CC BY
108
Медицинская Иммунология 2003, Т. 5, № 1-2, стр 157-160 ©2003, СПбРОРААКИ
Краткие сообщения
АУГОАНТИТЕЛА К РНК И ДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛКЗДЕЙ
Зайнуллин А.А., Зайнуллина А.С., Богданова А.В., Саттарова Л.И., Ткачева Н.В., Винтер В.Г.
Казанский государственный университет, кафедра биохимии;
* Поликлиника №17 консультативно- диагностическое отделение, г. Казань;
* * Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД, г. Казань
Резюме. Методом ИФА были исследованы сыворотки крови доноров на наличие аутоантител к нуклеиновым кислотам с целью изучения возрастных различий и установления пороговых значений нормы содержания аутоантител для каждого исследуемого антигена. Впервые проводились исследования методом ИФА антител к РНК в сыворотке крови здоровых людей. Были установлены пороговые уровни содержания антител к РНК (0,95±0,50 отн.ед.), нативной ДНК (1,00±0,40 отн.ед.) и денатурированной ДНК (1,12±0,40 отн.ед.) в сыворотке крови здоровых людей. У доноров не было выявлено различий в уровне содержания аутоантител в зависимости от возраста (от 16 до 60 лет), АВО и резус-принадлежности. Достоверно высокое содержание аутоантител к РНК было обнаружено у беременных женщин и рожениц с резус-аллоиммунизацией.
Ключевые слова: аутоантитела, РНК, ДНК.
Zajnullin A A., Zajnullina A.S., Bogdanova A.V., Sattarova L.I., Tkatcheva N.V., Vinter V.G.
ANTI-RNA AND -DNA ANTIBODIES IN THE SERUM OF HEALTHY PEOPLE Abstract. Using ELISA method, we have determined the levels of antinuclear autoantibodies in the serum of donors in order to reveal the age differences and threshold levels for antibodies against each antigen under the investigation. ELISA determination of antinuclear antibodies against RNA in the serum of healthy people has been carried out for the first time. We determined the threshold levels of anti-RNA antibodies (0.95±0.50 rel.un.), anti-dsDNA antibodies (1.00±0.40 rel.un.) and anti-ssDNA antibodies (1.12±0.40 rel.un.) in the serum of healthy people. In donors, we didn’t reveal any differences in autoantibodies levels, depending on age (16-60 years), ABO and Rhesus blood factor. The significantly high level of autoantibodies against RNA was revealed in pregnants and puerperants. (Med.Immunol., 2003, vol.5, N1-2, pp 157-160)
состояний вопрос о разграничении нормы и патологии иногда остается открытым по причине мало изученности нормального уровня аутоантител. Известно, уровень содержания ААТ у здоровых людей может колебаться в широких пределах и зависеть от физиологических состояний организма (стресса, беременности, физических перегрузок), а также факторов среды [1,9]. В литературе имеются сведения, что в различные периоды онтогенеза в сыворотке крови у здоровых людей наблюдается повышение уровня содержания ААТ при старении, а также в раннем возрасте (1-10 лет) [4, 11, 13].
Наиболее исследована диагностическая значимость ААТ к ДНК, значительно менее изучено патогенетическое значение ААТ к РНК. Практически нет данных об уровне содержания ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых людей в зависимости от возраста, в то время как при диагностике аутоиммунных заболеваний всегда имеется необходимость раз-
Введение
Наличие в сыворотке крови аутоантител (ААТ) к антигенам собственных тканей является одним из общепризнанных диагностических показателей таких аутоиммунных заболеваний (АИЗ) как системная красная волчанка, системная склеродермия, ревматоидный артрит и др. [10, 12, 14]. Антитела к различным аутоантигенам обнаружены многими исследователями в сыворотке крови не только больных АИЗ, но и у здоровых людей, хотя и в небольших титрах. При диагностике некоторых аутоиммунных
Адрес для переписки:
Зайнуллин Алмаз Анасович, аспирант кафедры биохимии КГУ.
420100, г. Казань, пр. Победы, д.192, кв. 41.
Тел.: (8432)77-51-04.
E-mail: [email protected]
граничения изменений содержания ААТ к РНК, обусловленных развитием аутоиммунных патологий от изменений, связанных с возрастом и физиологических состояний организма.
В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение уровня содержания ААТ к РНК, нативной ДНК (нДНК) и денатурированной ДНК (дДНК) в сыворотке крови доноров в зависимости от возраста, резус-фактора и группы крови, а также в сыворотке крови беременных женщин, рожениц и их детей с резус-изоиммунизацией.
Материалы и методы
В работе анализировали сыворотки крови 250 здоровых людей в возрасте от 16 до 60 лет. Венозную кровь здоровых людей получали из донорских пунктов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии (98 человек) и Республиканской клинической больницы (РКБ) (152 человека). Из крови получали сыворотку, разливали по аликвотам и хранили при -200°С. Была проанализирована также сыворотка крови па-
ААТ (отн.ед.)
Рис. 1. График вариации ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей (%). По оси X - содержание ААТ к нуклеиновым кислотам (отн.ед.). По оси У - частота встречаемости (%).
циентов с резус-изоиммунизацией: 57 женщин на сроке беременности 20-40 недель, проходящих обследование в медико-генетическом центре РКБ, 69 рожениц с новорожденными детьми из родильного отделения РКБ г. Казани.
ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на полистироловых планшетах (НПО “Поли-мед”, г. Санкт-Петербург) по методикам, разработанными авторами [2, 5]. При определении ААТ к нуклеиновым кислотам в качестве отрицательного стандарта использовали пул сывороток 10 здоровых доноров с низкими титрами антител к нуклеиновым кислотам. Полученные данные выражали в относительных единицах (отн. ед.), вычисленных по формуле:
ОП45о бзо исследуемой сыворотки
отн. ед.=__________________________________
ОП стандарта
450-630 г
Измерения оптической плотности проводили на приборе ОрвуБ МИ. (“Оупех”, США) при длинах волны 450 и 630 нм.
О чувствительности и воспроизводимости ИФА судили, соответственно, по среднему арифметическому (М) и коэффициенту вариации (С ) из повторов каждой индивидуальной сыворотки. В работе использовали результаты экспериментов, в которых С не превышает 5-10% - общепринятого значения для данного теста [3]. Для определения среднего уровня ААТ к нуклеиновым кислотам в обследованной группе людей вычисляли взвешенное среднее, которое позволяет учитывать точность определения среднего арифметического для индивидуальных сывороток [7].
В качестве РНК-АГ использовали суммарную дрожжевую РНК (НПО «Вектор», г. Новосибирск), которую дополнительно депротеинизировали фенольным методом до соотношения оптических плотностей Е /Е =2,3. В качестве ДНК-АГ использо-260 280
вали очищенный ( Е /^ш= 1-86) коммерческий препарат ДНК (НПО «Йектор», г. Новосибирск). Денатурированную ДНК готовили следующим образом: прогревали раствор ДНК (50 мкг/мл) с добавлением 0,05% формальдегида в течение 15 минут при + 100° С с последующим быстрым охлаждением на льду. О степени денатурации судили по гиперхром-ному эффекту, который составил 30%.
Полученные препараты РНК, нативной ДНК и денатурированной ДНК разливали по порциям и хранили в замороженном состоянии при -20°С.
Результаты и обсуждение
Нами были исследованы сыворотки крови здоровых доноров в возрасте от 16 до 60 лет. Результаты наших исследований показали, что уровень со-
держания ААТ к РНК варьирует в широких пределах - от 0,1 до 2,3 отн. ед. Числовые показатели содержания ААТ соответствовали закону нормального распределения, поэтому при вычислении границ содержания ААТ в норме использовали формулы, принятые для этого вида распределения. Были вычислены средние (х ), стандартная ошибка (т), стандартное отклонение (ст). Содержание ААТ к РНК в сыворотке крови здоровых людей составило
0,95±0,01 отн.ед., у была равна 0,25 отн.ед. Для разграничения нормы от патологии, мы вычислили пороговые уровни ААТ к РНК в норме, которые составили: для х ±2ст - 0,95±0,50 отн.ед. (р<0,05) и для х ±3ст - 0,9^±0,75 отн.ед. (р<0,01).
Данные анализа частоты встречаемости индивидуальных уровней содержания ААТ к РНК в сыворотке крови среди обследованных лиц представлены на рисунке 1. У большинства (61%) здоровых людей
зоне 0,71-1,3 отн. ед., у 25% людей обнаруживается значительно более низкое (0,1-0,7 отн.ед.) и у 14% высокое (1,31-2,3 отн.ед.) содержание ААТ к РНК.
Уровень содержания ААТ к нДНК в сыворотке крови здоровых доноров находился в пределах 0,53-2,20 отн.ед. Средний уровень ААТ к нДНК составил 1,00±0,02 отн.ед., пороговый уровень - 1,00±0,40 отн.ед. (х ±2ст) и 1,00±0,60 отн.ед. (х ±3ст). У 49% обследованных доноров уровень содержания ААТ к нДНК находится в диапазоне 0,7-1,1 отн.ед. Низкий уровень содержания антител (0,51-0,7 отн.ед.) обнаружен у 13% людей, а высокий уровень содержания ААТ к нДНК (1,1-2,2) у 35% здоровых доноров.
По распределению индивидуальных уровней содержания ААТ к дДНК складывается похожая картина. Средний уровень составил 1,12±0,02 отн.ед. Значения варьируют от 0,5 до 2 отн. ед. Пороговый уровень ААТ к дДНК в норме составил 1,12±0,40 отн.ед. (х ±2ст) и 1,12±0,60 отн.ед. (х ±3ст). 46% доноров имеют диапа-
уровень содержания ААТ к РНК находится в диапа-
Табл.1. УРОВЕНЬ СОДЕРЖАНИЯ ААТ К НУКЛЕИНОВЫМ КИСЛОТАМ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП (ОТН.ЕД.)
Возрастные группы Кол-во человек ААТ к РНК ААТкнДНК ААТкдДНК
16-20 12 1,12±0,16 0,87+0,08 0,87±0,77
21-30 70 0,99±0,09 1,06+0,06 1,14±0,06
31-40 81 0,93±0,03 1,07+0,07 1,26±0,14
41-50 65 1,03±0,05 1,11 ±0,09 1,19±0,08
51-60 22 0,91 ±0,07 0,91 ±0,18 0,91 ±0,13
16-60 250 0,95±0,01 1,00±0,02 1,12±0,02
Табл. 2. ЗАВИСИМОСТЬ УРОВНЯ СОДЕРЖАНИЯ ААТ К НУКЛЕИНОВЫМ КИСЛОТАМ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ ОТ РЕЗУС- И ABO- ПРИНАДЛЕЖНОСТИ (ОТН.ВД.)
резус- и АВО-принадлежность ААТ к РНК ААТ к нДНК ААТ кдДНК Кол-во человек
Rh(+) 0,93±0,05 1,05±0,04 1,16±0,05 78
Rh(-) 0,94±0,20 1,17±0,23 1,14±0,19 7
0(l) 0,98±0,10 1,16±0,08 1,16±0,07 22
A(ll) 0,86±0,07 1,05±0,07 1,21 ±013 29
В(Ш) 0,95±0,14 1,00±0,10 1,09±0,11 14
AB(IV) 0,95±0,16 0,98±0,09 1,07±0,08 10
Здоровые доноры 0,95±0,01 1,00±0,02 1,12±0,02 87
Табл.З. УРОВЕНЬ СОДЕРЖАНИЯ ААТ К НУКЛЕИНОВЫМ КИСЛОТАМ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН, РОЖЕНИЦ И ИХ ДЕТЕЙ (ОТН.ЕД.)
Обследованные группы ААТ к РНК ААТкнДНК ААТкдДНК Кол-во человек
Беременные женщины 1,55+0,13* 0,94±0,09 0,80±0,06 57
Роженицы 1,60+0,12* 0,91+0,05 1,05±0,06 69
Новорожденные дети 2,28+0,96 1,20±0,10 1,66+0,17* 67
Здоровые доноры 0,95±0,01 1,00+0,02 1,12±0,02 250
Примечание: различие по сравнению со средним значением в общей группе здоровых лиц: * - достоверно при р<0,05
зон значений уровней содержания ААТ от 0,71 до 1,1; 10% от 0,5 до 0,7 и 42% от 1,11 до 2 отн. ед. Числовые данные содержания ААТ кдДНК и нДНК соответствовали закону нормального распределения.
Исследованная группа доноров была не однородная по возрасту и включала людей от 16 до 60 лет. Нами был проведен анализ уровня содержания АДТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей разных возрастных групп (табл.1), но отличий от генеральной совокупности не было обнаружено ни в одной возрастной группе. Так же не обнаружено достоверных отличий при сравнении доноров, различающихся по группам крови и резус-фактору (табл.2). Возможно, изменения уровня содержания нормальных ААТ наблюдается в более раннем возрасте (1-10 лет) [13] и у пожилых людей старше 60 лет [11], в данной группе доноров таких изменений нами не было обнаружено.
При исследовании женщин при беременности, в послеродовом периоде и у их новорожденных детей, а также детей грудного и раннего возраста многими авторами отмечается повышение уровня аутоантител к собственным антигенам [6,8]. Нами было обнаружено достоверно высокое содержание ААТ к РНК по сравнению с группой здоровых доноров в сыворотках крови женщин на сроке беременности 20-40 недель и рожениц с резус-изоиммунизацией (табл. 3). У новорожденных детей также был отмечен высокий уровень содержания ААТ к РНК и д ДНК (2,28±0,96 и 1,66±0,17 отн.ед. соответственно). Однако в случае с ААТ к РНК не было достоверных отличий от среднего уровня ААТ доноров по причине большого разброса данных и, вследствие этого, большого значения дисперсии. Такая ситуация вполне возможна, т. к. дети, сыворотку которых мы анализировали не были обследованы и, возможно, имели различные патологии, что и могло привести к столь широкому разбросу значений.
По содержанию ААТ к нДНК в сыворотке крови беременных, рожениц и новорожденных достоверные отличия по сравнению с группой здоровых доноров не было обнаружено. Не были также выявлены достоверные различия в уровне ААТ к дДНК в сыворотке крови у исследованных беременных женщин и рожениц от нормы (табл.З).
Выводы
1. Определены пороговые уровни содержания ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых доноров: пороговый уровень ААТ к РНК составил 0,95±0,50 отн.ед. (р<0,05) и 0,95±0,75 отн.ед. (р<0,01); к нДНК 1,00±0,40 отн.ед. (р<0,05) и
1,00±0,60 отн.ед. (р<0,01); к дДНК 1,12±0,40 отн. ед. (р<0,05) и 1,12±0,60 отн.ед. (р<0,01).
2. Возрастные отличия, резус-принадлежность и различия в группах крови не влияют на уровень содержания ААТ к нуклеиновым кислотам в сыворотке крови здоровых людей.
3. Обнаружено достоверное повышение уровня содержания ААТ к РНК в сыворотке крови женщин на сроке беременности 20-40 недель и рожениц с ре-зус-изоиммунизированных по сравнению с группой здоровых доноров.
4. В сыворотке крови новорожденных детей уровень содержания ААТ к дДНК достоверно превышает среднее значение этого показателя в группе здоровых доноров.
Список литературы
1. Добродеева Л. К., Суслонова Г. А. Аутоантитела у практически здоровых людей // Иммунология. - 1990. -N 2. - С. 52-54.
2. Зайнуллина А.С., Саттарова Л.И., Зайнуллин А.А. и др. Иммуноферментное определение антител к РНК на полистироловых планшетах отечественного производства. // Биотехнология. - 2000. - N 2. - С. 84-89.
3. Иммуноферментный анализ (пер. с англ.) / Под ред. Нго Н.Н., Ленхоффа Г. М. - М.: Мир, 1988. - 446 с.
4. Клемпарская Н.Н., Шальнова Г. А. Нормальные аутоантитела как радоизащитные факторы. - М.: Атомиздат, 1978. - 135 с.
5. Саттарова Л. И., Гафиятуллина Л. А., Аглиуллина Д. Г., Винтер В.Г. Оптимизация иммуноферментной тест-системы для определения аутоантител к ДНК // Биотехнология. - 1994. - N 11-12. - С. 38-41.
6. Таранова Н.П., Гузеева В.И., Коровин А.М., Лучако-ва О.С. Антитела к галактоцереброзидам мозга в сыворотке крови у здоровых детей раннего возраста и женщин // Иммунология. - 1993. - N 6. - С. 57-58
7. Тейлор Д. Введение в теорию ошибок - М.: Мир, 1985. - 272 с.
8. Трунова Л.А., Шваюн А.П., Амирова Т.Д. и др. Изучение иммунного статуса новорожденных от здоровых и больных матерей // Иммунология. - 1989. - N 3. - С. 75-77.
9. Шубик В.М., Левин М.Я. Иммунитет и здоровье спортсменов. - М.: Физкультура и спорт, 1985. -175 с.
10. Charles P.J., Maini R.N. The clinical implications of autoantibodies detection in rheumatology // J. Roy Coll. Physicians London. - 1993. - Vol.27. - N4. - P. 358-362.
11. Hooper B., Frion G., Chandra P. Autoimmunity in a reral community // Clin. Exp. Immun. - 1972. - Vol. 12, N 1. - P. 79-83.
12.JayaramN., Sharma B., Sehgal S. Autoantibody profile in systemic lupus erythematosus // Indian J. Patol. and Microbiol. - 1990. - Vol.33, N 1. -P. 57-63.
13. Kasjanova A., Cebecauer L., Balaz V. Antibodies against ssDNA in persons of various age // Mechanisms of ageing and development. - 1984. - Vol. 28. - P. 289-295.
14. Kuwana M„ Okano Y., Kaburaki J. et al. Racial differences in the distribution of systemic sclerosis - related serum antinuclear antibodies // Arthritis Rheum. - 1994. - Vol. 37, N6. - P. 902-906.
поступила в редакцию 20.09.2002 отправлена на доработку 10.03.2003 принята к печати 11.04.2003
