CC BY
26
Микроскопические особенности взаимодействия эндобактерий и Candida spp.
Мурадова С.А., Караев З.О., Курбанов А.И., Гурбанова С.Ф.
Азербайджанский медицинский университет, Баку
Muradova S.A., Qarayev Z.O., Kurbanov A.I., Qurbanova S.F
Azerbaijan Medical University, Baku
Microscopic peculiarities of interaction between endobacterias and Candida spp.
Резюме. Представлены причины возникновения участков лизиса на поверхности пленки, образуемой грибами рода Candida на среде Сабуро. Было установлено, что причиной лизиса являются эндобак-терии, существующие внутри клеток Candida. Были изучены изменения, происходящие в эукарио-тических клетках, вызванные эндобактериями в грибах Candida, в препарате«раздавленная капля». Ключевые слова: Candida, эндобактерии, эукариотические клетки, симбиоз. Summary. The causes of lysis spots appearing on the mold formed by Candida fungus on the surface of the Sabouraud agar were imvestigated in this research. It was found that the lysis was caused by endobacteria. The results of the experiment aimed at researching the effect caused by the bacteria parasiting on eycariotic cells have been presented in "press drop method". Keywords: Candida, endobacteria, eucariotic cells, symbiosis
При посеве «газоном» на питательной среде Сабуро у некоторых штаммов Candida albicans наблюдались негативные колонии - стерильные зоны лизиса. При изучении этого феномена выяснилось, что лизис клеток грибов рода C. albicans связан с бактериями, которые находятся внутри клетки и по мере размножения и выхода, подвергают клетку-хозяина значительным структурным изменениям, приводящим к гибели. Жизненный цикл этих бактерий представлен двумя стадиями: первая - активно-подвижная, вторая - состояние покоя (в виде сферобласта) подобно бделловибрионам.
Исходя из выше изложенного, вначале эти неизвестные бактерии были представлены нами как бдел-ловибрио-ноподобные [1-5]. Но дальнейшие наблюдения показали, что эти бактерии находятся не в периплазматическом пространстве, как бделловибрионы и подобные им организмы, а располагаются в вакуолях клеток, и не вызывают гибель своих жертв, подобно бделловибрионам [6]. Обнаружение неизвестных бактерий у многих штаммов С. albicans, да и в целом у других видов грибов рода Candida (С. kruseii, С. dubliniensis, С. tropicalis, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. inconspicua,
C. glabrata, Stephanoascus ciferrii и т.д.), выделенных из патологических материалов пациентов, а также лабораторных штаммов С. albicans РКПГУ-401/885-653, С. glabrata РКПГУ-1188, С. krusei РКПГУ-526, С. tropicalis РКПГУ-531, позволило отнести их к эндобактериям. Как оказалось, эти бактерии находятся во всех (100%) штаммах и видах грибов рода Candida.
В научной литературе нет сведений о взаимоотношении эндобакте-рий и дрожжевых и дрожжеподобных грибов. Предположительно, отношения между этими микроорганизмами могут быть примером новой формы симбиоза. Структурные изменения, происходящие в дрожжевых клетках, ассоциированные с деятельностью эндобактерий, не могут не влиять на свойства последних (вирулентность, резистентность, анти-биотикочувствительность и т.д.).
Учитывая наблюдаемый в процессе исследования лизис клеток-хозяев, вызванный обнаружением внутри эндобактерий, авторы статьи представили микроскопические данные нативных препаратов, подтверждающие существование эндобактерий внутри вакуолей Candida spp., что может представлять интерес с точки зрения лечения и профилактики кандидоза.
Культуры грибов были выделены из патологического материала, взя-
того из различных биотопов (пищеварительный тракт, вагинальное отделяемое, дыхательные пути, кожа и ее придатки). Штаммы, полученные от больных (25 штаммов) идентифицированы как С. albicans (16 штаммов), С. dubliniensis (6 штаммов), C. glabrata (3 штаммов). [рибы культивировали на среде Сабуро при 37 °С, затем из культуры готовили суспензию в 0,85% NaCl, выдерживали при комнатной температуре. Препараты «раздавленная капля» готовили как непосредственно из культуры грибов, так и из суспензии. Готовые препараты наблюдали в световом бинокулярном микроскопе XSZ-N107 в течение длительного времени (больше 1 месяца) при увеличении х1000 и х1500.
При микроскопическом изучении нативных препаратов внутри клеток грибов обнаруживаются вакуоли разного размера и в разном количестве (1-5 вакуолей). На рис. 1 представлены изменения, происходящие в течение первых 7 дней у различных штаммов Candida spp.
При выходе эндобактерий, размножающихся внутри грибов, наблюдаются основательные изменения в морфологии клеток Candida spp. (рис. 2). Увеличение размера вакуолей, образующихся внутри клеток грибов, их слияние в одну крупную, занимающую все внутреннее пространство клетки, способству-
Рисунок 1
Эндобактерии внутри вакуоли клеток Candida spp. (ув. х1500):
a-и - внутриклеточные вакуоли разного размера, a-д - подвижные внутри
вакуолей эндобактерии, ж-и - эндобактерии, расположенные на мембране
вакуоли
BESSES Изменения, происходящие в мембране и внутри клеток грибов Candida в результате размножения эндобактерий: a-в - ув. х1500, г-д - ув. x1000
§|j ¡¡¡Й о ШШ) ■ i ■
а б в г д
ют изменению морфологии клетки (сферизация, увеличение размера и т.д.), что придает клеткам визуальную пустоту.
Эндобактерии, пытающиеся покинуть клетку-хозяина, оказывают воздействие также и на мембрану клеток, что проявляется нарушением целостности клеточной оболочки, уплотнений в различных участках, впячиваний или выпячиваний (см. рис. 2).
В дальнейшем наблюдается разрушение этих клеток. В исследуе-
мых препаратах можно обнаружить как разрушенные клетки грибов и их остатки, так и эндобактерии, рассеянные среди этих остатков, в виде неподвижной сферобластной формы (рис. 3).
После того как эндобактерии покидают клетки Candida, начинается вторая внеклеточная стадия их жизненного цикла. Их размеры очень малы, приблизительно 2,18х1,36-1,84х1,45 ^м. Эндобактерии активно двигаются во внеклеточной среде.
Рисунок 3
Влияние эндобактерий на клетки Candida (ув. х1000): а - разрушающиеся клетки грибов Candida spp., заполненные эндобактериями, б - уменьшение количества клеток Candida spp. при разрушении, в - многочисленные эндобактерии, единичные и разрушенные клетки грибов
—Щ-^^—
Я • :Ф
. 0 .
, ф т
а
Рисунок 4
Появление эндобактерий на клетке Candida и вне клетки: а - вакуоли, сформированные в клетках Candida, и эндобактерии внутри и на мембране клеток (ув. х1000), б-в - эндобактерии снаружи клеток, уменьшение количества клеток Candida (ув. х1500)_
Затем прикрепляются к поверхности предметного стекла, ограничиваются в движении и полностью теряют подвижность. При этом меняется их форма, они превращаются в сфе-робласты, количество которых увеличивается в последующие сутки (рис. 4). Размеры сферобластов варьируют у различных штаммов Candida в пределах 01,39-0,55 pm. Количественное увеличение внеклеточных (сферобластных) форм сопровождается резким уменьшением количества клеток грибов.
Размножение эндобактерий сопровождается разрушением кле-
ток грибов и их выходом (рис. 5). Остатки разрушенных клеток можно наблюдать некоторое время, но постепенно они исчезают и сохраняются в основном сферобластные формы эндобактерий, а иногда и их подвижные формы. На рисунке 5 изображена картина микроскопического исследования нативного препарата, который наблюдали в течение долгого времени (1 месяц).
Проведенное исследование подтверждает существование феномена эндобионта у грибов рода Candida. Эндосимбионты «образуются» внутри вакуолей и размно-
Рисунок 5 Размноженные эндобактерии, рассыпанные после разрушения клеток Candida spp.: a-б - уменьшение количества жизнеспособных и увеличение разрушенных и разрушающихся клеток грибов (ув. х1000), в-г - полное исчезновение клеток грибов, сферобластные формы эндобактерий (ув. х1500)
' Ш. <г& Л МШ Ш .: ' ■ ; •"¿4?! *Г'Л : • ЩМ " ШЙ: 8 • .-о.
| а б в г
жаются. Существует корреляция между образованием вакуолей и обнаружением эндобактерий. Так, в первые дни культивации внутри клеток Candida, имеющих маленькие размеры и едва видимые вакуоли, эндобактерии не видны, однако их можно наблюдать внутри более крупных вакуолей. И если в первые сутки инкубации эндобактерии можно было увидеть только внутри единичных клеток грибов, то в последующие сутки они были заметны внутри большего количества клеток. В случае обнаружения из сотни клеток грибов в 2-4-суточных культурах приблизительно до 10% подвижных эндобактерий внутри вакуолей, то это количество увеличивалось в течение всего времени наблюдения (20 суток) и охватывало еще большее количество клеток (около 40%).
В первые дни количество эндо-бактерий было единичным, в последующие же дни можно было наблюдать по 2-3 клетки внутри одной вакуоли. Постепенно размножающие эндобактерии, увеличиваясь в раз-
мерах, покидают клетки, и этот процесс продолжается вплоть до гибели клетки гриба. Крупные размеры эн-добактерий позволили видеть их под световым микроскопом (х1000).
Интересно, что обнаружение эн-добактерий зависит от среды обитания грибов Candida (от состояния внутренней среды макроорганизма, состава питательной среды, сроков и условий хранения и т.д.). Описанные выше процессы лучше всего наблюдались в ослабленных клетках грибов. Например, эти процессы лучше всего наблюдались в периодической культуре в конце экспоненциальной фазы. Данные процессы не наблюдались в часто обновляемых питательных средах, а также в непрерывных культурах. Образование эндобакте-рий также ускоряется при культивировании грибов рода Candida на неприемлемой питательной среде (мя-со-пептонный агар, мясо-пептонный бульон и др.), также на среде Сабуро с добавлением антифунгальных препаратов. Росту эндобактерий не способны препятствовать даже сильно
кислотные и сильно щелочные pH среды. Таким образом, пищевые потребности эндобактерий обеспечиваются за счет эукариотических клеток, а факторы, замедляющие рост клеток грибов, ускоряют размножение эндобактерий.
В естественных условиях существует облигатный симбиоз клеток грибов с бактериями или другими микроорганизмами. Часто такой симбиоз встречается у везикуляр-но-арбускулярных микоризных грибов [7, 8]. При изучении электронно-микроскопических особенностей у ряда плесневых грибов внутри их спор были выявлены «бактериепо-добные органеллы» [9-12]. Изучение неизвестных структур на морфологическом и на молекулярном уровнях подтвердило их принадлежность к бактериям [13]. Немецкие ботаники H. Gehrig и соавт. указывали на эн-досимбиоз цианобактерий и грибов Geoscphon puriforme, обитающих на поверхности влажных почв [14]. Было установлено наличие эндобактерий у 6 видов семейства Gigasporaceae [15]. С целью определения принадлежности эндосимбионтов грибов была выяснена последовательность рибосомальной РНК 16S, выделенных из видов Scutellospora percica, Scutellospora castanea и Gigaspora margarita. Результаты анализа позволили установить сродство эндо-симбионтов с представителями рода
Burkholderia. Также было показано отсутствие спорадического феномена эндобактерий внутри образцов грибов [15].
Однако в современной научной литературе нет данных, касающихся паразитирования эндобактерий внутри грибов Candida. Но некоторыми исследователями [16-18] описаны подвижные бактерии внутри грибов рода Candida. Они показали принадлежность этих бактерий к H. pylori из-за общности в последовательности нуклеотидов рРНК 16S. Тесная связь между этими микроорганизмами объясняется феноменом эволюции. Так, грибы рода Candida, встречаемые в полости рта, являются резервуаром для H. pylori, а их сохранение, персистенция в организме (в полости рта) показаны как причина реинокуляции в желудок и распространения среди людей. Также указывается, что H. pyloriпре-дохраняется от стресса и действия антибиотиков внутри вакуоли, образуемой в грибах Candida.
Причина такого взаимодействия бактерий и грибов не столь ясна, а имеющихся данных очень мало и они противоречивы. Так, в научных исследованиях использование в качестве источника питания вакуолей грибов эндобактериями [19], их выживание в неблагоприятных условиях [17], рассматривается как первый шаг в процессе возникновения рас-
тительного мира в результате эволюции [14].
Как было указано выше, существует зависимость между образованием вакуолей и обнаружением эн-добактерий. Однако происходящая деградация эукариотической клетки обусловливается формированием вакуоли и указывается на существенность этой вакуолезависимой деградации в процессе аутофагии [20]. Указывается также, что образуемая внутри C. albicans вакуоль играет решающую роль в формировании стрессоустойчивости, в поляризованном увеличении гифов, вирулентности и патогенности, которые имеют место быть в переделах организма хозяина, где размножается условно-патогенные грибы [21-24].
Таким образом, проведенные наблюдения доказывают существование эндобактерий у дрожжевых и дрожжеподобных грибов, что при нехватке питательного вещества заканчивается для грибов гибелью вследствие происходящих в них изменений.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Мурадова С.А., Курбанов А.И. // Проблемы медицинской микологии. - 2009. - Т.11, №2. - С.99.
2. Muradova S., GurbanovA. // The 3rd Eurasia congress of infectious diseases. - Baku, 2009. - Р.188.
3. Muradova S.A., GaraevZ.O., GurbanovA.I. // European Intern. J. Science and Technology. - 2015. -Vol.4, №4. - P.65-70.
4. Мурадова С.А., Караев З.О, Курбанов А.И, Гурбанова С.Ф. // Материалы 3-го международного микологического форума. - М., 2015. - С.77-79.
5. Muradova S.A. // The reports of ANAS. - 2015. -Vol.LXXI, N1. - P.112-115.
6. Определитель бактерий Берджи. - М., 1997. -Т.1. - С.43-44.
7. Kobayashi DY, Crouch J.A. // Ann. Rev. Phyto-pathol. - 2009. - Vol.47. - Р.63-82.
8. Frey-Klett P., Burlinson P., Deveau A,, et al. // Microb. Mol. Biol. Rew. - 2011. - Vol.75, N4. -Р.583-609.
9. Bonfante P., Balestrini R, Mendgen K. // New. Phytol. - 1994. - Vol.128. - Р.93-101.
10. MacDonald R.M., Chandler MR // New Phytol. -1981. - Vol.89. - Р.241-246.
11. Mosse B. // Arch. Microbiol. - 1970. - Vol.74. -Р.146-159.
12. Margulis L, Fester R, Scannerini S, Bonfante P. MIT Press. - Cambridge. - 1991. - Р.273-287.
13. Bianciotto V, Bandi C, Mined D, et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1996. - Vol.62. - Р.3005-3010.
14. Gehrig H.,Schussler A, Kluge M. // J. Mol. Evol. - 1996. - Vol.43, N1. - Р.71-81.
15. Bianciotto V, Lumini E, Lanfranco L, et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol.66, N10. -Р.4503-4509.
16. Salmanian A.H., SiavoshiIF, AkbariF, AfshariA,, Malekzadeh R. // J. Oral Pathol. Med. - 2008. -Vol.37, N6. - Р.324-328.
17. SiavoshiF, Saniee P. // World J. Gastroenterol. -2014. - Vol.10, N18. - Р.5263-5273.
18. Saniee P., Siavoshi F, Nikbakht B.G., et al. // Archives of Iranian Medicine. - 2013. - Vol.12. -Р.705-710.
19. Bianciotto V, Genre A, Jargeat P., et al. // Appl. Environ. Micribiol. - 2004. - Vol.70. - Р.3600-3608.
20. Palmer G.E., Kelly M.N, Sturtevant J.E. // Microbiology. - 2007. - Vol.153, N1. - Р.51-58.
21. Johnston D.A., Eberle K.E., Sturtevant J.E, Palmer G.E. // Infect. Immun. - 2009. - Vol.77. -Р.2343-2355.
22. Palmer G.E, Cashmore A, Sturtevant J.E. // Eu-kariot Cell. - 2003. - Vol.2. - Р.411-421.
23. Palmer G.E, Kelly M.N, Sturtevant J.E. // Eu-kariot Cell. - 2005. - Vol.4. - Р.1677-1686.
24. Palmer G.E. // Commun. Integr. Biol. - 2011. -Vol.4, N2. - Р.240-242.
Поступила 11.07.2017 г.
