CC BY
79
УДК 630*114.68
М. Я. Острикова, старший научный сотрудник (Институт леса НАН Беларуси);
А. В. Константинов, аспирант, младший научный сотрудник (Институт леса НАН Беларуси);
И. М. Баландина, научный сотрудник (Институт леса НАН Беларуси)
ВЛИЯНИЕ РИЗОСФЕРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТЬЮ, НА РОСТ И РАЗВИТИЕ СЕЯНЦЕВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ
Установлено положительное влияние предпосевной обработки штаммом Rahnella aquatilis E10 на грунтовую всхожесть семян сосны обыкновенной и показатель средней высоты проростков. Выявлено положительное действие азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий (Rahnella aquatilis E10, штамм 53). При обработке в вегетационный период они оказывают положительное влияние на биометрические показатели роста сеянцев сосны обыкновенной. Высота стволиков при обработке штаммом 53 в среднем равна 5,7, при использовании Rahnella aquatilis E10 - 5,6 см. Генетическая структура штамма 53 соответствовала Serratia plymuthica (99%-ная генетическая идентичность.
The positive effect of the soil pretreatment by strain Rahnella aquatilis E10 on the seed germination of Scots pine and average height of seedlings was established. The positive effect of nitrogen fixing and phosphate mobilizing bacteria was revealed. Rahnella aquatilis E10, strain 53 during treatment in the growing season have a positive impact on the biometric growth parameters of seedlings of pine. Height trunks when processing strain 53 average is 5.7, using Rahnella aquatilis E10 - 5,6 cm. Genetic structure of strain 53 corresponded Serratia plymuthica (99% probability genetic identity).
Введение. Перспективным и экономически целесообразным направлением в микробных технологиях в последние годы признано создание двухкомпонентных биопрепаратов, характеризующихся комплексом положительных свойств, синергическим взаимодействием продуцентов, высокой их выживаемостью и конкурентоспособностью в экосистемах. Полученные на основе высокоэффективных штаммов азот-фиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов биопрепараты повышают биологический потенциал ризосферы, улучшают корневое питание растений, повышают интенсивность ассимиляции корнями питательных веществ, содержащих азот и фосфор [1].
Нормальный рост и здоровье растений определяются, в частности, сложными конкурентными взаимодействиями между разнообразными микроорганизмами, контактирующими с семенами, корнями и наземными вегетирующими органами растений. Наиболее конкурентоспособные микроорганизмы, сумевшие занять такие ключевые ниши, как ризосфера, спермосфера (поверхность и ткани семян и плодов) и филосфера (поверхность листьев) растений, вступают, в свою очередь, в тесные взаимоотношения с растением-хозяином [2]. Ризосферные микроорганизмы выполняют комплекс функций, полезных для растения-хозяина, важнейшей из которых является улучшение корневого питания растения, повышение интенсивности ассимиляции корнями питательных веществ, содержащих азот и фосфор.
Перспективными объектами для получения широкого спектра биопрепаратов различного
происхождения являются штаммы некоторых свободноживущих бактерий (Azotobacter, Klebsiella, Pseudomonas и др.), которые играют значительную роль как в ассоциативных, так и в симбиотических сообществах. Штаммы ризо-сферных микроорганизмов, оказывающих положительное влияние на рост и развитие растений принято называть PGPR (Plant Growth Promotion Rhizosphere) - ризосферные бактерии, способствующие росту растений [1, 3].
Для создания микробиологических препаратов на базе ассоциативных бактерий используются штаммы, которые способны к активному заселению ризосферы, что создает условия для ее искусственного обогащения [4, 5].
Целью данного исследования явилось изучение влияния суточных культур азотфикси-руюших и фосфатмобилизующих бактерий на грунтовую всхожесть семян и биометрические характеристики роста сеянцев сосны обыкновенной в лесных питомниках.
Основная часть. Для проведения эксперимента по определению влияния препаратов на основе микроорганизмов, обладающих азот-фиксирующей и фосфатмобилизирующей способностью на грунтовую всхожесть семян сосны обыкновенной был выбран питомник Ко-реневской ЭЛБ, на котором были проведены следующие мероприятия:
1. Ранней весной на питомнике проведена предпосевная обработка почвы, направленная на создание ровной, разрыхленной поверхности почвы. Она включала весеннюю перепашку почвы без отвалов, боронование, культивацию,
шлейфование, прикатывание, фрезерование и разделку гряд.
2. Для посева были отобраны семена сосны обыкновенной 1 класса. Контрольные семена замачивались в водном растворе перманганата калия в течение 20 ч. Опытные семена замачивались в двух суточных культурах Agrobacterium sp. 17 (азотфиксирующий) и Rahnella aquatilis E10 (азотфиксирующий и фосфатмобилизую-щий) в течение 20 ч. Бульонные культуры микроорганизмов нарабатывали на питательной среде ГРМ-бульон при 28°С в течение 48 ч.
3. После замачивания семена освобождали от раствора культур микроорганизмов. Обработанные семена в день посева подсушивали на открытом воздухе в тени до состояния полной сыпучести.
4. Для уничтожения спор грибов на семенах их протравили сухим протравителем Фундазо-лом из расчета - 4 г на 1 кг семян. Благодаря этому обработанные семена в период прорастания имели зону, свободную от возбудителей грибковых инфекций.
Уход за посевами включал уничтожение сорняков, рыхление почвы. В течение первого месяца после посадки было проведено два рыхления почвы и две прополки вручную.
При изучении влияния ризосферных бактерий на рост сеянцев сосны обыкновенной нами были использованы микробные изоляты, с неизвестным таксономическим положением. Для идентификации применялись методы молеку-лярно-генетической диагностики. Из чистых культур микроорганизмов по методике, описанной А. А. Прозоровым [6], была выделена суммарная ДНК.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в тонкостенных полипропиленовых пробирках объемом 0,2 мл. В ходе исследований был использован следующий состав реакционной смеси: 10*ПЦР буфер (100 мМ Трис НС1, рН 9,2, 250 мМ KCl) - 2,5 мкл, 25 мМ MgC12 - 2,5 мкл, вода (ПЦР-реагент) - 16 мкл, смесь 5 мМ нуклеотидтрифосфатов - 1 мкл, праймер (прямой) 10мМ раствор - 1 мкл, прай-мер (обратный) 10 мМ раствор - 1 мкл, образец ДНК (40 нг/мкл) - 1 мкл, Taq ДНК-полимераза (1 ед./мкл) - 1 мкл.
ПЦР проводили по следующей программе:
1 этап (1 цикл). Денатурация. t = 3 мин, T = 94°С. 1 этап (5 циклов). Денатурация. t = 1 мин, T = 94°С. Отжиг. t = 1 мин, T = 60°С. Элонгация. t = 1 мин, T = 72°С.
2 этап (35 циклов). Денатурация. t = 45 с, T = 94°С. Отжиг. t = 60 с, T = 47°С. Элонгация. t = 2 мин, T = 72°С.
3 этап (1 цикл). Элонгация. t = 7 мин, T = 72°С.
4 этап (1 цикл). Охлаждение реакционной смеси. t = 5 мин, T = 4°С.
Для подтверждения видовой принадлежности бактерий методом секвенирования были использованы универсальные праймеры, фланкирующие фрагмент гена 16S РНК: u1 (прямой) -CCAGCAGCCGCGGTAATACG, u2 (обратный) -ATCGG(C/T)TACCTTGTTACGACTTC.
Электрофоретическое разделение проводили в горизонтальных электрофоретических камерах, используя агарозный гель [7].
Фотодокументирование продуктов электрофореза достигалось за счет видеосканирования в УФ-свете специальной системой Image Master (фирма Amersham Pharmacia Biotech).
Величина размеров каждой амплифициро-ванной зоны вычислялась относительно элек-трофоретической подвижности маркеров с известной молекулярной массой с помощью программного обеспечения 1D-Elite (фирма Amer-sham Pharmacia Biotech).
В конце первого месяца после посадки была проведена оценка всхожести семян. На каждой ленте было заложено по три пробные площадки, размером 1 м2. Также был проведен подсчет количества растений на каждой пробной площади и замер высоты 30 сеянцев (на каждой строчке по 6 растений).
Для изучения влияния ассоциативных микроорганизмов, обладающих азотфиксирующей и фосфатмобилизующей способностью на рост и развитие сеянцев сосны обыкновенной была проведена обработка сеянцев по вегетации. Для этого были наработаны чистые культуры микроорганизмов, подготовлены 2%-ные рабочие растворы микроорганизмов, проведена внекорневая обработка (опрыскивание). Обработку проводили вечером, чтобы избежать гибели микроорганизмов в результате попадания прямых солнечных лучей.
Каждая лента была разбита на пробные площадки и зоны защиты от взаимовлияния бактериальных препаратов. Размер пробных площадок и зон защиты составлял 5^1 м. Опыты по изучению влияния бактериальных препаратов на сеянцы сосны обыкновенной проведены в 3-кратной повторности.
На ленте 1 семена сосны обыкновенной перед посевом были обработаны Agrobacterium sp. 17, для обработки по вегетации использовались штаммы Agrobacterium sp. 17, штамм 53, штамм Ф22, штамм П1/а.
На ленте 2 семена сосны обыкновенной перед посевом обработаны Rachnella aquatilis E10, для обработки по вегетации использовались штаммы R. aquatilis E10, штаммы 64, 57 и П2/1.
На ленте 3 (контроль) семена сосны обыкновенной перед посевом обработаны марганце-во-кислым калием. По вегетации сеянцы штаммами микроорганизмов не обрабатывались.
Оценка эффективности обработки сеянцев сосны обыкновенной по вегетации различными штаммами проводилась в 3-кратной повторно-сти в июле, августе и октябре.
В случае обработки штаммом Agrobacterium Бр. 17 полевая всхожесть семян составила 377 проростков на 1 м2, что значительно ниже показателя всхожести семян, обработанных штаммом Rahnella aquatilis Е10 (721 проросток на 1 м2). Всхожесть в контрольном варианте составила 539 проростков на 1 м2. Выявленные различия вариантов опыта по сравнению с контролем статистически достоверны.
Обработка изучаемыми штаммами семян оказала влияние на показатель средней высоты проростков: средняя высота проростков в варианте с применением Rahnella aquatilis Е10 составила 2,05 мм, что достоверно отличается от контроля (1,77 мм). В случае обработки штаммом Agrobacterium Бр. 17 средняя высота проростков была 1,50 мм, что достоверно ниже контрольного (р = 0,05).
Полученные данные по влиянию ассоциативных микроорганизмов, обладающих азот-фиксирующей и фосфатмобилизующей способностью на рост и развитие сеянцев сосны обыкновенной представлены в таблице.
Анализ сеянцев, обработанных штаммами по вегетации, показал, что предварительная предпосевная обработка семян штаммами азотфикси-рующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (Agrobacterium Бр. 17, Rahnella aquati-lis Е10) в основном оказывает положительное влияние.
Самая большая высота сеянцев наблюдалась при обработке штаммом 53, обладающим фос-фатмобилизующими свойствами (семена про-
шли предпосевную обработку азотфиксатором Agrobacterium Бр. 17) и составила 5,7 см, что выше высоты сеянцев в контроле - 5,5 см. Однако приживаемость данных сеянцев была 53%, что ниже, чем в случае обработки по вегетации фосфатмобилизующим штаммом Ф22 (семена также прошли предпосевную обработку азот-фиксатором Agrobacterium Бр. 17), где этот показатель равен 67,5% (при высоте стволика 5,3 см).
Для проведения дальнейших экспериментов можно рекомендовать штамм 53, обладающий фосфатмобилизующей способностью.
Анализ сеянцев, обработанных штаммами по вегетации Agrobacterium Бр. 17 (предварительная предпосевная обработка тем же штаммом), показал, высота стволика (5,3 см) статистически достоверно не отличалась от контрольного варианта (5,5 см), а приживаемость была выше, чем во всех опытных вариантах и составила 87 %.
Из полученных данных следует, что при проведении дальнейших исследований в качестве азотфиксирующего микроорганизма можно использовать штамм Agrobacterium Бр. 17 в случае предпосевной обработки семян в сочетании с обработкой сеянцев по вегетации данным штаммом.
Предварительная предпосевная обработка штаммами микроорганизмов (в данном случае Rahnella aquatilis Е10) оказывает положительное влияние на рост и приживаемость сеянцев. Наибольшая высота сеянцев была отмечена при обработке по вегетации штаммом Rahnella aquatilis Е10 (5,6 см), хотя приживаемость сеянцев при обработке этим штаммом была ниже, чем в контроле и составила в конце вегетационного периода 67%.
Влияние штаммов азотфиксирующих микроорганизмов на сеянцы сосны обыкновенной
при обработке по вегетации
Штаммы микроорганизмов Средняя высота стволиков, см Диаметр, мм Количество растений, шт. Приживаемость, %
перед обработкой, см через 1,5 месяца после обработки через 3 месяца после обработки перед обработкой через 3 месяца после обработки
Предпосевная обработка Agrobacterium Бр. 17
Agrobacterium Бр. 17 1,9 ± 0,3 3,7 ± 0,7 5,3 ± 0,8 2,3 ± 0,1 98 85 87
53 1,6 ± 0,4 4,2 ± 1,1 5,7 ± 1,2 2,3 ± 0,1 32 17 53
П1/а 1,5 ± 0,4 3,8 ± 1,4 5,2 ± 1,8 2,1 ± 0,1 25 14 56
Ф22 1,9 ± 0,4 3,7 ± 1,2 5,3 ± 1,1 2,4 ± 0,1 40 27 67,5
Предпосевная обработка Rahnella aquatШs Е10
Rahnella aquatШs Е10 3,3 ± 0,4 4,3 ± 0,6 5,6 ± 0,8 2,5 ± 0,1 159 107 67
64 2,3 ± 0,4 4,5 ± 1,4 5,5 ± 1,3 2,0 ± 0,1 20 11 55
П2/1 2,3 ± 0,3 3,7 ± 0,6 4,9 ± 0,8 2,1 ± 0,1 194 101 52
57 2,7 ± 0,4 4,5 ± 0,7 5,5 ± 0,8 2,2 ± 0,1 102 65 63
Контроль 2,5 ± 0,3 4,9 ± 0,6 5,5 ± 0,8 2,0 ± 0,1 96 79 82
Однако общее количество сеянцев в данном варианте опыта было больше, чем в контрольном варианте. Это связано с тем, что предпосевная обработка семян штаммом Rahnella aquatilis E10 привела к повышенной всхожести семян.
Таким образом, из полученных данных следует, что в дальнейшем можно использовать для обработки по вегетации Agrobacterium sp. 17, Rahnella aquatilis E10, штамм 53 с предварительной предпосевной инокуляцией семян штаммом Rahnella aquatilis E10.
Из чистых культур микроорганизмов была выделена суммарная ДНК.
Проведенный спектрофотометрический анализ полученных препаратов нуклеиновых кислот показал, что из бактериальной колонии (2-5 мм2) - 1-2 мкг суммарной ДНК микроорганизмов. Соотношение экстинкций А260/А280 находилось в диапазоне 1,85-1,97, что удовлетворяло требованиям, предъявляемым к методике. Проведенное электрофоретическое фракционирование выявило отсутствие деградации ДНК в препаратах. Размер получаемых фрагментов ДНК в среднем составил 18-25 тыс. п.о.
Образцы чистых культур ризосферных бактерий, для которых была выявлена амплификация с праймерами u1 и u2, были проанализированы (методом секвенирования) по локусу, кодирующему 16S рРНК с целью проведения видовой идентификации по Генному Банку NCBI. Генетическая структура выявленных родов и видов ризосферных бактерий соответствовала следующим образцам, депонированным в базе данных: штамм П2/1 - Pseudomonas sp. (99% генетической идентичности с P. putida), штамм 2/3 - Burkholderia sp. (99% генетической идентичности с Burkholderia phytofirmans), Rahnella aquatilis (100%-ная гомология), штамм 64 - Enterobacter sp. (98% генетической идентичности), штаммы 53 и 57 - Serratia sp. (99% генетической идентичности с S. plymuthica), штамм П1/а - Pseudomonas fluorescens (99% генетической идентичности).
Заключение. Установлено, что предпосевная обработка семян сосны обыкновенной штам-
мами азотфиксирующих и фосфатмобилизую-щих микроорганизмов оказала влияние на показатель средней высоты проростков. Средняя высота проростков в варианте с применением Rahnella aquatilis E10 составила 2,1 см, что достоверно отличается от контроля (1,8 см). В случае обработки штаммом Agrobacterium sp. 17 средняя высота проростков была 1,5 см, что достоверно ниже контрольного показателя при уровне значимости р = 0,05. Грунтовая всхожесть семян при обработке штаммом Rahnella aquatilis E10 была выше, чем в контроле, а при обработке Agrobacterium sp. 17 ниже. Также было выявлено положительное действие штаммов азотфиксирующих и фос-фатмобилизующих микроорганизмов на биометрические показатели роста сеянцев сосны обыкновенной. Наибольший положительный эффект показало использование штамма 53, Rahnella aquatilis E10: высота стволиков - 5,7 и 5,6 см соответственно.
Литература
1. Боронин А. М., Кочетков В. В. Биологические препараты на основе псевдомонад // АГРО XXI. 2000. № 3. C. 3-5.
2. Лугтенберг Б., Камилова Ф. Ризосферные псевдомонады, полезные для растений // Экологическая генетика. 2008. Т. VI. № 2. С. 4-12.
3. Vissey J. K. Plant growth promoting rhizo-bacteria as biofertilizers // Plant soil. 2003. Vol. 225. P.571-586.
4. Кацы Е. И. Молекулярная генетика ассоциативного взаимодействия бактерий и растений. М.: Наука. 2007. 86 с.
5. Фотина П. Н. Применение микробиологических препаратов в сельском хозяйстве // Вестник Астраханского государственного технического университета. 2007. № 4 (39). С. 133-136.
6. Прозоров А. А. Трансформация у бактерий. М.: Наука, 1988. 256 с.
7. Падутов В. Е., Баранов О. Ю., Воропаев Е. В. Методы молекулярно-генетического анализа. Минск: Юнипол, 2007. 176 с.
Поступила 21.01.2014
