophgy induction and autophagosome clearance in Neurons: Relationship to autophagic patologi in Alzheimer's disease // Nixon R.J.Neurosci, 2009, vol.28(27), p.6926-6937
7.Thumm M, Egner R, Koch B, Schlump-berger M, Straub M, Veenhuis M, Wolf D H. Isolation of autophagocytosis mutants of Saccharomyces cerevisiae // FEBS Lett., 1994, vol.349, p.275-280.
8.Tsukada M., Ohsumi Y. Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of Saccharomyces cerevisiae // FEBS Lett., 1993, vol.333, p.169-174.
9. Veses V., Casanova M., Murgui A. et al. Candida albicans ABG1 gene is involved in en-docytosis // FEMS Yeast Res., 2009, vol.9, p.293-300.
10.Backer J.M. The reguation and function of Class III PI3Ks: novel roles for Vps34 // Biochem J., 2008, vol.410, p.1-17.
11. Mizushima N. Autophagy: process and function // Genes Dev., 2007, vol.21, p.2861-2873.
12. Xie Z., Klionsky D.J. Autophagosome formation: core machinery and adaptations // Nat Cell Biol., 2007, vol.9, p.1102-1109.
13. Abeliovich H., KlionskyDJ. Autophagy in yeast: mechanistic insight and physiological function // Microbiol.Mol.Biol.Rev., 2001, vol.63, p.463-479.
14.Clark S.L. Cellular differentiation in the kidneys of newborn mise studied with the elec-
tron microscope // J.Biophys.Biochem.Cytol., 1957, vol.3, p.349-360.
15. Dunn W.A.,Jr studies on the mechanisms of autophagy: formation of the autophagic vacuole // J.Cell Biol., 1990, vol.110, p.1923-1933.
16. Horst M., Knecht E.C., Schu P.V. Immport into and degradation of cytosolic proteins by isolated yeast vacuoles // Mol.Biol.Cell.,1999, vol.10, p.2879-2889.
17. Johnston D.A., Eberle K.E., Sturtevant J.E., Palmer G.E. Role for endosomal and vacuolar GTPases in Candida albicans patogenesis // Infect Immun., 2009, vol.77(6), p.2343-55
18.Simon L., Bousquet J., Levesque R.C., Lalonde M. Origin and diversification of en-domycorrhizal fuhgi and coincidence with vascular land plants // Nature, 1993, vol.363, p.67-69.
19.Biancotto V., Bandi C., Minerdi D. et al. An obligately endosymbiotic mycorrhizal fungus itself harbors obligately intracellular bacteria // Appl Environ Microbiol., 1996, vol.62, p.3005-3010.
20. MacDonald R.M., Chandler M.R., Mosse B. The occurrence of bacterium-like orqanelles in vesicular- arbascular mycorizal fungi // New Phytol., 1982, vol.90, p.659-663.
21.Siavoshi F., Saniee P. Vacuoles of Candida yeast as a specialized niche for Helicobacter pylori // World J.Gastroenterol, 2014, vol.20 (18), p.5263-5273.
22. Dubois A., Boren T. Helicobacter pylori is invasive and it may be a facultative intracellu-lar orqanism // Cell Microbiol., 2007, vol.9, p. 1108-1116.
23. Petersen A.M., Krogfelt K.A. Helicobacter pylori: fn invading microorganism? // FEMS immunol Med.Microbiol., 2003, vol.36, p.117-126.
24. Chu Y.T., Wang Y.H., Wu J.J., Lei H.Y. Invasion and multiplication of Helicobacter pylori in gastric epithelial cells and implications
for antibiotic resistance // Infect.Immun., 2010, vol.78, p.4157-4165.
25. Staniszewska M., Bondaryk M., Siennicka K., Kurzatkowski W. Ultrastructure of Candida albicans pleomorphic forms: phase-contrast microskopy, skanning and transmission electron microscopy // Polich Jurnal of Microbiology, 2012, vol.61, p.129-135
SUMMARY
Bacterial endosymbiosis with eukaryotes in
the evolution of bacteria
E.M.Agayeva, S.A.Muradova, Z.O.Karayev
Azerbaijan medical university, Baku
It was determined light and electron microscopy endosymbiosis of bacteria to fungi of the genus Candida. On Analyzer Biomerieux Vitek identified microorganisms of the genus Candida (C.albicans, C.kruseii, C.dubliniensis, C.) and endosymbionts (Pseudomonas, Escherichia, Sphingo-monas, Acinetobacter, Pasteurella). Established an association between fungi of the genus Candida and endosymbionts. PCR and sequencing of 16S RNA gene (rrs) and the nu-cleotide sequence between the 16S - and 23rDNK (iTS regions) was studied 14 cultures of fungi Candida, of which 5 are identified cultures Pseudomonas psychrotolerans (97% ho-mology). In the same patients with different pathologies caused by C. albicans former pressi-ruyutsya endosymbiont genes. Thus, intracellu-lar symbiosis of prokaryotes in eukaryotes is an evolutionary phenomenon for causing environmental adaptation in prokaryotes nischah, protected from the host immune system stressors and antibiotic with after-blowing reproduction and preservation for a long time, as well as the transfer to the new owner. _Поступила: 19.11.2016
