CC BY
32
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (55)/2010
6. Карпова Л.С., Маринич И.Г., Смородинцева Е.А., Столяров К.А. Особенности эпидемии гриппа в сезон 2005 - 2006 годов // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2007. № 2. С. 6 - 9.
7. Карпова Л.С., Маринич И.Г., Столяров К.А. и др. Дальнейшее усовершенствование эпидемиологического надзора за гриппом в России в системе Федерального центра по гриппу и ОРВИ
// Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2008. № 6 (43). С. 23 - 29.
8. Маринич И.Г., Карпова Л.С., Пелих М.Ю. и др. Ситуация по гриппу в мире и России во втором полугодии 2007 года и первом полугодии 2008 года // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2009. № 1. С. 8 - 14.
Бактериальные ассоциации в микросимбиоценозе верхних дыхательных путей у больных гриппом
О.В. Бухарин, А.С. Паньков (aspankov@km.ru), Б.Я. Усвяцов,
М.В. Скачков (skachkov47@mail.ru)
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, г. Оренбург
Резюме
Исследовано 155 ассоциаций микроорганизмов, выделенных от здоровых и больных гриппом. Использовался метод кластерного анализа, позволяющий определить общность и связь бактерий в ассоциациях. Степень сопряженности связей бактерий в ассоциациях определяли по коэффициенту Жаккарда. Межбактериальные взаимодействия исследовали методом перекрестного посева штаммов-симбионтов. У здоровых людей наиболее тесно взаимосвязанными оказались коагулазоотрицательные виды стафилококков. У больных гриппом в кластер первого порядка вошли кроме стафилококков представители родов Morganella, Klebsiella, Streptococcus. На миндалинах здоровых людей связи между ассоциантами характеризовались выраженной сопряженностью, тогда как у больных гриппом ассоциации отличались умеренной и слабой степенью сопряженности. В бактериальных ассоциациях у больных гриппом по сравнению со здоровыми выявлено усиление экспрессии гемолитической активности в 4,3 раза, а антилизоцимной активности - в 10 раз. Характеристика бактериальных ассоциаций с учетом межмикробных взаимодействий индигенной и условно-патогенной микрофлоры позволяет оценить стабильность микросимбиоценоза, прогнозировать тяжесть течения и вероятность осложнений при гриппе.
Ключевые слова: грипп, микросимбиоценоз, верхние дыхательные пути, общность и сопряженность ассоциаций, факторы патогенности
The Bacterial Associations in Microsimbiocenosis of Upper Respiratory Ways of Influenza Patients
O.V. Bukharin, AS. Pankov (aspankov@km.ru), B.Ya. Usvyatsov, M.V. Skachkov (skachkov47@mail.ru)
Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis of Ural Branch
of the Russian Academy of Sciences, Orenburg
Abstract
155 associations of the microorganisms allocated from the healthy and the sick flu have been investigated. The method of the cluster analysis was used, allowing to define generality and communication of bacteria in associations. Degree of an associativity of communications of bacteria in associations was defined according to the factor of Zhakkard. Interbacteriemic interactions were investigated with the method of two-dimensional crops of shtamm-simbiont. With healthy people most closely interconnected coagulasonegative staphylococcus have appeared. With the sick of flu in cluster of the first order, except staphylococcus, representatives of sorts of Morganella, Klebsiella, Streptococcus have been included. On tonsils of healthy people contacts between associants were characterised by the expressed firmness whereas witch patients sick of flu associations were distinguished by moderate or weak degree of firmness. In bacteriemic associations with patients sick of flu, in comparison with the healthy, intensifying of expression of hemolitic activity in 4.3 times, and antilysozym activity in 10 times is revealed. The characteristic of bacteriemic associations taking into account intermicrobic interactions of basic and conditional-pathogenic microflora allows to estimate stability of microsimbiocenosis, to prognosticate difficulty of the course and complication with flu. Key words: flu, microsimbiocenosis, the upper respiratory tracts, a generality and a firmness of associations, pathogenicity factors
Введение
Рассмотрение в качестве модели системного ассоциативного симбиоза при инфекционной патологии способствует выявлению новых подходов к изучению взаимоотношений симбионтных микроорганизмов в микробиоценозе при определенных заболеваниях [3].
Использование такой модели целесообразно при гриппе, где причинно-следственные связи
в оценке микробных ассоциаций не выяснены [9, 11]. А между тем именно при гриппе эта проблема стоит остро, поскольку его осложнения вызывают преимущественно бактериальные инфекции [1, 12, 13] - условно-патогенная микрофлора.
Цель исследования - оценка микросимбио-ценоза верхних дыхательных путей у лиц, больных
гриппом, с учетом особенностей функционирования бактериальных ассоциаций.
Материалы и методы
Обследовано 278 больных гриппом и 37 здоровых людей. Верификация диагноза «грипп» проводилась на основании результатов ПЦР-ис-следования, вирусологического и серологического методов диагностики. Возбудителями гриппа были штаммы А(Н^1) и В. Выделение и идентификацию бактерий проводили по общепринятым схемам, используя тест-системы фирмы Lachema (Чехия). У выделенных микроорганизмов чашечным методом были определены гемолитическая (ГА), леци-товителлиновая (ЛецА), лизоцимная (ЛА) и анти-лизоцимная активности (АЛА) [2]. При изучении модификации факторов патогенности в условиях межбактериальных взаимодействий также был использован чашечный метод перекрестного посева штаммов-симбионтов [10].
Было изучено 155 ассоциаций микроорганизмов, из которых 77 образовались в микробиоценозе больных гриппом и 78 - у здоровых лиц. Из 77 ассоциаций, выделенных от больных гриппом, 20 выделены из носа, а 57 - со слизистой миндалин. У здоровых людей из 78 ассоциаций со слизистой носа выделено 11, со слизистой миндалин -67 изолятов.
Для группировки таксонов обнаруженной микрофлоры использовался метод кластерного ана-
лиза, позволяющий определить общность и связь бактерий в ассоциациях [6, 7].
С целью выявления степени сопряженности связей бактерий в ассоциациях определяли коэффициент Жаккарда, являющийся наиболее информативным показателем экологической общности различных видов микроорганизмов [4, 5].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Biostat, Statistica 6.0, SPSS 11.0.
Результаты и обсуждение
На основании кластерного анализа частоты встречаемости микроорганизмов на слизистой оболочке миндалин здоровых людей по степени общности таксонов были определены три кластера: С1, С2, С3 (рис. 1).
В кластер первого порядка (С1) вошли виды бактерий, наиболее похожие по частоте встречаемости. Это коагулазоотрицательные стафилококки (КОС): S. epidermidis, S. saprophyticus, S. kloosii, S. hominis, S. capitis, S. haemolyticus, S. xylosus, S. arlettae, S. caseolyticus, S. caprae.
Микрофлора миндалин больных гриппом была представлена более сложной иерархической организацией, включающей семь кластеров (рис. 2). В кластер С1 кроме стафилококков вошли другие таксоны условно-патогенных бактерий: Morganella morganii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Corynebacterium ulcerans, S. sanguis,
Рисунок 1.
Дендрограмма микросимбиоценоза слизистой оболочки миндалин у здоровых людей (кластерный анализ)
S. epidermidis
S. saprophyticus
S. kloosii
S. hominis
S. capitis - C1 ■
S. haemolyticus I
S. xylosus I
S. arlettae
S. caseolyticus - 1
e ra pr 8 S. I
S. hyicus _ 1
S. intermedius - 1
S. salivarius _
S. oralis - 1
S. mitis - I
S. bovis
S. vestibularis - C 2 1
S. constellans _ i
S. sanquis —
S. pneumoniae - 1
E. faecium ” 1
E. fecalis 1 _ C3
E. coli
P. vulgaris ■
Micrococcus spp. 1
Neisseria spp. -
A. viridans
M. morganii
E. agglomerans
i i T 1
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Степень общности: - сильная ™ - умеренная
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (55)/2010
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (55)/2010
Рисунок 2.
Дендрограмма микросимбиоценоза слизистой оболочки миндалин у больных гриппом (кластерный анализ)
S. aureus S.pyogenes A. viridans S. epidermidis S. sanguis M. morganii K. oxytoca C. ulcerans S. agalactiae Micrococcus spp. Moraxella spp. S. hominis S. anginosus S. bovis S. sanguis S. capitis S. mutans S. oralis E. faecalis S. saprophyticus K. pneumoniae E. faecium S. hyicus S. salivarius S. haemolyticus S. mitis E. coli
C6
C1
C2 1
_ — — — J :
C3
C1
- C4
C1
—
- C1
C7
C5
— — — C2_ _|
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
Степень общности: - сильная — — - умеренная ■ ■ ■ ■ ■ - слабая
S. mutans и Streptococcus salivarius. Внутри рода Staphylococcus обнаружен коагулазоположительный вид - S. hyicus.
Сходная закономерность выявлена при сравнительном кластерном анализе бактериального сим-биоценоза носа у здоровых и больных гриппом. У здоровых в кластер первого порядка вошли коагу-лазоотрицательные виды рода Staphylococcus, а у больных гриппом в кластер первого порядка кроме стафилококков вошли E. coli, K. oxytoca, E. faecium, E. faecalis и S. pyogenes.
Таким образом, кластерный анализ микросим-биоценозов миндалин и носа дает возможность дифференцировать бактериальные ассоциации разного типа по степени общности. У здоровых людей кластеры первого порядка (C1) представлены индигенными коагулазоотрицательными стафилококками, что указывает на факт эубиоза (стабильности нормофлоры), а у больных гриппом в наиболее взаимосвязанные ассоциации входили условно-патогенные микроорганизмы как рода Staphylococcus, так и других таксонов: Klebsiella, Morganella, Streptococcus. Подобное состояние микросимбиоценоза при гриппе свидетельствует о возможности развития дисбиоза и бактериальных осложнений.
Важной характеристикой выделенных ассоциаций является степень сопряженности микроорганизмов как показатель стабильности ассоциаций и прочности формируемых ими взаимодействий.
В микрофлоре здоровых людей на слизистой миндалин выявлено четыре ассоциации с выраженной сопряженностью (g > 50%) (рис. 3): S. vestibularis + S. kloosii, S. arlettae + S. caseolyticus, S. arlettae + S. pneumoniae, S. caseolyticus + S. pneumoniae -и пять ассоциаций с умеренной сопряженностью (30 < g < 50%). У больных гриппом со слизистой миндалин не выделено ассоциаций с выраженной сопряженностью, восемь ассоциаций характеризовались умеренной сопряженностью и столько же -слабой (рис. 4).
В микрофлоре носа здоровых и больных гриппом ассоциации характеризовались в основном умеренной и слабой сопряженностью таксонов, однако у больных гриппом выявлена одна ассоциация с выраженной сопряженностью таксонов S. epidermidis и S. capitis.
Таким образом, у здоровых людей на миндалинах выявлены ассоциации с выраженными сопряженными связями между представителями нормальной микрофлоры. Микросимбиоценоз миндалин при гриппе был представлен менее стабильными ассоциациями с умеренными сопряженными связями.
Для качественной оценки микросимбиоценоза была определена модификация факторов патогенности выделенных штаммов в ассоциациях.
В условиях межмикробных взаимодействий на слизистой оболочке верхних дыхательных путей больных гриппом наблюдали более высо-
Рисунок 3.
Сопряженность таксонов микрофлоры слизистой оболочки миндалин у здоровых людей
Рисунок 4.
Сопряженность таксонов микрофлоры слизистой оболочки миндалин у больных гриппом
S. capitis
S. mitis 1 ,Р S. epidermidis
:
\ .*Ч
: ^1^. в S. haemolyticus
X
° S. hyicus
^ К v
•** » ^ | I \
Micrococcus О '• I s 11 % *0 K. pneumoniae
\ * II Ч
: ✓ ; 11 >v ••
г- * • II ^ Tv
E. coli о* \ .* * : ч* .
; I I/ -DC. albicans
'S -’S
: .........-•.'I I / '
......... ¿/
'Li..............I*'......;,,y S. salivarius
(J О .
S. saprophyticus S. aureus
..... слабая — — умеренная — выраженная
(20% < д < 30%) (30% < д < 50%) (д > 50%)
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (55)/2010
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (55)/2010
кую по сравнению со здоровыми частоту усиления экспрессии гемолитической (в 4,3 раза -33,3% у больных, 7,7% - у здоровых) и антилизо-цимной активности (в 10 раз - 13,3% у больных, 1,3% - у здоровых). Также имеет место тенденция к большей экспрессии лецитовителлиновой и ли-зоцимной активности у бактерий при гриппе.
Исследования выявили у здоровых людей один кластер первого порядка, представленный индигенной микрофлорой (коагулазоотрица-тельными стафилококками). Микросимбиоценоз верхних дыхательных путей при гриппе характеризовался более сложными связями в ассоциациях. Было выявлено четыре кластера первого порядка (С1), в которые входили микроорганизмы родов Staphylococcus, Klebsiella, Morganella, Streptococcus. Кластерный анализ микросимбио-ценозов миндалин у больных гриппом показал высокую степень общности ассоциаций индигенной и условно-патогенной микрофлоры. Не исключено, что подобная форма ассоциаций может создавать условия для селекции патогенных микроорганизмов и возможности бактериальных осложнений.
Ассоциации микроорганизмов обладают сопряженными связями.
Наибольшая сопряженность формируется у симбионтов индигенной микрофлоры, выделенных от здоровых людей со слизистой миндалин, что определяет стабильность эубиоза.
При гриппе микросимбиоценоз миндалин представлен менее стабильными ассоциациями с умеренными сопряженными связями.
Аналогичные результаты были получены при исследовании микрофлоры слизистой оболочки носа у стафилококковых бактерионосителей, где преобладали ассоциации с умеренными и слабыми сопряженными связями - по сравнению со здоровыми лицами, у которых выявлены высокосопряженные связи между представителями индигенной микрофлоры [8].
Повышение экспрессии факторов патогенности микроорганизмов в условиях ассоциации при гриппе проявлялось значительно чаще: отмечено усиление гемолитической, антилизоцимной, лизоцим-ной и лецитовителлиновой активности. Усиление экспрессии факторов патогенности и персистенции условно-патогенной микрофлоры может способствовать развитию бактериальных осложнений при гриппе.
Следовательно, можно предположить, что на слизистой оболочке верхних дыхательных путей при гриппе в условиях межмикробных взаимодействий индигенной и условно-патогенной микрофлоры чаще происходит селекция штаммов с экспрессией факторов патогенности, что отражается на тяжести заболевания, приводит к развитию дисбиоза и осложнений.
Выводы
1. Кластерный анализ микросимбиоценозов верхних дыхательных путей у больных гриппом показал высокую степень общности ассоциаций индигенной и условно-патогенной микрофлоры, что может создавать условия для селекции патогенных микроорганизмов и развития бактериальных осложнений.
2. Ассоциации микроорганизмов обладают сопряженными связями. Наибольшая сопряженность формируется у симбионтов индигенной микрофлоры, выделенных от здоровых людей со слизистой миндалин. При гриппе микро-симбиоценоз миндалин представлен менее стабильными ассоциациями с умеренно сопряженными связями.
3. Особенности формирования ассоциаций и степень сопряженности таксонов в ассоциации могут быть использованы для прогнозирования бактериальных осложнений гриппа.
Литература
1. Бочков И.А., Семина Н.А., Ларина Л.И. и др. Предварительные данные о видовом составе микрофлоры носоглотки здоровых лиц // Журн. микробиол. 1980. № 8. С. 113, 114.
2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина, 1999. - 365 с.
3. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз. - Екатеринбург: УрО РАН, 2007. - 264 с.
4. Домбровский А.М., Бодрягина А.В. Особенности представленных микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae ассоциаций, выделенных из испражнений здоровых и больных сальмонеллезом детей // Журн. микробиол. 1986. № 12. С. 38 - 43.
5. Зубков М.Н., Меньшиков Д.Д., Гугуцидзе Е.Н. и др. Микробиологическая диагностика смешанных анаэробно-аэробных инфекций в хирургии // Антибиотики и химиотерапия. 1995. № 2. С. 46 - 50.
6. Мандель И.Д. Кластерный анализ. - М.: Финансы и статистика, 1988. - 176 с.
7. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica. - М.: МедиаСфера, 2002. - 320 с.
8. Усвяцов Б.Я., Паршута Л.И., Бухарин О.В. Характеристика микробного биоценоза слизистой оболочки носа у здоровых людей и стафилококковых бактерионосителей // Журн. микробиол. 2000. № 5. С. 65 - 69.
9. Учайкин В.Ф. Диагностика, лечение и профилактика гриппа и острых респираторных заболеваний у детей: Пособие для врачей. - М., 2001.
10. Хуснутдинова Л.М. Межбактериальные взаимодействия на слизистой оболочке миндалин человека: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Оренбург, 2004.
11. Шаханина К.Л. Грипп и острые респираторные заболевания - приоритетная социально-экономическая проблема здравоохранения // Здравоохранение. 1998. № 9. С. 169.
12. Gwaltney J.M. Acute community-acquired sinusitis // Clin. Infect. Dis. 1996. № 23. Р. 1209 - 1223.
13. Miravitlles M., Espinosa C., Fernandes-Laso E. Relationship between bacterial flora in sputum and functional impairment in patients with acute exacerbations of COPD. Study Group of Bacterial Infection in COPD // Chest. 1999. № 116. Р. 40 - 46.
