CC BY
156
Биология
BACILLUS THURINGIENSIS - РЕГУЛЯТОР ЧИСЛЕННОСТИ НАСЕКОМЫХ-ФИТОФАГОВ
Г.В. БЛРЛЙЩУК,
кандидат биологических наук, доцент,
Омский государственный аграрный университет, г. Омск
Ключевые слова: бактерии вида Bacillus thuringiensis (Bt), природные 0таммы, леса Омской области, микрофлора листьев растений.
Бактерии вида Bacillus thuringiensis (Bt) широко распространены в природе. Были выделены 132 природных штаммов Bt и идентифицированы по физио-лого-биохимическим и серологическим свойствам. Показано, что самыми многочисленными культурами Bt, выделяемыми в Сибири, являются бактерии 4 серотипа. Применение Bt в виде микробиологического препарата Лепидоцид СК-М показало высокую эффективность в отношении гусениц непарного шелкопряда (Limantria dispar L.) в лесах Омской области.
Bacteria species Bacillus thuringiensis (Bt) are extended in existence. 132 natural strains Bt was isolated. The physiological, biochemical and serological abilities of natural strains was detected. At Siberia the most numerous strains Bt were bacteria of 4 serotype Bt have been shown. Bt as microbiological preparation Lepidocid were applied. The efficacy of the biopreparation against Limantria dispar L. at Omsk region forest was shown.
Bacillus thuringiensis (Bt) - бактерии, которые постоянно циркулируют в биоценозах и являются основой для микробиологических препаратов, число которых из года в год растёт [10]. В различных уголках земного шара продолжается интенсивная работа по выделению штаммов кристаллообразующих бацилл, в результате которой были открыты новые серотипы. L.A. Lacey и H.K. Kaya [9]
указывают на 82 сероварианта Bt, которые содержатся в коллекции международного центра энтомопатогенных бацилл в институте Пастера (Париж).
Энтомопатогенные кристаллообразующие бактерии широко распространены в самых разнообразных биологических объектах внешней среды. Bt встречаются в почве, выделяются из различных насекомых, лиственных и хвойных деревьев [11]. До сих пор нет однозначного ответа о происхождении Bt и его роли в окружающей среде. Обычное место обитание Bt - это почва, другие, что Bt входит в состав микрофлоры листьев растений [4].
Наличие в биоценозах Bt указывает на то, что существует реальная возможность естественной регуляции численности вредных насекомых. В нашей стране впервые установлен факт регулирования численности сибирского шелкопряда с помощью бактерии Bacillus dendrolimus n.sp., позднее - Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, выделенной в 1949 г. в Большеглубоковском очаге размножения сибирского шелкопряда профессором Иркутского государственного университета Е.В.Талалаевым [6].
Цель и методика исследования
Целью данной работы было изучение природных штаммов Bt, их идентификация, оценка их использования как основы микробиологических препаратов, практическое применение Bt
в условиях массового размножения непарного шелкопряда в лесах Омской области.
Объектом исследования послужила коллекция из 132 природных штаммов Bt, собранная в экспедициях с 1974 по 1984 годы под руководством В.С. Кулагина. Культуры были выделены из микрофлоры почвы, растений и насекомых лесных и степных биоценозов Западной и Восточной Сибири, где бактериальные инсектицидные препараты не применялись.
Выделение природных штаммов проводилось следующим образом: патологический материал замачивался в пробирки с 9 мл стерильной воды в течение суток; затем пробирки прогревались в водяной бане при 70оС в течение 20 минут и делался высев в чашки Петри с мясопептонным агаром (МПА). Культурально-морфологические и физиоло-го-биохимические свойства Bt определяли по общепринятым методикам Баржак и Боннефуа (1962) и Лабинской (1978). Использовались отличительные для разных серотипов и разновидностей Bt физиолого-биохимические тесты.
Обработка лесов препаратом Лепидоцид, СК-М проводилась наземно-очаговым методом Газодинамической установкой ГДУ «Тайфун», арендуемом у ООО «Авиаремонтное предприятие «Мотор» 121151.
Результаты и обсуждение
Известно, что ферментативная активность штаммов-продуцентов находится в определённой связи с вирулентностью - наиболее важным признаком для отбора штаммов-регуляторов численности вредных насекомых. Амило-литическая активность природных штаммов по зонам гидролиза крахмала показана на рис. 1. Значения зон гидролиза колебались от 2 до 16 мм. Максимальной активностью по гидролизу крахмала обладали штаммы, выделенные из мёртвых гусениц сибирского шелкопряда (ГСШ) и живых (бациллоносителей).
Синтез фермента лецитиназы определялся по гидролизу лецитина. Все природные штаммы Bt продуцировали ле-цитиназу за исключением одного, выделенного из растительных образцов. Значение зон гидролиза колебалось от 2 до 12 мм. Максимальные значения лецитиназной активности были зарегистрированы у штаммов, выделен-
Bacteria species Bacillus thuringiensis, natural штаммы, woods of Omsk area, microflora of leaves of plants
Хвойные Растения
Поч в а
TC0
(живые)
TCIll Насекомые
(трупы)
♦ Амилолитическая, max -д—Лецитиназная, max -Ж—Протеолитическая, max
-Амилолитическая, min -Лецитиназная, min -Протеолитическая, min
Рисунок 1. Ферментативная активность штаммов В1, выделенных из различных природных источников
■ Ка ШТитр
Рисунок 2. Технологические показатели природных штаммов Б1, перспективных для создания биологических препаратов
ных с хвойных деревьев, трупов сибирского шелкопряда и насекомых, сопутствующих ему в биоценозе (рис. 1).
Для определения протеолитической активности использовали мясопептон-ный желатин (МПЖ), молоко и молочный агар. Разжижение МПЖ и протео-лиз молока отмечены у всех штаммов, но с разной скоростью. О протеолитической активности на молочном агаре судили по размеру зон просветления. Значения этих зон колебались от 3 до 11 мм. Максимальная протеолитичес-кая активность была отмечена у штаммов, выделенных с хвойных деревьев, трупов сибирского шелкопряда и насекомых, сопутствующих ему в биоценозе (рис. 1).
В то же время была выявлена определенная вариабельность культуральных и физиолого-биохимических признаков природных штаммов: по росту в мясопептонном бульоне (МПБ), интенсивности образования ацетилметилкарбинола (АМК), по аминокислотной потребности для своего роста. Один штамм, выделенный из растительных образцов, не продуцировал лецитиназу; два штамма, выделенные из почвы, образовывали тёмно-коричневый пигмент. Четыре штамма, выделенные из трупов сибирского шелкопряда и насекомых, сопутствующих ему в биоценозе, продуцировали уреазу.
Ареалами приуроченности известных серотипов Б1 считаются следующие эколого-географические зоны: боКо, а^а\«а1 - Дальний Восток, <^еп<^гоИтиБ - Сибирь, а!еБ^ - Европа, саисаБ1сиБ - Кавказ, кепуае - Африка, еп1отос1<^иБ, АпШтиБ - Северная Америка. Серотипы 1Ииг1пд1епз1з и да11ег1ае признаются широко распространенны-
ми разновидностями без определённой эколого-географической локализации [1,2]. Нашими исследованиями установлено, что из 132 изученных природных штаммов, выделенных в Сибири, 120 принадлежат к серотипу 4 Б1. Из них 8 культур - кепуае Н4а4с , 4 штамма имеют антигенную формулу
Н, , 4 - Н, , 104 - Н, . . Большое сероло-
4в ’ 4а ’ 4а4в ~
гическое родство наблюдается у культур <^еп<^гоИтиБ и боНо, которые по антигенному строению не различаются и имеют одну антигенную формулу - 4а4в. Шесть природных штаммов агглютинировали в высоких титрах (1:12800) со всеми тремя истощенными Н-антисыворотками 4в, аналогично штамму Б.1иу1епБ|Б, который был описан Н.А.Красильниковым и А.Б.Гукасяном [5]. По данным Э.К.Африкяна [1] штамм Б. №у1епБ|Б соответствует культуре Б.Шиг1пд1епБ|Б БиЬБр. <^еп<^гоИтиБ, исключая образование Ь-гемолизинов в противоположность а-гемолизинам, обнаруженным у типичных культур <^еп<^го11тиБ. Н.йе Ба^ас & Е. РгасИоп [8] считают Шуюпб1б серо-вариантом боНо.
Изучение антигенного строения природных штаммов четвертого се-ротипа с помощью истощенных сывороток подтвердило наличие двух групп с антигенным составом: 4а4с и 4а4в [7,8]. Первую группу представляет биотип кепуае, вторую - разновидности <^еп<^гоИтиБ, боНо, №у1епБ|Б. Полученный фактический материал свидетельствует о наличии определённой закономерности в экологии культур серотипа 4 Б1. Самыми многочисленными культурами Б1, выделяемыми в Сибири, являются бактерии, объединяемые в разновидность <^еп<^гоИтиБ [3].
Культуры Б1 относятся к энтомо-
Биология
патогенным бактериям, т.е. группе микроорганизмов, способных вызывать гибель вредных насекомых. При производстве средств защиты растений на основе штаммов Б1 основным технологическим показателем считается продуктивность штаммов-продуцентов, выражающаяся в титре спор и кристаллов эндотоксина. Вместе с тем, многочисленные работы свидетельствуют об отсутствии коррелятивной зависимости между количеством кристаллов эндотоксина и их инсектицидной активностью. Вследствие этого решающее значение для характеристики перспективности изучаемого штамма приобретает показатель энтомоцидной активности.
Определение биологической активности штаммов-продуцентов микробиологических средств на основе Б1 сводится к установлению 1_К50 и коэффициента активности (Ка) штаммов. Вирулентные свойства природных штаммов мы оценивали в сравнении с 1_К50 штамма-эталона в каждом опыте и соответственно этому выводился Ка. Штаммы, превышающие эталон по вирулентности, в основном были выделены из трупов сибирского шелкопряда и насекомых, сопутствующих ему в биоценозе.
На рис.2 показаны основные технологические показатели у 24 природных штаммов-продуцентов биопрепаратов в сравнении с эталонным штаммом 49. По нашим данным, из 70 природных штаммов у 55 Ка был выше единицы, колебался от 1,1 до 6, что составляет 79%. Только 4% из проверенных штаммов были невирулентны по отношению к гусеницам непарного шелкопряда; у 17% Ка был меньше единицы.
Bt является наиболее используемым микроорганизмом в контроле над лесными насекомыми [11, 12]. В 2005 г. на территориях в непосредственной близости к населенным пунктам, сельскохозяйственным полям и водоемам, была проведена обработка лесов препаратом Лепидоцид, СК-М против гусениц непарного шелкопряда (Рис.3).
Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности препарата Лепидоцид в условиях Омской области - от 73 до 80%. Поскольку распространение непарного шелкопряда по лесам Омской области приобрело массовый характер, вопрос о регулировании численности этого фитофага оставался актуальным и в 2006 году. В результате совместного рекогносцировочного и детального обследований участков лесного фонда, находящихся в ведении лесхозов АЛХ по Омской области, в августе-сентябре 2005 г. были выявлены очаги непарного шелкопряда на площади 78896,1 га. Из них была определена необходимость защитных
Биология
182' I 80 ■
Гтв-
5 76 ■ £74-Ї72-о 70 ■
Q.
С KR ■
- 1 -
■ 1 ■
I -
nh
rf
<d
Рисунок 3. Эффективность Лепидоцида по отношению к непарному шелкопряду в лесничествах Омской области в 2005 г.
й
0
1 ш £ fe
-0-
-9-
>в #
//V>// ^ V/
/ / /” /////////
Рисунок 4. Эффективность Лепидоцида по отношению к непарному шелкопряду в лесничествах Омской области в 2006 г.
мероприятий на площади 71499,1 га. Федеральное агентство лесного хозяйства в 2006 г. выделило 12340,7 тыс. руб. на мероприятия по защите леса на площади 22502,9 га.
Эффективность наземной обра-
ботки против непарного шелкопряда с использованием биопрепарата Ле-пидоцид СК-М в Калачинском, Черлак-ском, Подгородном, Омском лесхозах колебалась по лесничествам от 78% до 94% (рис.4).
Выводы
Полученный фактический материал свидетельствует о наличие определённой закономерности экологии культур Bt и их эколого-географичес-кой изменчивости. Культуры сероти-па 4 этих энтомопатогенных бактерий широко распространены в Сибири и обнаруживают приуроченность к стациям обитания насекомых данного географического региона. Обнаружена природная изменчивость штаммов серотипа 4 Bt, выражающаяся в вариабельности физиологобиохимических свойств и антигенного строения.
Наиболее вирулентными штаммами серотипа 4 Bt являются культуры, выделенные из трупов сибирского шелкопряда и насекомых, сопутствующих ему в биоценозе. Среди выделенных и изученных 120 природных штаммов преобладающее большинство по своей инсектицидной активности к непарному шелкопряду превышало активность эталонного штамма. Таким образом, у большого количества штаммов одного серотипа Bt определены показатели, важные для создания на их основе микробиологических препаратов, и экспериментально доказано, что природные источники из стаций обитания насекомых могут служить основой для отбора штаммов-проду-центов биологических препаратов.
Получены положительные результаты по применению биологического препарата на основе Bt в Омской области. Лепидоцид СК-М показал высокую эффективность (более 75%) в отношении гусениц непарного шелкопряда в лесах Омской области в 20052006 гг.
Литература
1. Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение. -Ереван: АН Арм.ССР, 1973. - 420 с.
2. Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии // Успехи микробиологии. - 1975. - Вып.10. - С.142-172.
3. Барайщук Г.В., Кулагин В.С., Африкян Э.К. Экологические и серологические особенности штаммов Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus // Биологический журнал Армении, 1986. - Вып.39. - №4. - С.275-284.
4. Бурцева Л.И., Штерншис М.В., Калмыкова Г.В. Бактериальные болезни насекомых // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред. В.В. Глупова. - М.: Круглый год, 2001. - С.189-245.
5. Красильников Н.А., Гукасян А.Б. Bacillus tuviensis N.sp. - новый возбудитель болезни сибирского шелкопряда // Микробиология. - 1964. - Т.33, вып.4. - С.664-671.
6. Талалаева Г.Б., Завезенова Т.В., Огарков Б.Н., Буковская Н.Е., Макарова А.П. Е.В.Талалаев - учёный и педагог // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе: Материалы российс. науч.-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е. В.Талалаева. - Иркутск, 2002. - С. 3-10.
7. Barjac H.De. Mise au point sur la classification des Bacillus thuringiensis / H.De Barjac, A. Bonnefoi // Entomophaga. - 1973. - Vol. 18, N1. - P. 5-17.
8. Barjac H.De. Classification of Bacillus thuringiensis strains / H.De Barjac, E. Frachon // Entomophaga 35 (2), 1990. -P.233-240.
9. Lacey L.A. Field manual of techniques in invertebrate pathology: application and evaluation of pathogens for control of insects and other invertebrate pests / L.A. Lacey, H.K. Kaya. - Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2000. - 911 p.
10. Rovesti L. Capturing the potential of biological control in Italy: Where are we? / L. Rovesti, B. Sgarzi // Insect Pathogens and Insect Parasitic Nematodes. IOBC wprs Bulletin Vol.23 (2), 2000. - P.29-36.
11. Thomsen L. Natural occurrence of Bacillus thuringiensis in Lithuanian forest ecosystems / L. Thomsen, J. Eilenberg, P. Zolubas, A. Ziogas, S. Harding // Capturing the potential of biological control: 7th European meeting at Vienna, (Austria), 22-26 March 1999. -Dijon: IOBC/WPRS, 2000. - P. 279-282.
12. Whalon M.E. Bacillus thuringiensis: use and resistance management / Insecticides with novel modes of action: mechanisms and application / M.E. Whalon, W.H. MsGaughey, ed. by I. Ishaaya, D. Degheele. - Berlin: Springer, 1998. - P.106-137.
