Азотфиксирующие и фосфатмобилизующие бактерии для стимуляции роста сельскохозяйственных культур

Алещенкова З.М.; Сафронова Г.В.; Мельникова Н.В.; Есенбаева А.Е.; Тен О.А.

ISSN 1998-4812

82

УДК 68.03.07+62.13.53

раздел БИОЛОГИЯ

АЗОТФИКСИРУЮЩИЕ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИЕ БАКТЕРИИ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР

1 Институт микробиологии НАН Беларуси Республика Беларусь, г. Минск, 220141, ул. акад. Купревича, 2.

2Филиал РГП «Национальный центр биотехнологии» в г. Степногорск Республика Казахстан, Акмолинская область, 021500 г. Степногорск, а/я 114, 7 микрорайон,

здание № 21.

*Email: [email protected]

Для стимуляции роста зерновых, овощных и бобовых культур отобраны изоляты азот-фиксирующих 15MS и фосфатсолюбилизирующих 35MS бактерий. Изоляты обладают неспецифическим ростстимулирующим действием на ранних стадиях онтогенеза растений, которое обусловлено синтезом индолил-3-уксусной кислоты, и активно колонизируют корни растений. По результатам культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств изоляты 15MS и 35MS идентифицированы как Raoultella oxytoca 15MS и Serratia plymuthica 35MS соответственно. Азотфиксирующий R. oxytoca 15MS и фосфатмобилизующий S. plymuthica 35MS штаммы перспективны в качестве основы комплексного биоудобрения для широкого спектра сельскохозяйственных культур.

Ключевые слова: азотфиксирующий штамм, фомфатмобилизующий микроорганизм,

ростстимуляция, колонизация, идентификация Введение

Особенностью развития современного сельского хозяйства является необходимость наращивания производства сельскохозяйственной продукции и восстановления почвенного плодородия.

Анализ последствий химизации и применения интенсивных технологий показывает, что, наряду с несомненными достижениями в этой области, все больше стали проявляться ее отрицательные стороны: загрязнение окружающей среды и снижение качества продукции растениеводства. Повысить продуктивность земледелия, улучшить качество продукции и снизить потребности в минеральных удобрениях, можно за счет использования моно-, бинарных и поликомпонентных микробных препаратов [1]. Основу таких препаратов составляют живые культуры почвенных и ризосферных микроорганизмов, обладающие хозяйственно-ценными свойствами, и продукты их метаболизма [2]. Штаммы-продуценты, входящие в состав биопрепаратов, способны фиксировать атмосферный азот, синтезировать витамины и фитогормоны, переводить некоторые химические соединения (например, фосфаты) в легко усвояемую для растений форму, колонизировать корни и листья растений, проявлять антимикробную активность, обусловленную биосинтезом антибиотиков, пигментов, сидерофо-ров и т.д. [3]. В отличие от минеральных удобрений, микробные препараты имеют ряд преимуществ: они не загрязняют окружающую среду, безвредны для человека и животных, не фитотоксичны и не обладают мутагенной активностью, т.к. созданы на основе штаммов естественных почвенных микроорганизмов.

В настоящей работе изучено влияние азотфик-сирующих и фосфатмобилизующих ризобактерий на рост и развитие проростков сельскохозяйственных культур и проведена идентификация наиболее активных штаммов-фитостимуляторов.

Материалы и методы исследований

Микробиологические объекты - выделенные и отселекционированные штаммы азотфиксирующего R. oxytoca 15MS и фосфатмобилизующего S.plymuthica 35MS ризосферных микроорганизмов.

Штаммы микроорганизмов поддерживались на агаризованной среде мясо-сусловый агар (МСА) [4]. Для сохранения и подержания хозяйственно-ценных свойств азотфиксирующие микроорганизмы параллельно пересевали на среду Эшби [5], фосфатмобилизующие - на агризованную глюкозо-аспарагиновую среду (среду Муромцева) [6].

Растительные объекты — зерновые (ячмень сорта Сябра, яровая пшеница сорта Иволга, диплоидная рожь сорта Калинка), зернобобовые культуры и бобовые травы (горох сорта Белус, вика яровая сорта Белоцерковская, люпин белый сорта Академический, фасоль белая сорта Мотольская, клевер красный сорта Цудоуны), овощные (редис сорта Родос, огурцы сорта Декан,).

Ростостимулирующее действие исследуемых бактерий и влияние продуктов их метаболизма на всхожесть семян сельскохозяйственных культур, развитие корней и накопление сухой фитомассы проростков, изучали по методам, изложенным в руководстве [7].

Количество индолил-3-уксусной кислоты, продуцируемое штаммами, определяли колориметрическим методом [8].

Физиолого-биохимические свойства изучали и идентификацию штаммов проводили в соответствии с руководствами [5, 9] и автоматизированной системы VITEK-2 (bioMerieux).

Фотодокументирование исследуемых объектов проводили цифровой камерой Olympus FE-130.

Математическая обработка данных — общепринятая для биологических исследований [10].

Результаты исследований и их обсуждение

С целью производства комплексного биоудобрения ранее нами отобраны 2 азотфиксирующих (7MS, 15MS) и 2 фосфатсолюбилизирующих (4MS и 35MS) изолята бактерий, перспективные для использования в растениеводстве. Однако для получения положительного эффекта при микробно-растительном взаимодействии необходимо чтобы интродуцированные микроорганизмы не ингибирова-ли рост и развитие растения-партнера. Наличие эффекта ингибирования роста или ростстимуляции можно обнаружить в ранней фазе онтогенеза растений, когда развивается зародыш, прорастает семя и формируется проросток. В серии модельных экспериментов изучили влияние отобранных изолятов микроорганизмов на всхожесть семян, рост и развитие проростков сельскохозяйственных культур.

Как вытекает из данных табл. 1, отобранные изоляты стимулируют всхожесть большинства исследуемых культур. Более высокая всхожесть, по сравнению с контролем, выявлена в вариантах опыта с обработкой семян азотфиксирующим 15 MS (в среднем 142%) и фосфатмобилизующим 35MS (в среднем 156%) изолятами.

На развитие проростков сельскохозяйственных культур все изоляты бактерий, в основном, влияли положительно (табл. 2, 3). Наиболее активными стимуляторами были изоляты 15MS и 35MS: получено статистически достоверное увеличение длины корней проростков сельскохозяйственных

культур в среднем на 29 и 38% и фитомассы проростков — на 39 и 48% соответственно.

Установленный нами ростостимулирующий эффект исследуемых диазотрофных и фосфатмобили-зующих бактерий на проростки растений позволил предположить, что стимуляция роста культур происходит на уровне вторичных метаболитов, в частности, гетероауксина. Изучена способность 2-х наиболее активных диазотрофных и фосфатмобилизующих бактерий-ростостимуляторов к синтезу индолил-3-уксусной кислоты. Количество фитогормона, продуцируемое штаммами, различно: 15MS выделяет 45.3, 35MS — 78.0 мкг ИУК/мл культуральной жидкости. Полученные данные подтверждают, что ростостиму-лирующий эффект на ранних стадиях развития растении обусловлен синтезом гетероауксина.

К необходимым условиям эффективного взаимодействия интродуцируемых популяций ризо-бактерий с растениями относится способность ин-тродуцента активно колонизировать корни и поддерживать экологически значимую численность популяции [11, 12]. Колонизация корней ризобак-териями — сложный мультистадийный и энергоемкий процесс, за который ответственно большое число бактериальных и растительных генов [12]. Активная колонизация ризосферы и поверхности корней является важным критерием отбора полезных форм ризобактерий, предназначенных для инокуляции растений.

Для получения информации о колонизации корней пшеницы исследуемыми изолятами 15MS и 35MS в лабораторных условиях был заложен микровегетационный стерильный опыт. Растения выращивали на светоустановке в течение 21 дня в пробирках с вермикулитом. Для питания растений использовали питательные растворы. Как видно из данных табл. 4, исследуемые ризобактерии активно колонизировали корни пшеницы в условиях стерильного опыта. Их численность на 21 сутки была

Таблица 1

Влияние продуктов метаболизма ризосферных азотфиксирующих и фосфатобилизующих бактерий _на всхожесть семян сельскохозяйственных культур_

Вариант обработки семян Всхожесть, % к контролю

Контроль (вода) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Изолят 7 MS 100 86 140 171 111 83 109 93 78 100

Изолят 15 MS 150 100 160 178 95 316 114 87 117 100

Изолят 4MS 105 31 160 171 74 283 86 127 89 100

Изолят 35MS 136 125 190 171 100 384 72 153 128 100

Таблица 2

Влияние продуктов метаболизма ризосферных бактерий на длину корней проростков сельскохозяйственных культур

Вариант обработки Длина корней проростов, мм

Контроль (вода) 88.8±4.25

Июлят7Ш 81.4±3.78

Изолт 15MS 112.67.66

Изолят4Ш 94.2±9.23

Июлт35М8 109.07.87

87.6±5.33 110.7±7.25 10.6±1.96

103.3±7.65 78.1±9.33 27.7±1.76

121.7±7.74 85.6±9.05 23.3±2.40

80.0±9.23 122.7t10.11 24.3±2.44

99.0±8.44 125.9±8.37 30.9±2.20

9.1±0.83 41.0±7.03 28.6±2.71

9.1±0.99 55.7±4.38 39.9±3.48

17.0±1.71 49.0±9.51 22.2±2.24

8.6±1.01 31.1±4.56 23.0±2.86

13.3±1.41 44.2±4.11 37.4±2.72

10.5±1.67 35.3±2.35 33.2±1.71

16.4±2.65 36.4±4.17 47.6±1.52

11.8t1.31 35.2±2.42 43.1±1.00

17.9±1.61 42.0±4.18 44.3±1.85

18.5±1.52 20.4±2.33 40.1±1.35

84

БИОЛОГИЯ

Таблица 3

Влияние продуктов метаболизма ризосферных бактерий на накопление фитомассы _проростками сельскохозяйственных культур_

Вариант обработки семян

Накопление фитомассы проростками (пересчет на 100 проростков), мг абс. сух. в.

Контроль (вода) 240 180 180 250 63 700 1305 20 122 104

Изолят 7MS 220 180 190 467 86 553 1618 23 164 163

Изолят 15MS 300 220 190 567 124 880 1213 21 167 157

Изолят 4MS 200 180 180 392 79 720 984 21 181 146

Изолят 35MS 260 260 200 658 84 800 2343 26 168 158

выше экологически значимой величины (более 1 млн КОЕ/г корней).

Таблица 4

Численность ризобактерий на корнях пшеницы, выращи-

ваемых в условиях микровегетационного опыта

Вариант обработки Численность ризобактерий,

семян КОЕ/г корней

Контроль (вода) -

Изолят 15 MS (3.2 ± 0.09) • 106

Изолят 35 MS (1.1 ± 0.08) • 107

Далее изучили культурально-морфологические

свойства изолятов.

Культурально-морфологические свойства азотфик-сирующего изолята 15MS:

- морфология колоний: на среде мясо-сусловый агар на 2-3 сутки роста колонии бежевые, слизистые, непрозрачные, блестящие, выпуклые, край колоний ровный (рис.);

- морфология клетки (фазово-контрастная микроскопия): грамотрицательные прямые палочки размером 0.5-0.6 х 1.2-1.5 мкм, неподвижные, окружены капсулой. Изолят факультативный анаэроб.

Культурально-морфологические свойства фосфатмоби-лизующего изолята 35М8:

- морфология колоний: на среде мясо-сусловый агар на 2-3 сутки роста колонии кремовые, слизистые, непрозрачные, блестящие, выпуклые, край колоний ровный (рис.).

Рис. Вид колоний азотфиксирующего 15MS и фосфатмо-билизующего 35MS изолятов (среда мясо-сусловый агар, 3-и сутки культивирования).

- морфология клетки (фазово-контрастная микроскопия): рамотрицательные прямые палочки размером 0.5-0.8 х 0.9-2.0 мкм. Изолят факультативный анаэроб.

Физиолого-биохимические свойства изолятов исследованы с помощью автоматизированной системы VITEK-2 (bioMerieux).

По результатам биохимических тестов, приведенных в табл. 5, азотфиксирующий изолят 15MS идентифицирован как Raoultella oxytoca 15MS, фос-фатмобилизующий изолят 35MS - как Serratia plym-uthica 35MS.

Выводы

1. На основе неспецифичного ростстимулиру-ющего действия, обусловленного синтезом ИУК, отобраны азотфиксирующий 15 MS и фосфатмоби-лизующий 35MS изоляты бактерий.

2. Отобранные изоляты активно колонизировали корни пшеницы и перспективны в качестве основы комплексного биоудобрения для широкого спектра сельскохозяйственных культур.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

3. По комплексу культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств азотфиксирующий 15 MS и фосфатмобилизующий 35MS изоляты идентифицированы как Raoultella oxytoca 15MS (азотфиксирующий) и Serratia plymuthica 35MS (фосфатмобилизующий) соответственно.

ЛИТЕРАТУРА

1. Курдиш И. К., Рой А. А. Перспективы применения препаратов комплексного действия в растениеводстве // Материалы Междунар. конф. «Микробиология и биотехнология XXI столетия». Минск. 22-24 мая 2002 г., Минск, 2002. С. 239-240.

2. Суховицкая Л. А. Биологический азот: итоги и перспективы развития исследований в Институте микробиологии НАН Беларуси // Материалы Междунар. науч.-практ. конф. «Проблемы питания растений и использования удобрений в современных условиях», Жодино. Октябрь 2000 г. Минск: Хата, 2000. С. 505-511.

3. Волкогон В. В. Ассоциативные азотфиксирующие микроорганизмы // Мжробюл. журн. 2000. Т. 62. №2. С. 51-68.

4. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. Минск: Колас, 1983. 296 с.

5. Теппер Е. З., Шильникова В. К., Переверзева Г. И. Практикум по микробиологии. М.: ДРОФА, 2004. 256 с.

6. Некоторые новые методы количественного учета почвенных микроорганизмов и изучения их свойств. Метод. рекомендации. Л., 1987. 53 с.

7. Возняковская Ю. М. Микрофлора растений и урожай. Л.: Колос, 1969. С. 14-22.

8. Libbert E. Isolation and identification of the IAA-producing and degrading Bacteria from Pod Plants // Phisiologis Planta-rum. 1969. V. 22. P. 51-58.

9. Краткий определитель бактерий Берги / Под ред. Дж. Хоута. Москва, 1980.

Таблица 5

Результаты биохимических тестов ризобактерий, полученные с помощью автоматизированной системы У1ТЕК-2 (ЬюМепеих) Реакция на идентификаци- Тест Реакция на идентификаци-

онный субстрат Тест онный субстрат

изолят 15MS - Raou¡te¡¡a оху1оса 15MS

Аланин-фенилаланин- Глютамил-глицин-аргинин-

пролин-ариламидаза - ариламидаза -

Адонит + Тирозин-ариламидаза +

L-пирролидонил- + Уреаза +

ариламидаза

L-арабит - D-трегалоза +

D-целлобиоза + Цитрат натрия +

р-галактозидаза + Малонат +

Образование Н2S - 5-кето- D-глюконат +

Гамма-глютамилтрансфераза + L-лактат(щелочение) +

Глютамилариламидаза - Альфа-глюкозидаза -

D-глюкоза + Сукцинат(щелочение) +

Бета-N-ацетил- Бета-Ы-ацетил-

глюкозаминидаза галактозаминидаза

Сбраживание глюкозы + Альфа-галактозидаза +

Бета-глюкозидаза + Фосфатаза +

D-мальтоза + Глицинариламидаза -

D-маннит + Орнитиндекарбоксилаза -

D-манноза + Лизиндекарбоксилаза +

D-сорбит + Ассимиляция L-гистидина +

Сахароза + Кумарат -

D-тагатоза - Бета-глюкоронидаза -

Бета-ксилозидаза + Устойчивость к 0/129 +

Бета-аланин-ариламидаза - Ассимиляция L-малата +

L-пролин-ариламидаза + Тест Эллмана -

Липаза - Ассимиляция L-лактата +

Палатиноза + изолят 35 MS — Serratiaplymuthica 35 MS

Аланин-фенилаланин- Глютамил-глицин-аргинин-

пролин-ариламидаза - ариламидаза -

Адонит - Тирозин-ариламидаза -

L-пирролиIцонил-ариламидаза + Уреаза -

L-арабит - D-трегалоза +

D-целлобиоза + Цитрат натрия +

р-галактозидаза + Малонат -

Образование Н2S - 5-кето- D-глюконат +

Гамма-глютамилтрансфераза - L-лактат(щелочение) +

Глютамилариламидаза - Альфа-глюкозидаза -

D-глюкоза + Сукцинат(щелочение) +

Бета-Ы-ацетил- Бета-Ы-ацетил-

глюкозаминидаза + галактозаминидаза -

Сбраживание глюкозы - Альфа-галактозидаза +

Бета-глюкозидаза + Фосфатаза +

D-мальтоза + Глицинариламидаза -

D-маннит + Орнитиндекарбоксилаза -

D-манноза + Лизиндекарбоксилаза -

D-сорбит + Ассимиляция L-гистидина -

Сахароза + Кумарат +

D-тагатоза - Бета-глюкоронидаза -

Бета-ксилозидаза - Устойчивость к 0/129 +

Бета-аланин-ариламидаза - Ассимиляция L-малата -

L-пролин-ариламидаза + Тест Эллмана -

Липаза - Ассимиляция L-лактата -

Палатиноза +

Примечания: « + » - наличие реакции, « - » - отсутствие реакции

10. Мятлев В. Д., Ризниченко Г. Ю., Панченко Л. А., Терехин А. Т. Теория вероятностей и математическая статистика. Математические модели. М.: Академия, 2009. 320 с.

11.

Bais H. P., Weir T. L., Perry L. G. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 2006. Vol. 57. P. 233-266. Kiraly L., Barna B., Kiraly Z. Plant resistance to pathogen infection: forms and mechanisms of innate and acquired resistance. J. Phytopathology. 2007. Vol. 155. P. 385-396.

Поступила в редакцию 26.09.2014 г.

86

БИОЛОГИЯ

NITROGEN-FIXING AND PHOSPHATE-MOBILIZING BACTERIA PROMOTING GROWTH OF CULTIVARS

1 Institute of Microbiology, National Academy of Sciences of Belarus 2 Kuprevich St., 220141 Minsk, Belarus.

2National Center of Biotechnology, Stepnogorsk branch POBox 114, Bldg. 21, 7th Distr., 021500 Stepnogorsk, Republic of Kazakhstan.

Phone: (375 72) 67 47 66.

*Email: [email protected]

Productivity of agriculture may be raised and additional yields of ecologically safe vegetable products may be prodused using microbial preparations. They are based on living cultures of soil and rhizosphere microorganisms capable to fix atmospheric nitrogen, to synthesize vitamins and phytohormones, to convert phosphates into readily digestible form, to colonize plant roots and leaves, to show antimicrobial activity, etc. in complex with their metabolites. Microbial products derived from native soil bacteria stimulating plant growth are ecologically safe and their introduction into agricultural turnover will not contribute to environmental pollution. Aim of this study is screening and identification of highly efficient phytostimulating nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing strains of rhizospheric microorganisms to design biofertilizer with a set of beneficial properties: growth promotion, nitrogen fixation, phosphate mobilization. Microbiological, biochemical and physico-chemical methods were used in this research. The data estimating effect of isolated nitrogen-fixing and phosphate-mobilizing rhizobacteria on growth and development of 10 cultivar seedlings have been provided. Nitrogen-fixing bacterial isolate 15MS and phosphate-mobilizing variant 35MS were selected to promote growth of grain crops (barley, wheat, rye), legumes (peas, vetch, lupine, common beans, clover) and vegetables (garden radish, cucumber). Their non-specific growth-promoting action at early stages of plant ontogenesis is determined by synthesis of indolyl-3-acetic acid. The selected isolates actively colonize plant roots. Cultural-morphological and physiological-biochemical characterization of isolates allowed to identify them as Raoultella oxytoca 15MS and Serratia plymuthica 35MS. Nitrogen-fixing strain R. oxytoca 15MS and phosphate-mobilizing strain S. plymuthica 35MS are promising ingredients of complex biofertilizer for a broad spectrum of agricultural crops.

Keywords: nitrogen-fixing strain, phosphate-mobilizing microorganism, growth stimulation, colonization, identification.

Published in Russian. Do not hesitate to contact us at [email protected] if you need translation of the article.

REFERENCES

1. Kurdish I. K., Roi A. A. Materialy Mezhdunar. konf. «Mikrobiologiya i biotekhnologiya XXI stoletiya». Minsk. 22-24 maya 2002 g., Minsk, 2002. Pp. 239-240.

2. Sukhovitskaya L. A. Materialy Mezhdunar. nauch.-prakt. konf. «Problemy pitaniya rastenii i ispol'zovaniya udobrenii v sovremennykh usloviyakh», Zhodino. Oktyabr' 2000 g. Minsk: Khata, 2000. Pp. 505-511.

3. Volkogon V V Mikrobiol. zhurn. 2000. Vol. 62. No. 2. Pp. 51-68.

4. Segi I. Metody pochvennoi mikrobiologii [Methods of soil microbiology]. Minsk: Kolas, 1983.

5. Tepper E. Z., Shil'nikova V. K., Pereverzeva G. I. Praktikum po mikrobiologii [Practical work on microbiology]. Moscow: DROFA, 2004.

6. Nekotorye novye metody kolichestvennogo ucheta pochvennykh mikroorganizmov i izucheniya ikh svoistv. Metod. Rekomendatsii [Some new methods for quantifying soil microorganisms and study their properties. Guidelines]. Leningrad, 1987.

7. Voznyakovskaya Yu. M. Mikroflora rastenii i urozhai [Microflora of plants and the harvest]. Leningrad: Kolos, 1969. Pp. 14-22.

8. Libbert E. Phisiologis Plantarum. 1969. Vol. 22. Pp. 51-58.

9. Kratkii opredelitel' bakterii Bergi [Concise guide to bacteria Bergi]. Ed. Dzh. Khouta. Moscow: 1980.

10. Myatlev V D., Riznichenko G. Yu., Panchenko L. A., Terekhin A. T. Teoriya veroyatnostei i matematicheskaya statistika. Matematich-eskie modeli [Probability theory and mathematical statistics. Mathematical models]. Moscow: Akademiya, 2009.

11. Bais H. P., Weir T. L., Perry L. G The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 2006. Vol. 57. Pp. 233-266.

12. Kiraly L., Barna B., Kiraly Z. Plant resistance to pathogen infection: forms and mechanisms of innate and acquired resistance. J. Phytopathology. 2007. Vol. 155. Pp. 385-396.

Received 26.09.2014.

NITROGEN-FIXING AND PHOSPHATE-MOBILIZING BACTERIA PROMOTING GROWTH OF CULTIVARS

Текст научной работы на тему «Азотфиксирующие и фосфатмобилизующие бактерии для стимуляции роста сельскохозяйственных культур»