CC BY
45
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 579.262/574.38
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СООБЩЕСТВА ФИОЛЕТОВЫХ ПЯТЕН, ОБНАРУЖЕННЫХ В КРУГОВОМ МАВЗОЛЕЕ РИМСКОГО НЕКРОПОЛЯ ГОРОДА КАРМОНА (ИСПАНИЯ)
Е. В. Акатова, С.Сайс-Хименас, В.Хурадо
Гробницы некрополя были вырыты в пористой скалистой породе в I-IIs. н.э., а в результате раскопок - открыты воздействию окружающей среды. Это способствует колонизации поверхностей стен различными микроорганизмами, что приводит к их биодеградации. В гробнице Круговой Мавзолей такая биодеградация, вызванная развитием микроорганизмов, видна наиболее ярко. Пятна различного цвета, включая фиолетовые, покрывают поверхности стен. Целью этого исследования является молеку-лярно-биологический анализ микробного сообщества, развивающегося в фиолетовых пятнах в гробнице Круговой Мавзолей.
Ключевые слова: биодеградация памятников культуры, сообщество микроорганизмов, молекулярные методы.
1. Введение
Некрополь города Кармона (Испания)считают одним из наиболее крупных римских погребальных мест за пределами Рима, а на Пиренейском полуостровеэто один из наиболее хорошо сохранившихся римских некрополей 1-2 века н.э.(рис. 1).Некрополь включает около 600 подземных гробниц, хотя в настоящее время все усилия направлены на сохранение и реставрацию отрытых гробниц, чем на раскопки новых. Гробницы выкопаны в скалистой породе,отнесенной к известняковым биокластовым песчаникам [12], довольно пористой породе подверженной выветриванию и процессам микрокарстификации [4].
Круговой Мавзолей это коллективная гробница, датированная I веком н.э. Стены и потолок были оштукатурены, однако до наших дней штукатурка сохранилась не на всех поверхностях (рис. 2). В связи с высокой пористостью оголенной породы на стены гробницы легко адсорбируются микроорганизмы, дающие начало различным сообществам. В основном в гробнице наблюдается обильное развитие фототрофных сообществ, визуально заметных из-за образования зеленых пятен. Однако, только в этой гробнице были обнаружены фиолетовые пятна. Целью этого исследования является анализ микробного сообщества, развивающегося в фиолетовых пятнах, молекулярно-биологическими методами и оценка их влияние на гробницу.
Молекулярно-биологические методы, основанные на ДНК, позволяют обнаружить микроорганизмы in situ без предварительного выращивания их на специфических культуральных средах [8, 22]. Таким
образом, молекулярные методы представляют сильный инструмент для обнаружения микроорганизмов в сложных природных образцах, а также для идентификации культивируемых микроорганизмов. Кроме того, использование для изучения сложных природных образцов молекулярных методов, основанных на РНК, дает возможность обнаружить и проанализировать часть микроорганизмов активно вовлеченных в развитие микробных колоний. Комбинация этих двух методов поможет лучше оценить потенциальную роль и воздействие специфических микроорганизмов на процессы биодеградации в гробницах некрополя города Кармона (Севилья, Испания).
Рис. 1. Географическое расположение города Кармона (а); круговой мавзолей, внутренняя камера (б)
2. Материалы и методы
2.1 Отбор образцов
Образцы отбирали с фиолетовых пятен, обнаруженных на стенах гробницыКругового Мавзолея, используя стерильный шпатель, в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Некоторые образцы были отобраны в несколько пробирок, так чтобы в дальнейшем использовать весь образец для извлечения ДНК или РНК. В случае образцов, отобранных для извлечения РНК, использовались стерильные микроцентрифужные пробирки с 1 мл раствора ARNlater® (Ambion, Foster City, Калифорния, США), который предохраняет РНК от деградации РНКазами.
2.2 Выделение нуклеиновых кислот
Выделение геномной ДНК организмов, присутствующих в отобранных образцах, осуществляли, используя коммерческий kit "NúcleoSpin Food DNA" (Macherey-Nagel, Дюрен, Германия) и следуя протоколу, рекомендуемому изготовителем. Выделенную ДНК хранили при 40C.
Выделение РНК из организмов, присутствующих в исследуемых образцах, осуществляли, используя kit "Total RNAqueous-4PCR" (Ambion, Фостер Сити, США) и следуя рекомендованному изготовителем протоколу. Этот протокол включал обработку образцов ДНКазой 1и синтез ДНК комплементарной РНК (кДНК) в течение часа при 55°C, используя обратную транскриптазу ThermoScript (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и 16SрРНK ген-специфический праймер 518R (5' -ATTACCGCGGCTGCTGG). Чтобы убедится в том, что выделенная РНК свободна от ДНК, использовали контроль прошедший все этапы, но без добавления обратной транскриптазы.
2.3 Амплификация ДНК
Амплификацию фрагментов 16SрРНK бактерий проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя амплификатор GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer). Для амплификации в качестве матрицы использовали кДНК или ДНК выделенную непосредственно из образцов и соответствующую пару праймеров: для кДНК - 518R и 616F (5'
- AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG)[7], для ДНК - 616F и 907R (5' - CCC CGT CAA TTC ATT TGA GTT T). Для амплификации фрагментов 16SрРНK актиномицетов использовали специфические праймеры StrepF (5'
- ACGTGTGCAGCCCAAGACA) и StrepB (5' -ACAAGCCCTGGAAACGGGGT). В качестве ДНК полимеразы использовали ExTaq (Takara, Сига,Япония). Программа для амплификации включала следующие этапы: 2 мин при 95 °C; затем 35 циклов 15 с при 95 °C, 15 с при 55 °C и 2 мин при 72 °C; 10 мин при 72 °C.
2.4 Электрофорез в полиакриламидном геле с градиентом денатурации
Молекулярный профиль бактериальных сообществ анализируемых образцов был получен с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с градиентом денатурации (ДГГЭ) следуя методу описанному ранее [7, 18]. Для получения молекулярных профилей сообществ амплифицированные фрагменты 16SрРНK генов подвергались второй амплификации с праймерами 518Rи 341F-GC (5'-CCTACGGGAGGCAGCAGс богатой GCобластью на 5'-конце)[7, 18]. Условия амплификации были такими же, как описано выше за исключением времени роста цепи, которая, в данном случае, составляла 30 с.
Для сравнения длины миграции отдельных полос в различных гелях использовали маркеры миграции, состоящие из смеси ПЦР продуктов,
полученных с теми же праймерами и ДНК, выделенной roPseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Paenibacillus sp. и Streptomyces caviscabies.
2.5 Клонирование и идентификация микроорганизмов
Смесь амплифицированных фрагментов 16SрРНК генов были очищены с помощью коммерческого kit «Jetquick PCR purification Spin Kit» (Genomed, Лоне, Германия)и клонированы, используя коммерческий kit"TOPOTA® Cloning Kit for Secuencing" (Invitrogen, Карлсбад, США), согласно рекомендациям изготовителей. Отбор клонов, полученных генотек, проводил с помощью метода описанного Гонзалес [7].Клонированные последовательности из отобранных клонов были секвенированы,используя капиллярный секвенатор модели ABI 3700 и kit "ABI PRISM® dye terminator sequencing core kit" (Applied Biosystems, Foster City, США), в Центре Биологических Исследований (CIB, CSIC, Мадрид, Испания).
2.6 Анализ секвенированных последовательностей
Нуклеотидные последовательности, полученные после
секвенирования, обрабатывали вручную с помощью программы Chromas v1.45 (www.technelysium.com.au/chromas.html). Последовательности гомологичные полученным находили, используя алгоритм Бласт (BLAST) [3]доступный в NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ последовательностей включал группировку в Оперативные Таксономические Единицы (ОТЕ), используя как критерий объединения сходство между последовательностями более чем 95 %, другими словами группировали на уровне рода[17, 19].
2.7 Статистическая обработка результатов
Метод разрежения [11] применяли для оценки разнообразия групп микроорганизмов в изучаемых образцах. В результате этого метода можно получить кривую разрежения, для построения которой использовали программу «ANALYTIC RAREFACTION 1.3»
(www.uga.edu/~strata/software/index.html) [13]. Для сравнения молекулярных профилей сообществ строили дендрограммы, используя алгоритм UPGMA[6, 21] и программу "PAST 1.89" (http://folk.uio.no/ohammer/past/). Сходство между ДГГЭ профилями оценивали, используя коэффициент Дайса.
3. Результаты
Изучение бактериальных сообществ в отобранных образцах фиолетовых пятен проводили посредством получения молекулярных профилей методом ДГГЭ, а также использовали результаты анализа 16S рДНК и рРНК генотек(только для двух образцовЕ5, отобранного со стены при входе в гробницу, и I9, отобранного со стены напротив входа в гробницу). Полученные для двух образцов последовательности 16SрРНК
генов были внесены в ДНК базы данных ^N297874 - БШ97916, Б№98134 - Б№98138).
3.1. Сравнение молекулярных профилей бактериальных сообществ из образцов фиолетовых пятен, отобранных со стен Кругового Мавзолея
На рис.2представлены молекулярные профили анализируемых сообществ в отобранных образцах(рис. 2, а) и сравнение этих профилей, представленное в виде ЦРОМЛ дендрограммы (рис. 2, б). В результате сравнения молекулярных профилей сообществ исследуемых образцов выявили достаточно высокое сходство между ними. Также, в молекулярных профилях можно видеть одну интенсивно окрашенную полосу, которая мигрирует на одном уровнево всех образцах. Профили, полученные для двух исследуемых образцов в результате РНК анализа (Б5г и 19г) группируются в один кластер. Кроме того, сообщества, полученные для образца Е5 (Б5г и Е5ё) очень похожи. Однако, молекулярный профиль сообщества образца 19, полученный при ДНК анализе(19ё), сильно отличается от молекулярных профилей других анализируемых сообществ, что говорит о высоком разнообразие присутствующих в этом образце организмов.
а о
14г Е!г гг. по й? т Аз
["1ВДПБП
п.л -..и 045вль 0.01 п.н о.ео п,вя 0.16
. ЕН . Е5г
■ Л0
■ <57
■ НЯ А1
Рис. 2. Молекулярные профили сообществ фиолетовых пятен. ДНК анализ всех образцов А1, Е5 (Е5й), С7, Н8,19 (19й), Л0, а РНК анализ только для образцов 19 и Е5 (19г и Е5г) т - маркер миграции (а); сравнение молекулярных профилей сообществ (А). Анализ был основан на присутствии или отсутствии полосы на определенной линии в ДГГЭ геле. Шкала указывает коэффициент сходства Дайса (б)
3.2. Анализ генотек
Сообщества анализируемых образцов показали достаточно высокое микробное разнообразие (рис. 3). В образце Е5 большинство последовательностей (74 %) были отнесены к представителям типа
Cyanobacteria(Brasilonema). Следующая группа микроорганизмов, которой соответствовало 18,5 % последовательностей этого образца, принадлежала к типу Proteobacteria, хотя соответствие между этими последовательностями и рибосомальными генами ближайших культивируемых гомологов этого типа было не достаточно высоким (не более 95 %). Представители Alphaproteobacteria (Nordella, Rhodomicrobiumи Blastochloris) чаще всего обнаруживали среди культивируемых гомологов протеобактерий. Также среди гомологов идентифицировали представителей класса Gammaproteobacteria и некоторые не классифицированные протеобактерии. Кроме этих групп также были обнаружены: Bacteroidetes, Nitrospirales и Actinobacteria.
Причем только последовательности, отнесенные к актинобактериям, показали достаточно высокое сходство с 16S рРНК генами представителей Actinobacteria (Pseudonocardia) - 96 %, тогда как другие последовательности показывали 91 % - 92 % сходства с гомологичнымирибосомальными генами культивируемых бактерий.
В результате анализа ДНК генотеки образца I9 большинство последовательностей были гомологичны 16S рРНК последовательностям бактерий типа Proteobacteria (рис. 3). Среди найденных гомологов протеобактерий были выделены три класса Alphaproteobacteria(Aliihoeflea), Betaproteobacteria (Herbaspirillum)и Gammaproteobacteriaв практически равном соотношении. Следующей группой обнаруженной среди гомологов был тип Firmicutes(23 % полученных последовательностей), а точнее представители рода Staphylococcus. Так же в этом образце были обнаружены бактериям типов Cyanobacteria(Brasilonema) и Actinobacteria(Rubrobacter и Pseudonocardia).
Рис. 3. Соотношение различных бактериальных групп, обнаруженных при ДНК (19й и Е5й) и РНК (19г и Е5г) анализе в образцах, отобранных из фиолетовых пятен со стен
кругового мавзолея
РНК генотеки были не так разнообразны как ДНК генотеки. В анализируемых образцах метаболически активные члены сообществ были представлены двумя типами бактерий. В образце Е5 большинство последовательностей (94 %) были гомологичны 16Б рРНК последовательностям представителей типа Cyanobacteria (Brasilonema). Оставшиеся последовательности (6 %) были отнесены к бактериям типа Proteobacteria порядка Rhizobiales (Alphaproteobacteria), хотя процент сходства анализируемых последовательностей и найденных в базе данных последовательностей 16Б рРНК культивированных представителей этого порядка были низкими (93 %).
В образце 19 бактериям типа Cyanobacteria также соответствовала большая часть полученных в ходе РНК анализа последовательностей (92 %). В то время как оставшиеся 8 % последовательностей отнесли к представителям типа Actinobacteria(Rubrobacter).
3.2. Анализ 16Б рРНК последовательностей
Последовательности ДНК и РНК генотек, полученных из двух образцов фиолетовых пятен (Е5 и 19) были сгруппированы в операционные таксономические единицы (ОТЕ). Объединение в ОТЕ позволит проанализировать полученные последовательности и с большей вероятностью отнести к представителям той или иной таксономической группе, так как сравнение с гомологичными последовательностями, найденными в базе данных, не всегда давал положительный результат. Многие последовательностипоказывали высокое сходство с последовательностями, выделенными из некультивированных организмов, в связи с чем, определить таксономическую принадлежность организмов, входящих в состав анализируемых сообществ представлялось затруднительным.
Однако только одна ОТЕ объединяла последовательности, полученные в результате ДНК и РНК анализов обоих образцов, а наиболее близким гомологом этой группы являлся представитель рода ВгаБЙопета (СуапоЬас1епа). Кроме того, в образце 19 обнаружили одну ОТЕ, которая содержала последовательности ДНК и РНК генотек, чьи ближайшие гомологичные последовательности относились к бактериям родаЯиЬгоЬа^ег (АсйпоЬа^епа).
В общей сложности, самые разнообразные бактериальные группы исследуемых образцов относились к типу Proteobacteria (12 ОТЕ) и классу Alphaproteobacteria (7 ОТЕ). Cyanobacteria и Actinobacteria были представлены тремя ОТЕ каждый, в то время Firmicutes, Nitraspira иBacteroidetes образовывали по одному ОТЕ.Было также обнаружено, что ДНК генотеки образцов содержала больше разнообразных групп по сравнению с РНК генотекой.
Для оценки разнообразия микробного сообщества, полученного для исследуемых образцов, были построены кривые разрежения (рис. 4), где отражается зависимость числа полученных ОТЕ от числа клонов (последовательностей) отобранных для анализа.
ОТЕ
О 10 20 33 40 50 60 70 80 90 100 110
KQrvwecTBO клонов
Рис. 4. Кривая разрежения. Представленные кривые разрежения построены по результатам, полученным для ДНК и РНК генотек
На рис.4 видно, что кривая, построенная с использованием последовательностей РНК генотек, приближается к горизонтальной асимптоте. Это говорит о том, что при анализе разнообразия основных групп метаболически активных микроорганизмов в этих образцах было отобрано достаточное количество клонов, и что увеличение числа отбираемых клонов не дало бы больше дополнительной информации о группах присутствующих в анализируемых сообществах. Тем не менее, достижение горизонтальной асимптоты не произошло при изучении бактерий, присутствующих в образцах (результаты анализа ДНК генотек), кривая разрежения которых продолжает расти с увеличением числа отобранных клонов. Это позволяет предположить наличие большего разнообразия микроорганизмов, чем удалось установить в этом исследовании.
4. Обсуждение
На стенах только одной гробницы (Круговой Мавзолей) некрополя города Кармона наблюдали пятна фиолетового цвета, проявление которых предположительно связано с развитием микроорганизмов. Микробные сообщества нескольких образцов с этих пятен изучали в данной работе.
Наличие фиолетовых пятен на стенах гробниц не является новым фактом. Агаросси [1]исследовал микробные сообщества фиолетовых пятен на стенах «Гробницы охоты и рыбной ловли» (TombadellaCacciaedellaPesca) и «Гробницы быков»(TombadeiTori), в
Тарквинии (Италия). Врезультате он заключил, что фиолетовый цвет свидетельствует о развитии бактерий родaStreptomyces, экстрагирующих фиолетовый пигмент.
В случае исследования фиолетовых пятен обнаруженных в Круговом Мавзолее, представленного в этой работе, также было обнаружено присутствие актиномицетов в сообществах образцов отобранных с этих пятен. Актиномицеты были представлены бактериями родов Rubrobacter и Streptomyces. Однако, последние были обнаружены только с помощью специфичных для Actinobacteria праймеров, что свидетельствует о сравнительно небольшом количестве этих бактерий в составе сообщества. Кроме того, только в образце 19 актиномицеты являются метаболически активными членами сообщества.
Род Streptomyces содержит большое количество видов экстрагирующих фиолетовый пигмент [10, 14, 23]. Так уже в 1908 году Р. Миллер обнаружил, что бактерии Streptomyces coelicolorна крахмалсодержащей среде выделял темно-синий водорастворимый пигмент, который был назван "амилоцианином" [14].
Ранее из Кругового Мавзолея удалось выделить штамм Streptomycessp, который выделял фиолетовый пигмент в процессе роста (рис. 5). Таким образом, цвет пятен может быть обусловлен развитием данной бактерии, хотя, в момент отбора проб количество представителей рода Streptomycesв изучаемых сообществах было низким.
Рис. 5. Образование фиолетового пигмента при росте 31гер1отуее88р.
С48 на богатой агаризованной среде Т8А
Присутствие актинобактерий ранее неоднократно отмечалось при изучении сообществ, развивающихся на стенах подземных памятников, где они составляли значительную часть этих сообществ [9, 15]. Актинобактерии - это гетеротрофные микроорганизмы и их рост зависит от органического материала, проступающего с поверхности в подземную гробницу. Таким образом, низкое содержание бактерий рода 81хер1;отусев может говорить о неблагоприятных для их развития условиях, которые предшествовали отбору проб.
При изучении микробных сообществ молекулярно-биологическими методами, получили, что молекулярные профили сообществ всех
изучаемых образцов довольно схожи (около 50 % сходства), за исключением одного образца (19), а при сравнении метаболически активных сообществ двух образцов выявили еще больше сходства (около 76 %). Таким образом, метод ДГГЭ позволил быстро сравнит сообщества по содержанию доминирующих членов.
По результатам ДНК и РНК анализа образцов выявили, что большая часть их микробных сообществ составляли цианобактерии, главным образом отнесенных к роду Brasilonema, исключая образец 19, где по результатам ДНК анализа протеобактерии составляли большую часть сообщества, а цианобактериям соответствовало лишь 19 % (рис. 3). Образец 19 отобрали с дальней стены, где освещенность была ниже по сравнению со стеной около входа в гробницу (образец Е5), возможно это повлияло на содержание цианобактерий в данном образце.
В образце Е5 вторую по величине группу метаболически активных микроорганизмов составляли бактерии, отнесенные к типу Рго!еоЬас!епа (А1рЬарго!еоЬас1епа, К^оЫа^), этот тип также составлял вторую по величине группу, обнаруженную при ДНК анализе этого образца. Другие группы, обнаруженные при ДНК анализе (АсйпоЬа^епа, Bacteroidetes и Nitrospirales), не были обнаружены среди метаболически активных микроорганизмов. С другой стороны, в образце 19 две большие группы микроорганизмов (которым соответствовало около 60 % последовательностей), обнаруженные в результате ДНК анализа (Proteobacteria и Firmicutes) не были выявлены среди метоболически активного сообщества, в отличие от представителей двух других групп (АсйпоЬа^епа и СуапоЬа^епа).
Таким образом, полученные результаты указывают, что метаболически активные микробные сообщества могут быть представлены микроорганизмами отличными от тех, что составляют доминирующие члены общего сообщества в изучаемом месте. Однако, бактерии, которые в момент изучения не проявляли метаболической активности, но присутствующие в сообществах могут проявить метаболическую активность, если наступят подходящие для развития условия.
Среди актинобактерий, обнаруженных обоими методами, наиболее часто встречались представители рода ЯиЬтЬаСж. Бактерии рода ЯиЬтЬаСж - это умеренные галлофилы образующие розовые колонии на питательных средах [16]. Таким образом, обильное развитие данных микроорганизмов может привести к образованию розовых пятен на стенах гробниц, как произошло в часовне замка Герберштейн (Австрия) [20].
Результатами данного исследования подтверждается также теория ассоциации цианобактерий и актинобактерий в сообществах, которые развиваются в подземных условиях. Альбертано и Урзи [2] описали связь между Streptomyces и нитчатыми цианобактериями (Scytonema и Leptolyngbya) в катакомбах Рима. В случае сообщества фиолетовых пятен
в Круговом Мавзолее обнаружена связь между цианобактериями рода Brasilonema и актинобактериями рода Rubrobacter и различных видов Streptomyces.
Brasilonema bromeliae является недавно описанным видом с эпифитным обитанием (на листьях бромелиевых - семейство Bromeliaceae) в тропическом и субтропическом климате Бразилии [S]. Было бы интересно культивировать и описать штамм присутствующий в некрополе города Кармона, чья последовательность 16S рРНК гена показывает высокое сходство (94 % и 98 %). с рибосомальным геном цианобактерии описанного вида Brasilonema bromeliae. Однако на данный момент культивировать этот штамм не удалось.
Данное исследование представляет важный этап в понимании микробиологии одной из гробниц некрополя города Кармона (Испания), представляя информацию по микроорганизмам в этом историческом и культурном месте. Два молекулярно-биологических метода основанных на ДНК и РНК анализе сообществ были применены для сравнения исследуемых сообществ. Определили состав доминирующих членов сообщества фиолетовых пятен, обнаруженных на стенах гробницы Круговой Мавзолей, и установили метаболически активные микроорганизмы (на момент отбора проб) в составе этих сообществ. Эти результаты могут служить дополнительной информацией для разработки более эффективных мер по сохранению этого памятника в будущем.
Работабылавыполненаврамкахевропейскогопроекта Marie Curie Action (Early Stage Training) "Advanced Research Training on the Conservation of Cultural Heritage" MEST-CT2004-S1391S ипроектаRNM 2318, и
"ProgramadeInvestigaciónenTecnologíasparalaValoraciónyConservacióndelPatr imonio" (C0NS0LIDERCSD2007-000S8).
Список литературы
1. Agarossi G. Biodeterioramento in ambienti ipogei: esperienze e considerazioni /ed. by Guidobaldi F.Studi e ricerche sulla conservazione delle Opere d'Arte dedicati alla memoria di Marcello Paribeni. Roma C.N.R. 1994. P. 1-18.
2. Albertano P., Urzi C. Structural interactions among epilithic cyanobacteria and heterotrophic microorganisms in Roman hypogeal // Microbial ecology. 1999. Vol. 38. P. 244-2S2.
3. Basic local alignment search tool/S.F.Altschul, W.Gish, W.Miller et al // Journal of Molecular Biology. 1990. Vol. 21S. P. 403-410.
4. The deterioration of Circular Mausoleum, Roman Necropolis of Carmona, Spain / J.C.Canaveras, A.Fernandez-Cortes, J.Elez et al // Science of the Total Environment. 2015. Vol. 518-519. P. 65-77.
5. The cyanobacterial genus Brasilonema, gen. nov., a molecular and phenotypic evaluation / M.F.Fiore, C.L.Sant'Anna, M.T.de Paiva Azevedo et al // Journal of Phycology. 2007. Vol. 43. P. 789-798.
6. Statistical analysis of denaturing gel electrophoresis (DGE) fingerprinting patterns / N.Fromin, J.Hamelin, S.Tarnawski et al // Environmental microbiology. 2002. Vol. 4. P. 634-643.
7. An efficient strategy for screening large cloned libraries of amplified 16S rDNA sequences from complex environmental communities / J.M.Gonzalez, A.Ortiz-Martinez, M.A.Gonzalez-del Valle et al // Journal of Microbiological Methods. 2003. Vol. 55. P. 459-463.
8. Gonzalez J. M., Saiz-Jimenez C. Microbial diversity in biodeteriorated monuments as studied by denaturing gradient gel electrophoresis // Journal of separation science. 2004. Vol. 27. P.174-180.
9. Groth I., Saiz-Jimenez C. Actinomycetes in hypogean environments // Geomicrobiology Journal. 1999. Vol. 16. P. 1-18.
10. Habermehl G. and Christ B.G.Amyloeyanin, the blue pigment of Streptomyces coelicolor// Naturwissenschaften.1977. Vol. 64P. 97-98.
11. Heck Jr. K. L., van Belle G., Simberloff D. Explicit calculation of the rarefaction diversity measurement and the determination of sufficient sample size // Ecology. 1975. Vol. 56. P. 1459-1461.
12. Estudio de los procesos de alteración de los materiales pétreos y estucos de la Necrópolis de Carmona / M.Hoyos, J.M. Cañaveras, S.Sánchez et al // Informe para la Consejería de Cultura de la Junta de Andalucía.1994. 92 p.
13. Hurlbert S. H. The nonconcept of species diversity: a critique and alternative parameters // Ecology. 1971. Vol. 52. P. 577-586.
14. Kutzner H.J. and Waksman S. A. Streptomyces coelicolor müller and Streptomyces violaceoruber waksman and curtis, two distinctly different organisms / //Journal of Bakteriology. 1959. Vol. 78. P. 528-538.
15. L.Laiz,B.Hermosin, B.Caballero, C.Saiz-Jimenez. Facultatively oligotrophic bacteria in Roman mural paintings // eds. by Galan E. and Zezza F. Protection and conservation of the cultural heritage of the Mediterranean cities. Lisse: Balkema, 2002. P. 173-178.
16. Isolation of five Rubrobacter strains from biodeteriorated monuments / L.Laiz, A.Z.Miller, V.Jurado et al // Naturwissenschaften. 2009. Vol. 96. P. 71-79.
17. Bacterial phylogeny based on comparative sequence analysis / W.Ludwig, O.Strunk, S.Klugbauer et al // Electrophoresis. 1998. Vol. 19. P. 554-568.
18. Muyzer G., de Waal E. C., Uitterlinden A. G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of
polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA // Applied and Environmental Microbiology. 1993. № 59. P. 695-700.
19. Rossello-Mora R., Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS microbiology reviews. 2001. Vol. 25. P. 39-67.
20. Rubrobacter-related bacteria associated with rosy discolouration of masonry and lime wall paintings / C.Schabereiter-Gurter, G.P^ar, D.Vybiral et al // Archives of Microbiology. 2001. Vol. 176. P. 347-354.
21. Silva E. P., Russo C. A. M. Techniques and statistical data analysis in molecular population genetics // Hydrobiologia. 2000. Vol. 420. P. 119-135.
22. Ward D. M., Weller R., Bateson M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community // Nature. 1990. Vol. 345. P. 63-65.
23. A kind of potential food additive produced by Streptomyces coelicolor. Characteristics of blue pigment and identification of a novel compound, k-actinorhodin / H.Zhang, J.Zhan, S.U.Keman et al // Food Chemistry. 2006. Vol. 95. P. 186-192.
Екатерина Валентиновна Акатова,канд. хим. наук., ассистент, katiaakatova@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Сезарео Сайс-Хименас, д-р биологии, заведующий лабораторий, saiz@irnase.csic.es, Испания, Севилья,Институт натуральных ресурсов и агробиологии,
Валме Хурадо, д-р биологии, исследователь, vjurado@irnase. csic. esИспания, Севилья,Институт натуральных ресурсов и агробиологии
BACTERIAL COMMUNITIES OF THE PURPLE SPOTS DETECTED IN THE CIRCULAR MAUSOLEUM OF THE ROMAN NECROPOLIS OF
CARMONA (SPAIN)
E. V. Akatova, C. Saiz-Jimenez, V. Jurado
Abstract. The tombs of the necropolis were excavated in porous rock and open to the environment, they are exposed to colonization by various microorganisms, which lead to biodegradation of walls, ceilings and mural paintings, which decorated the tombs. Such biodegradation caused by the development of microorganisms most clearly visible in the tomb of Circular Mausoleum. Spots of different colors, including purple, heavily coated surface of the tomb walls. The purpose of this study is to analyze the microbial community developing in the purple spots by molecular methods and to assess their impact on biodegradation processes at the tomb.
Keywords: biodegradation of cultural monuments, microbial communities, molecular methods.
Ekaterina Valentinovna Akatova,candidate of chemical sciences, assistant professor, katiaakatova@gmail.com,Russia, Tula, Tula State University,
Cezareo Saiz Jimenes, doctor of biology, research professor, department of Geoecology and Biogeochemistry, saiz@irnase.csic.es, Spain.Seville,Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología, CSIC,
Valme Jurado Lobo, doctor of biology,
researcher,vjurado@irnase.csic.esSpain. Seville,Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología, CSIC
