CC BY
48
Медицинская Иммунология 2003, Т. 5, М 5-6, стр 625-628 © 2003, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ К НАТИВНОЙ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЕ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА В РАННИЙ ПЕРИОД ЗАБОЛЕВАНИЯ
Рязанова Г.А., Коксин В.П., Хамзина Р.В., Винтер В.Г., Романенко О.М.
Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями М3 РТ, Россия
Резюме. Методом ИФА были исследоваиы сыворотки крови ВИЧ-инфицированных и здоровых доноров на наличие антител к нативной ДНК (нДНК). Впервые проводилось изучение показателей активности антител к нДНК в сыворотках крови больных ВИЧ-инфекцией, находящихся на ранней стадии заболевания. Непараметрическим Т-критерием Манна-Уитни было показано, что в сыворотках крови больных в период ранней ВИЧ инфекции показатели активности антител к нДНК на 95% уровне значимости были достоверно выше, чем в группе доноров.
Ключевые слова: aumu-нДНК антитела, анти-ВИЧ антитела, нДНК.
Rjazanova G.A., Kocksin V.P., Khamzina R.V., Vinter V.G., Romanenko O.M.
ANTI-DSDNA ANTIBODIES ACTIVITY IN EARLY HIV-INFECTION
Abstract. Using ELISA method we have determined the levels of anti-dsDNA antibodies in the sera of HIV-infected patients and healthy donors. The study of anti-dsDNA antibodies activity in the sera of HIV-infected patients at early stage of the disease has been carried out for the first time. The use of the T-criterion Manna-Witny showed that in the sera of HIV-infected patients in early HIV-infection the indices of anti-dsDNA antibodies activity at 95% significance level were significantly higher than in the sera of healthy (Med.Immunol., 2003, vol.5, № 5-6, pp 625-628)
Введение
Вопрос образования антител к нДНК на стадии первичного гуморального ответа на заражение ВИЧ остается открытым, имеется лишь информация о различной частоте встречаемости антител к нДНК на поздней стадии ВИЧ-инфекции. Существует мнение, что подобные антитела, перекрестно реагирующие как с бактериальными и вирусными антигенами, так и с собственными антигенами организма, могут быть первой линией защиты от чужеродных агентов [1,2].
Адрес для переписки:
420097, г.Казань, ул. Вишневского 2а.
Тел.: (8432) 38-19-06, факс 36-45-76.
E-mail: lani@mail.ru.
Таким образом, целью настоящей работы явилось изучение активности антител к нДНК и ВИЧ методом ИФА в сыворотках крови инфицированных ВИЧ, в период первичного гуморального ответа на вирусную инфекцию.
Материалы и методы
В работе были использованы образцы сывороток крови ВИЧ-инфицированных, проходящих плановые медицинские осмотры в Республиканском центре по профилактике и борьбе со СПИД и ИЗ М3 РТ. Диагноз был установлен у всех больных на основании клинических данных и подтвержден методами ИФА и иммунного блота фирмы “Bio Rad” (Франция). Для серологического изучения сывороток на наличие антител к ВИЧ использовали тест-
системы “ВИЧ-1, ВИЧ-2-ИФА - Авиценна” фирмы “Авиценна” (Россия) и “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2” фирмы “ВекторБест” (Россия).
В качестве положительного контроля для определения активности антител к нДНК была взята сыворотка от больного системной красной волчанкой (СКВ), дающая положительную реакцию в тест-системе латексагглютинации фирмы “Human” (Германия). Сыворотка больного СКВ в ИФА характеризовалась активностью с титром анти-нДНК антител 1: 3200. Определение активности анти-нДНК антител провели на сыворотках крови 43 больных ВИЧ-инфекцией, у которых в начале наблюдения в иммуноблоте начинали проявляться необходимые сочетания анти-ВИЧ антител к вирусным белкам, но они требовали повторного подтверждения. Были взяты сыворотки крови у 85 здоровых доноров, отрицательных по ВИЧ, HBsAg и гепатиту С, для определения уровня содержания антител к нДНК в норме. Определение уровня содержания анти-нДНК антител проводили на полисти-роловых планшетах “Медполимер” (Россия) методом иммуноферментного анализа, ранее оптимизированным в нашей лаборатории. В качестве антигена использовали лиофилизированную нДНК, выделенную из эритроцитов цыплят производства фирмы “Reanal” (Венгрия).
Исследуемые образцы сыворотки инкубировали при 56°С в течение 40 мин для инактивации белков системы комплемента и диссоциации иммунных комплексов. Для выявления в лунках планшета антител, связавшихся с ДНК, использовали конъюгированные с пероксидазой антитела против IgG человека фирмы “Вектор-Бест”.
ИФА проводили по следующей схеме. В лунки планшетов вносили раствор ДНК (10 мкг/мл) на
0,1М фосфат-0,05М цитратном буфере (ЦБ) pH 5,0. Планшеты с сорбируемой ДНК инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, после чего не связавшуюся ДНК трижды отмывали фосфатносолевым буфером с твином (ФСБ-Т). Далее в подготовленные планшеты вносили сыворотки крови, предварительно разведенные 1:100, после чего планшеты инкубировали в течение 40 мин при 37°С. По окончании инкубации планшеты трижды промывали ФСБ-Т и вносили рабочий раствор конъюгата. В качестве хромогена использовали тетраметилбензи-дин (ТМБ) и через 30 мин измеряли интенсивность цветной реакции ИФА на спектрофотометре “Multiskan” в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм. Для сравнения воспроизводимости данных, полученных в разные дни и с конъюгатами разных серий, в качестве контроля использовали пул сывороток, произведенных фирмой “Bio Rad”, отрицательных по ВИЧ, HBsAg и гепатиту С. Содержание антител к нДНК в исследуемых образцах сывороток крови выражали в относительных
единицах (отн.ед.) [1], которые вычисляли по формуле:
ОП^о исследуемой сыворотки
*ОП (К-) , (отн.ед.),
450 сред.
где*ОП (К-) - среднее значение оптической плот-
450 сред.
кости отрицательного контроля.
Параллельно с изучением активности антител к нДНК в относительных единицах, мы провели мониторинг серологической активности антител в титрах у 5 ВИЧ-инфицированных. Предельным разведением концентрации антител к нДНК считали то, при котором содержание антител в относительных единицах было не менее 2,1.
Характер распределения данных в полученных выборках индивидуальных значений уровня содержания антител к нДНК анализировали с применением коэффициента асимметрии (Аз) и медианы (Ме). Так как числовые показатели содержания анти-нДНК антител не соответствовали закону нормального распределения, поэтому для оценки различий между отдельными выборками использовали непараметрический ранговый Т-критерий Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
Нами были исследованы сыворотки крови здоровых доноров в возрасте от 17 до 39 лет. Результаты анализа представлены на рис.1.
Показатели активности антител к нДНК у доноров колебались в пределах от 0,978 до 3,018 отн.ед. Подавляющая часть индивидуальных показателей уровня содержания антител к нДНК образовывала компактную группу, в которой содержание антител не превышало 2,0 отн.ед.(60%). Тем не менее, у 40% обследуемых лиц количество антинуклеарных антител превосходило этот уровень. В этой же группе у 34 доноров были определены титры анти-нДНК антител в сыворотках крови. Титры антител к нДНК в ИФА у доноров изменялись в диапазоне от 1:8 до 1:128, но 15 сывороток крови имели титр 1:34 (44%).
На следующем этапе работы мы оценивали показатели активности антител к нДНК у 43 ВИЧ-инфицированных, которые находились на стадии ранней ВИЧ-инфекции. В то же время у 5 человек из этой группы провели параллельно мониторинг активности анти-нДНК и анти-ВИЧ антител в титрах. Предварительно мы исследовали характер распределения показателей активности антител в отн.ед. Общее количество проб - 101 сыворотка крови. Как показано на рис.2, уровень содержания антител к нДНК колебался в диапазоне от 0,94 до 19,87 отн.ед., что говорило о существенном увеличении размаха вариабельности индивидуальных показателей содержания антинуклеарных антител, наблюдаемом в ран-
ний период ВИЧ - инфекции. Преобладающая часть значений находилась выше 2,0 отн.ед. и составляла 88%, в то время как у 12% эти значения были ниже 2,0 отн.ед. Таким образом, используя непараметрический Т-критерий Манна-Уитни, было показано, что в сыворотках крови больных в период ранней ВИЧ инфекции показатели активности антител к нДНК на 95%-ном уровне значимости были достоверно выше, чем в группе доноров.
Далее мы изучили активность антител к нДНК у ВИЧ-инфицированных в ходе длительного диспансерного наблюдения. Наблюдаемые лица имели различный диапазон изменения показателей активное-
20 -
0)
! <5
X
СГ
I
со
0 -I-----,------,-----,------,------,------,-----,------,-----,
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
количество проб
Рис.1. Распределение активности антител к нДНК у доноров, отрицательных по ВИЧ, НВзАд и гепатиту С
ти антинуклеарных антител и титра анти-ВИЧ антител (табл.1).
Проведенные исследования по определению активности анти-нДНК и анти-ВИЧ антител у больных ВИЧ-инфекцией в процессе мониторинга первичного гуморального ответа на ВИЧ показали: во-первых, на всем протяжении наблюдения отмечалась активность антител к нДНК. Во-вторых, в случае ВП-4994 отсутствовала корреляция между специфическим антителообразованием (антитела к ВИЧ) и активностью анти-нДНК антител. Кроме того, у ВП-4994 активность антител к нДНК оставалась на достаточно высоком уровне на всем протяжении мони-
20 -,
с!
ш
X
Ьй ♦ ♦ ♦
X
сх
0 20 40 60 80 100
количество проб
Рис.2. Характер распределения активности антител к нДНК у ВИЧ-инфицированных в ранний период заболевания
Табл.1. МОНИТОРИНГ АКТИВНОСТИ АНТИ-нДНК И АНТИ-ВИЧ АНТИТЕЛ В ПЕРИОД ФОРМИРОВАНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА НА ВИЧ-ИНФЕКЦИЮ
Номер пациента* Сроки исследований (дни) Титр анти-ВИЧ-АТ в ИФА Титр анти-нДНК-АТ в ИФА Показатель активности анти-нДНК АТ (отн.ед.)
начало 1:16 1:200 4,73
ВП-4839 31 день 1:64 1:100 3,29
237 дней 1:128 1:50 3,09
390 дней 1:512 1:50 2,52
начало 1:64 1:200 5,78
21 день 1:1600 1:200 4,15
ВП-4994 73 дня 1:512 1:200 3,35
98 дней 1:512 1:800 4,71
172 дня 1:128 1:400 3,37
312 дней 1:256 1:200 3,41
начало 1:248 1:50 1,55
ВП-1931 16 дней 1:2496 1:400 3,39
21 день 1:4992 1:100 2,31
начало 1:39 1:50 1,77
ВП-1784 25 дней 1:39 1:100 2,03
41 день 1:156 1:1600 6,32
начало 1:156 1:6400 19,87
ВП-2230 6 дней 1:1248 1:1600 11,03
27 дней 1:1248 1:6400 3,64
Примечание: *- номер присвоен при получении первого положительного результата.
торинга. В то же время как у В П-4839 наблюдали стабильное снижение показателей активности анти-нДНК антител на фоне медленного нарастания титра анти-ВИЧ антител (табл. 1). В-третьих, среди наблюдаемых больных ВИЧ-инфекцией у ВП-1931, ВП-1784 и ВП-2230 очень скоро проявились необходимые сочетания анти-ВИЧ антител к вирусным белкам в иммуноблоте. По распределению индивидуальных показателей уровня содержания антител к нДНК в период наблюдения у ВП-1934 и ВП-2230 также отсутствовала корреляция между активностью анти-ВИЧ антител и титрами анти-нДНК антител, как и у ВП-4994. Причем, у больного ВП-2230 зафиксирован максимальный уровень антинуклеар-ных антител, как в титрах, так и в относительных единицах. Только у ВП-1784 отмечалась прямая корреляция между активностью анти-ВИЧ антител и показателями активности антител к нДНК.
Установлено, что антитела к ДНК встречаются и у клинически здоровых лиц, поэтому целесообразно упомянуть об антителах, направленных против собственных антигенов и мимикрирующих детерминант бактерий и вирусов [3]. В связи с этим нами были исследованы сыворотки крови здоровых доноров, отрицательных по ВИЧ, HBsAg и гепатиту С. Результаты наших исследований показали, что уровень содержания антител к нДНК варьировал в широких пределах - от 0,978 до 3,018 отн.ед., но 60% доноров имели диапазон значений показателей активности антител к нДНК от 0,978 до 1,978 отн.ед.
На данный момент известно, что при ВИЧ-инфекции большинство антител не являются специфическими к вирусным антигенам, а отражают поликлональную активацию В-лимфоцитов [4,5]; нами было обнаружено достоверно высокое содержание антител к нДНК по сравнению с группой здоровых доноров в сыворотках крови больных ВИЧ-инфекцией в ранний период заболевания. С другой стороны, высокий уровень анти-гистоновых и анти-нДНК антител, наблюдаемый у ВИЧ-инфицированных,
может быть связан с высвобождением ядерного содержимого в ходе программируемой гибели клеток, то есть при апоптозе [6]. Однако вопросы о диагностической и прогностической значимости антител к нДНК требуют дальнейшего изучения.
Список литературы
1. Абдрахманова JI.Р., Зайнуллин А.А., Зайнулли-на А.С., Винтер В.Г. Определение антинуклеарных антител при иммуноконфликтной беременности // Медицинская иммунология.-2003.-Т.5,Ш-2.-С.57-66.
2. Киселева В.И., Леках И.В., Безяева Г.П. Скрытые натуральные аутоантитела, реагирующие с ДНК и кардиолипином, перекрестно взаимодействуют с антигенами ВИЧ // Иммунология.-2001 ,-N 2.-С.12-15.
3. Леках И.В., Ротт Г.М., Поверенный А.М. Гетерогенность и авидность аутоантител, реагирующих с ДНК // Молекулярная биология. - 1991.- т.25.-Вып.5.-С.1391-1399.
4. Сучков С.В., Габибов А.Г. Аутоантитела различных уровней специфичности и их клиническое значение при системных и локализованных формах аутоиммунной патологии // Аллергология и имму-НОЛОГИЯ.-2001,- т.2, N 1.-С.137-147.
5. Amadori A., Zamarchi R., Ciminale V. HIV-1-specific В cell activation. A major constituent of spontaneous В cell activation during HIV-1 infection //J.Immunol.-1989-Vol,143, N 7.-P.46-52.
6. Fournier A.M., Fondere J.M., Alix-Panabieres C. Spontaneous secretion of immunoglobulins and anti-HIV-1 antibodies by in vivo activated В lymphocytes from HIV-infected subjects: monocyte and natural killer cell requirement for in vitro terminal differentiation into plasma cells// Clin.Immunol.-2002.-Vol. 103.N1.-P.98-109.
7. Muller W.E., Shoroder H.C., Ushijima H. gpl20 of HIV-1 induces apoptosis in rat cortical cell cultures: prevention by memantine// Eur.J.Pharmacol.-1992,-Vol.226, N 3.-P.9-14.
поступила в редакцию 17.09.2003 принята к печати 23.12.2003
