CC BY
34
DOI: 10.23868/202107014
АУТОГЕННЫЕ ФИБРИНОВЫЕ МАТРИКСЫ: ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ХИРУРГИИ
Поступила: 03.02.2021 Принята к печати: 05.06.2021 Опубликована on-line: 12.06.2021
С.А. Епифанов1, С.А. Матвеев 1, П.Е. Крайнюков2, 3, В.В. Кокорин1, 3, А.А. Базаев4, И.А. Чекмарева5
1 Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
2 Российский университет дружбы народов, Москва, Россия
3 Центральный военный клинический госпиталь им. П.В. Мандрыка, Москва, Россия
4 Рязанский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова, Рязань, Россия
5 Национальный медицинский исследовательский центр хирургии им. А.В. Вишневского, Москва, Россия
AUTOLOGICAL FIBRIN MATRIXS: PROSPECT SURGERY USE
S.A. Epifanov1, S.A. Matveev1, P.E. Krainyukov2 3, V.V. Kokorin1, 3, A.A. Bazaev4, I.A. Chekmareva5
1 N.I. Pirogov National Medical and Surgical Center, Moscow, Russia
2 RUDN University, Moscow, Russia
3 P.V. Mandryka Central Military Clinical Hospital, Moscow, Russia
4 I.P. Pavlov Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia
5 A.V. Vishnevsky National Medical Research Center of Surgery, Moscow, Russia
e-mail: kokorinvv@Yandex.ru
В статье представлена методика получения аутогенных носителей тканевых микрографтов или скаффолдов, основанная на взаимодействии фибрина и клеток имплантируемого материала, а также способ контролируемого получения аутогенныхх тканевых матриксов необходимого объема, которые могут быть подвергнуты интраоперационному моделированию.
Исследованы процессы образования фибринового сгустка, его основные физические характеристики. Рассмотрен процесс уплотнения матричного геля, который значимо стимулирует прикрепление тканевых микрографтов к поверхности скаффолда.
Ключевые слова: скаффолд, матрикс, микрографт, фибрин, реконструктивная хирургия, пластические материалы.
The article presents a technique for obtaining autologous carriers of tissue micrografts, or scaffolds, based on the interaction of fibrin and cells of the implanted material, as well as a method for the controlled production of autologous tissue matrices of the required volume, which are easily modeled.
The processes of formation of a fibrin clot, its main physical characteristics have been investigated. The process of matrix gel compaction is considered, which significantly stimulates the attachment of tissue micrografts to the scaffold surface, which promotes metabolic processes.
Keywords: scaffold, matrix, micrograft, fibrin, reconstructive surgery, plastic materials.
Введение
Реконструктивная хирургия практически всегда сопряжена с необходимостью использования дополнительных пластических материалов [1, 2]. В качестве таких материалов применяются аутоткани и алло-трансплантаты [1-6], синтетические материалы [7, 8]. Как показывает практика, в большинстве случаев наилучшими свойствами обладают собственные ткани человека — аутотрансплантаты. Однако частый дефицит собственных тканей (в частности, хрящевой) или нежелание пациентов подвергаться дополнительному инвазивному вмешательству и получить дополнительные послеоперационные рубцы в донорской зоне вынуждают хирургов постоянно заниматься поиском новых источников материалов.
Среди аутотрансплантатов чаще всего используют удаленные фрагменты хрящей и костей [2, 6]. Однако, далеко не всегда возможно сформировать из деформированной удаленной части хряща или костной структуры достаточный по величине и размерам трансплантат. Более того, фрагменты реимплантируемого хряща, как правило, не имеют надхрящницы, и в таких условиях нарушения трофики при заживлении хрящ испытывает дистрофические изменения, деформируется, нередко сводя на нет результат операции. Реимплантируемые аутокостные структуры подвержены значительной и неконтролируемой резорбции [3, 9].
Интеграция в современную медицинскую науку биотехнологий, позволило по-новому взглянуть
на существующие методики применения различных имплантационных материалов для реконструктивной хирургии. Одним из таких направлений является использование аутогенных фибриновых матриц получаемых из плазмы крови пациента. Они нашли свои показания в общей хирургии, кардиохирургии под названием «тром-боцитарный концентрат» или «тромбоцитарный гель», а также в челюстно-лицевой хирургии, травматологии и других разделах медицины [10-17].
В связи с этим нами проведено исследование морфологических особенностей пространственной структуры и состава аутогенного тканевого фибрино-вого матрикса.
Материал и методы
Протокол изготовления фибринового матрикса (С.А. Епифанов, 2016) [18] состоял из нескольких этапов. Первый — это получение периферической венозной крови и добавление раствора цитрата натрия, как антикоагулянта; второй этап — это получение обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) методом однократного центрифугирования; третий — введение в композицию тканевых аутографтов (аутохряща) и активация дегра-нуляции тромбоцитов ОТП; четвертый — лиофилизация лейкоцитарно-тромбоцитарно-фибринового геля.
Получение концентрата тромбоцитов регламентировано: «Инструкцией по фракционированию консервированной крови на клеточные компоненты и плазму» (утв.
Минздравом СССР 11.06.1987 № 06-14/24) [19]; Постановлением Правительства РФ от 26 января 2010 г. № 29 «Об утверждении технического регламента о требованиях безопасности крови, ее продуктов, крове-замещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии» [20]; «Руководством по приготовлению, использованию и обеспечению качества компонентов крови» (Совет Европы, 2011, 16-е издание) [21].
В исследование включены образцы венозной крови пациентов, проходивших стационарное лечение в ФГБУ «НМХЦ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России. Критерием исключения при отборе пациентов являлись отклонения показателей общеклинических исследований крови и гемостаза от варианта физиологической нормы для взрослых. Интраоперационно в полученный гель вводили фрагменты гиалиновой хрящевой ткани удаляемой носовой перегородки.
Микроскопические исследования выполняли с применением цитологических, гистологических и электрон-номикроскопических методов.
Фиксацию мазков ОТП производили фиксатором-красителем эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду, в течение 5 мин., далее проводили окраску форменных элементов по Д.Л. Романовскому в течение 20 мин.
Гистологическую обработку тканей проводили общепринятым методом с получением парафиновых блоков ткани, последующей микротомии и окрашиванием гематоксилином и эозином.
Для цели трансмиссионной электронной микроскопии фрагменты полученных материалов фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида с последующей дофиксацией четырехокисью осмия. Полутонкие и ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме 1_КВ-111 (Швеция). Ультратонкие срезы (100-200 А) просматривали в трансмиссионном (просвечивающем) режиме. Трансмиссионная электронная микроскопия выполнена в микроскопе иЕМ-100СХ иЕО_, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Результаты и обсуждение
В среднем, содержание тромбоцитов в цельной венозной крови составило 298 ± 58 х 109/л.
Первым этапом выполнена морфологическая оценка образцов плазмы крови, полученной при однократном центрифугировании (режим — 13 мин. скорость — 2000 об./мин. (630 д)) с добавлением 3,8% раствора цитрата натрия.
Для агрегации тромбоцитов, помимо их активации индукторами, необходимо наличие ионов Са2+. Важным источником кальция может служить 10% раствор хлористого кальция, который участвует в адгезии и агрегации
тромбоцитов, активирует тромбин и фибрин. Результаты исследования зависимости агрегационной способности тромбоцитов от концентрации хлорида кальция представлены в таблице 1.
Полученные результаты свидетельствуют об оптимальной концентрации хлорида кальция для запуска процесса дегрануляции тромбоцитов обогащенной тромбоцитами плазмы (из расчета на 10 мл плазмы) в пределах от 100 до 200 мг/мл. Таким образом, для активации 1 мл плазмы необходимо использовать 0,1-0,2 мл 10%-ого раствора кальция хлорида. Дальнейшее увеличение концентрации Са+2 (свыше 200 мг/мл) не приводит к ускорению каскада реакций; кроме того, наблюдается увеличение показателя времени от начала образования первых нитей фибрина, до достижения сгустком амплитуды 20 мм, что может свидетельствовать о меньшей стабильности сгустка.
При концентрациях Са+2 от 100 до 200 мг/мл, наблюдается оптимальный угол а, отображающий скорость роста фибриновой сети и ее структурообразования (степени увеличения прочности свертка), характеризующий уровень фибриногена и скорости трансформации его в фибрин.
Максимальная амплитуда сгустка, характеризующая динамические свойства соединений фибрина и тромбоцитов (отражает максимальную прочность сгустка), достоверно не различалась и составляла, в среднем, 52 ± 4 мм.
Морфологическая оценка геля, полученного после активации процесса дегрануляции тромбоцитов с использованием 10% раствора кальция хлорида.
Микроскопическая картина характеризовалась наличием разрозненной структуры фибриновых нитей, напоминающих мелкую «паутину», в которую вплетены единичные форменные элементы крови. При увеличении х400, определяется сетчатое строение геля за счет нитей фибрина. Сходная структура была обнаружена и после лиофилизации геля; отмечена несколько большая упорядоченность фибриновых волокон.
Важно отметить, что надосадочная жидкость (жидкость, образующаяся в процессе лиофилизации при изготовлении фибринового матрикса), картина характеризовалась только наличием единичных в поле зрения форменных элементов крови.
Цитоморфология гелевого аутологичного тканевого фибринового матрикса, содержащего аутогенные микро-графты хряща перегородки носа размерами 0,1-1,0 мм, характеризовалась наличием фрагментов хрящевой ткани с рыхло прилежащими нитями фибрина, содержащего единичные форменные элементы крови (рис. 1 ). В ряде полей зрения фибрин характеризовался высокой плотностью упаковки.
При анализе ультраструктуры свежеполученных фрагментов тромбоцитарных концентратов установлено, что они имеют гетероморфное строение. В них чередуются участки с рыхло расположенными короткими
Таблица 1. Показатели тромбоэластограммы в зависимости от концентрации хлористого кальция.
Концентрация Са^2, мг/мл R* Угол а*** МА
50 14,885 ± 4,77 2,44 ±0,76 57,41 ± 5,73 52,13 ± 6,41
100 10,31 ± 2,11 2,485 ±0,67 54,745 ± 9,36 52,19 ± 4,48
150 11,92 ± 2,8 2,655 ±0,74 52,02 ± 9,16 52,24± 3,83
200 12,72 ± 2,18 2,51 ±0,52 54,205 ± 6,63 52,23 ± 5,08
250 17,36 ± 2,65 3,32 ±0,85 50,57 ± 7,62 52,215 ± 6,23
— время от момента постановки пробы до начала образования первых нитей фибрина, **К — время от начала образования первых нитей фибрина до достижения сгустком амплитуды 20мм, ***а(Дпд!е) — угол касательной к кривой, МА — максимальная амплитуда
г
ш
ига
Б
»ГУ'ЛК ж .
Рис. 1. Аутогенный тканевой гелевый фибриновый матрикс и фрагменты гиалиновой хрящевой ткани до (А) и после (Б) уплотнения: 1 — гиалиновая хрящевая ткань; 2 — рыхлый фибрин; 3 — уплотненный фибрин. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: х100
Рис. 2. Результат ТЭМ аутогенного тканевого фибринового матрикса: А — короткие разнонаправленные фибриновые волокна, рыхло расположенные среди электронно-прозрачного матрикса; Б — однонаправленные фибриновые волокна с характерной поперечной исчерченностью; В — фрагмент деградирующего тромбоцита (1) с участками повреждения плазмалеммы (*); разрушающиеся органеллы и гранулы (2); плотно упакованные извитые пучки фибрина (3); Г — плотно упакованные извитые волокна фибрина, имеющие преимущественно однонаправленных ход; Д — умеренно плотно упакованные короткие волокна фибрина вокруг фрагмента эритроцита (*); Е — фрагмент цитоплазмы гранулоцита (1) с частично сохраненной плазмолеммой (*); разрушенные митохондрии с плохо визуализируемыми кристами (2); гранулы различной степени деградации (3); мощные короткие пучки спрессованного фибрина (4). ТЭМ. Ув.: А х3400, Б х8000, В х3400, Г х1400, Д х2300, Е х2300
фибриновыми волокнами и участки более плотной упаковки разнонаправленных пучков. В первом случае субъединицы полимеризующегося фибрина не имеют четкого вектора пространственной ориентации, длина таких волокон составляет около 0,2-0,5 мкм. Важно
отметить, что на больших увеличениях трансмиссионной электронной микроскопии визуализируется поперечная исчерченность, с периодом характерным для фибрина. При этом большую долю по объему занимают электронно-прозрачные пространства (рис. 2).
1
2
В некоторых участках сверток представлен конгломератами и даже пучками волокон фибрина, которые собраны в короткие извитые группы. Закономерностей в их пространственном расположении в большинстве полей зрения не отмечено. Однако в ряде случаев, по-видимому, соответствующих областям, прилегающим к стенкам или дну посуды, зарегистрированы параллельно упакованные пучки волокон, как правило, отделенные друг от друга электронно-плотными фокусами полимеризованного фибрина.
Обращает на себя внимание фактически тотальное отсутствие клеточных и неклеточных элементов крови, что констатируется как на светооптическом уровне при изучении полутонких срезов, так и под электронным микроскопом. Лишь в единичных, почти уникальных полях зрения обнаружены участки клеток и фрагменты дегра-нулированных тромбоцитов. Их мембрана чаще всего частично разрушена и не может быть прослежена по всему периметру (рис. 2е). Внутреннее пространство заполнено мелкозернистой цитоплазмой средней электронной плотности и клеточными органеллами, находящимися на различных стадиях деградации. К фрагментам тромбоцитов, в особенности в участках поврежденной мембраны плотно прилегают пучки фибриновых волокон.
После этапа уплотнения и формирования пластины матрикса, структура и ультраструктура образцов закономерно меняется. В частности, не удается обнаружить рыхло расположенные дискретные волокна фибрина, весь объем образца представлен плотно упакованными пучками мощных извитых волокон, свободные пространства между которыми минимальны, однако, при этом они могут быть успешно визуализированы. Подобная архитектура спрессованного фрагмента придает ему условно губчатое строение с тонкими открытыми порами, которые
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Liu B., Tan X.Y., Liu Y.P. et al. The adjuvant use of stromal vascular fraction and platelet-rich fibrin for autologous adipose tissue transplantation. Tissue Eng. Part C Methods 2013; 19 (1): 1-14.
2. Крайник И.В., Гайворонский И.В., Деев Р.В. и др. Экспериментально-гистологический анализ результатов гетеротопических трансплантаций хрящевой ткани, покрытой белково-тромбоцитарной оболочкой. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; VII(2): 82-91. [Kraynik I.V., Gayvoronsky I.V., Deev R.V. et al. Experimental and histological analysis of the results of heterotopic transplantations of cartilaginous tissue covered with a protein-platelet membrane. Cell Transpl. Tissue Eng. 2012; VII(2): 82-91].
3. Marx R.E. Bone harvest from the posterior ilium. Atlas Oral Maxil-lofac. Surg. Clin. North. Am. 2005; 13(2): 109-18.
4. Marx R.E. Mandibular reconstruction. J. Oral Maxillofac. Surg. 1993; 51 (5): 466-79.
5. Chiu E.S., Gimble J.M. Discussion: Prevalence of endogenous CD34+ adipose stem cells predicts human fat graft retention in a xenograft model. Plast. Reconstr. Surg. 2013; 132 (4): 859-60.
6. Шелиховская М.А., Сыроежкин Ф.А., Типикин В.П. и др. Алло-трансплантаты для хирургии в закрытии интраоперационных дефектов перегородки носа. Аспирантский вестник Поволжья 2020; 1-2: 37-43. [Shelikhovskaya M.A., Syroezhkin F.A., Tipikin V.P. et al. Allografts for surgery in the closure of intraoperative nasal septum defects. Postgraduate Bulletin of the Volga Region 2020; 1-2: 37-43].
7. Zhao Y., Qiao Q., Yue Y. et al. Clinical and histologic evaluation of a new injectable implant: hydrophilic polyacrylamide gel. Ann. Plast. Surg. 2004; 53(3): 267-72.
8. Lytkina, D.N., Fedorishin, D.A., Kalachikova, P.M. et al. Cryo-Structured Materials Based on Polyvinyl Alcohol and Hydroxyapatite for Osteogenesis. J. Funct. Biomater. 2021; 12(1): 18.
9. Сергеева Н.В., Русецкий Ю.Ю., Свистушкин В.М. и др. Методы реимплантации аутотканей при септопластике. Вестник оториноларингологии 2019; 84(5): 93-7. [Sergeeva N.V., Ruseckij Yu.Yu., Svistushkin V.M. et al. Methods of reimplantation of autotissue during septoplasty. Otorhinolaryngology Bulletin 2019; 84(5): 93-7].
10. Gentile P., De Angelis B., Pasin M. et. al. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet-rich plasma: basic and clinical evaluation for cell-based therapies in patients with scars on the face. J. Craniofac. Surg. 2014; 25(1): 267-72.
11. Takikawa M., Ishihara M., Takabayashi Y. et. al. Enhanced healing of mitomycin C-treated healing-impaired wounds in rats with PRP-containing fragmin/protamine microparticles (PRP&F/P MPs). J. Plast. Surg. Hand Surg. 2015; 13: 1-7.
могут омываться экссудатом и тканевой жидкостью, находясь с ними в динамическом биохимическом взаимодействии, а также делая доступными объем материала для мобильных клеточных элементов реактивно измененной соединительной ткани. В зависимости от вектора приложения силы при компрессии, волокна в большей доле имеют однонаправленное расположение.
Обнаружение клеточных элементов или их фрагментов между спрессованными волокнами также остается редкими находками. По сути, на этой стадии изготовления матрикса наличие сохранившихся клеточных элементов выражено чрезвычайно низко и по-видимому, уже практически не влияет на свойства изготовленного аутогенного скаффолда (см. рис. 2).
Заключение
Предложенная методика создания аутогенных носителей тканевых микрографтов или скаффолдов, основанная на взаимодействии фибрина и структур аутотканевого хрящевого имплантируемого материала позволяет получить стабильный сгусток необходимой прочности и объема для его использования в качестве аутотрансплантата, а так же моделировать его в процессе имплантации.
Уплотнение матричного геля значимо стимулирует прикрепление тканевых микрографтов к поверхности скаффолда и способствует формообразованию, моделируемому непосредственно на операционном столе.
Вклад авторов
Авторы внесли равный вклад в работу.
12. Pu L.L., Yoshimura K., Coleman S.R. Future Perspectives of Fat Grafting. Clin. Plast. Surg. 2015; 42 (3): 389-94.
13. Park, Y.L.; Park, K.; Cha, J.M. 3D-Bioprinting Strategies Based on In Situ Bone-Healing Mechanism for Vascularized Bone Tissue Engineering. Micromachines 2021; 12: 287.
14. Gubisch W., Dacho A. Faults and failure: aesthetic rhinoplasty plus brow, eyelid and conchal surgery. Laryngorhinootol. 2013; 92 (Suppl. 1): 73-87.
15. Gubisch W. Extracoрrporeal septoplasty for the markedly deviated septum. Arch. Facial Plast. Surg. 2005; 7(4): 218-26.
16. Брехов В.Л. Хирургическое лечение больных с дефектами костной и хрящевой ткани с применением богатой тромбоцитами аутоплазмы. Автореф. дисс....канд. мед. наук. Курск; 2007: 20. [Surgical treatment of patients with bone and cartilage tissue defects using platelet-rich autoplasma. The autoreferat of thesis. Kursk; 2007].
17. Богдан В.Г., Толстов Д.А, Зафранская М.М. Оценка стимулирующего влияния обогащенной тромбоцитами плазмы в экспериментальной модели культур фибробластов пациентов с трофическими язвами венозной этиологии. Медицинские новости 2014; 9: 87-9. [Bogdan V.G., Tolstov D.A., Zafranskaya M.M. Evaluation of the stimulating effect of platelet-rich plasma in an experimental model of fibroblast cultures in patients with trophic ulcers of venous etiology. Medical news 2014; 9: 87-89].
18. Епифанов С.А. Инновационные технологии в реконструктивной хирургии носа (клинико-экспериментальное исследование). Автореф. дисс. .доктора мед. наук. Москва; 2016: 32. [18.Epifanov S.A. Innovative technologies in reconstructive surgery of the nose (clinical and experimental research). The autoreferat of thesis. Moscow; 2016: 32].
19. Инструкция по фракционированию консервированной крови на клеточные компоненты и плазму. Минздрав СССР. 1987; № 06-14/24. [Instructions for fractionation of canned blood into cellular components and plasma. Approved Ministry of Health of the USSR. 1987; № 06-14/24].
20. Постановление Правительства РФ «Об утверждении технического регламента о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии». 2010; 29. Decree of the Government of the Russian Federation «On the approval of technical regulations on the safety requirements of blood, its products, blood-substituting solutions and technical means used in transfusion-infusion therapy». 2010; 29].
21. Guidelines for the preparation, use and quality assurance of blood components. Council of Europe [EC]. (16-th edition). 2011.
