Атф ингибирует спонтанную сократимость предсердий крыс

Зверев Алексей Анатольевич; Аникина Татьяна Андреевна; Искаков Никита Георгиевич; Леонов Николай Владиславович; Зефиров Тимур Львович

2018, Т. 160, кн. 4 С. 558-567

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ

ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)

УДК 617

АТФ ИНГИБИРУЕТ СПОНТАННУЮ СОКРАТИМОСТЬ ПРЕДСЕРДИЙ КРЫС

A.A. Зверев, T.A. Аникина, Н.Г. Искаков, Н.В. Леонов, ^Л. Зефиров

Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, 420008, Россия

Аннотация

Первые доказательства, что аденозинтрифосфат (АТФ) и связанные с ним нуклео-тиды функционируют как нейротрансмиттеры, были получены еще в 70-х годах XX в. АТФ действует на пре- и постсинаптические рецепторы, которые получили название пуриновые. В сердце крыс обнаружены P1-рецепторы, чувствительные к аденозину, и Р2-рецепторы, активируемые АТФ. Действие АТФ на показатели электрической активности и сократимость миокарда крыс изучали на препаратах правого предсердия со спонтанной активностью. Эксперименты показали, что АТФ (10-6 М) в высоких концентрациях вызывает отрицательное инотропное и хронотропное действие при участии Р1-рецепторов. АТФ в концентрации 10-7 М вызывает двухфазные изменения частоты и длительности ПД на уровне 20%, 50% и 90% реполяризации, не изменяя мембранный потенциал, амплитуду и длительность деполяризации рабочих кардиомиоцитов правого предсердия.

Ключевые слова: пуринорецепторы, АТФ, потенциал действия, сократимость миокарда

Введение

Аденозинтрифосфат (АТФ) является многофункциональным нуклеотидом известным как «энергетическая валюта клетки». АТФ - это один из мономеров, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот, а также донатор фосфатных групп для молекул системы вторичных посредников, например протеинкиназ [1]. За последние годы накопилось много данных о том, что АТФ, кроме внутриклеточной роли макроэргического соединения, может принимать участие в межклеточной передаче сигналов, где выступает в качестве трансмиттера или котрас-нмиттера [2]. В 70-е годы XX в. профессор Джеффри Бернсток объединил все имеющиеся на тот момент данные о медиаторных свойствах АТФ и аденозина, опубликовав их, в ставшем сегодня классическим, обзоре «Пуринергические нервы» [3]. С этого момента продолжается интенсивное изучение биологической активности и физиологической роли АТФ. Было установлено, что АТФ и адено-зин могут выделяться различными клетками, в первую очередь нервными [4, 5]. Было зарегистрировано также высвобождение АТФ и аденозина из клеток сердечной мышцы [6, 7].

Участие АТФ в регуляции физиологических функций многих органов и систем осуществляется через специфические Р2-рецепторы. Разнообразие пурино-

рецепторов превышает все подтипы рецепторов для классических медиаторов. Согласно современной классификации имеются два больших семейства Р2-ре-цепторов: Р2Х- и Р2У-рецепторы. В каждом из семейств выделяют несколько подтипов, отличающихся особенностями молекулярной структуры и чувствительностью к действию различных производных пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. К настоящему времени описаны 7 подтипов Р2Х-рецепторов и 8 подтипов Р2У-рецепторов [8]. Р2Х-рецепторы по механизму действия являются неселективными ионными каналами с почти равной проницаемостью для ионов К+ и значительной проницаемостью для Са2 и отвечающими за быстрые ответы АТФ. Р2У-рецепторы являются медленно функционирующими рецепторами и связаны с G-белками [9, 10].

АТФ является нестойким соединением, и наблюдаемые явления могут быть связаны как с прямым эффектом АТФ на сердце, так и с действием адене-озина, который образуется при гидролизе АТФ и может действовать через собственные Р1-рецепторы. Действие аденозина реализуется через аденозиновые рецепторы. Выделяют 4 подтипа аденозиновых рецепторов [9]. Все подтипы аденозиновых рецепторов относятся к рецепторам, ассоциированным с G-про-теинами. А1- и А3-рецепторы связаны с Gi-протеинами, активация которых ведет к ингибированию аденилатциклазы и торможению продукции цАМФ. Эффекты, опосредованные А2А- и А2В-рецепторами, напротив, реализуются через Gs-белки, результатом активации которых являются стимуляция аденилатциклазы и активация продукции цАМФ.

В настоящее время известно, что АТФ находится в везикулах вместе с АХ или НА и участвует в передаче нервных импульсов, выделяясь из нервных окончаний вместе с основными медиаторами. Исследования подтверждают наличие совместной секреции норадреналина, ацетилхолина и АТФ из симпатических и парасимпатических нервов, что подтверждает способность АТФ модулировать нервную передачу в сердце [11, 12]. Таким образом, действие АТФ может быть реализовано как прямым действием на кардиомиоциты, так и изменением активности регуляторных каналов сердца.

Методами имуногистохимии с обратной транскрипцией показано наличие на поверхности кардиомиоцитов Р1-, Р2-рецепторов [2]. Имеются убедительные данные о хронотропных, инотропных и аритмогенных эффектах АТФ и адено-зина на сердце. АТФ в небольших количествах вызывает кратковременную тахикардию, а в высоких замедляет работу сердца, вызывая атриовентрикуляр-ную блокаду [10]. Существует ряд экспериментальных доказательств прямого действия АТФ на сердце независимо от его превращения в аденозин. Результаты исследований, в которых изучалось влияние АТФ на функции сердца, носят противоречивый характер.

Целью настоящего исследования является изучение роли АТФ разной концентрации на параметры электрической активности и сократимость полосок миокарда правого предсердия крыс с сохраненным синусным узлом.

1. Методика исследования

1.1. Животные. Эксперименты проводились на белых лабораторных крысах 7- и 100-суточного возраста, которые соответствуют новорожденному периоду

и половозрелому периоду развития человека [13]. Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами, одобренными Локальным этическим комитетом Казанского федерального университета (приказ № 0.1.1.6706/101/14 от 12 июня 2014 г.). Все животные содержались в поликарбонатных коробках в лабораторных условиях при температуре 23 ± 1 °С и влажности воздуха 4060%. В помещении поддерживался 12-часовой цикл дня и ночи.

Исследование было проведено на 44 крысах.

1.2. Эксперименты по сократимости миокарда. Сократительную активность миокарда в эксперименте in vitro изучали на полосках правого предсердий со спонтанной активностью. Все эксперименты проводились по требованиям Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Эвтаназию животных осуществляли под уретановым наркозом (3 г/кг, внутрибрюшинно). Наркотизированную крысу фиксировали на специальном, освещенном операционном столе, затем вскрывали грудную клетку. Сердце быстро извлекали и помещали в ванночку с рабочим раствором. Вырезались полоски миокарда из правого предсердия в соответствии с анатомическим строением сердца. Препарат помещали вертикально в резервуар объёмом 10 мл, оксигенированный карбогеном (97% O2 и 3% CO2) рабочий раствор при температуре 37 °С, в состав которого входили (на 1 л): NaCl - 8 г; KCl - 0.3 г; CaCl2 - 0,38 г; MgSO4 - 0.125 г; NaHPO4 - 0.04 г; глюкоза -2 г; Trizma base - 0.25 г (Sigma). Рабочий раствор готовился в день проведения эксперимента. Для поддержания рН в пределах 7.3-7.4 в раствор добавляли основной и кислотный буферы Trizma (Sigma). Верхний конец препарата прикреплялся к нержавеющему стержню, соединенному с измерителем напряжения, нижний конец - к резиновому блоку. После погружения препарата в резервуар следовал период проработки в течение 40-60 мин, в ходе которого мышечным волокнам постепенно придавалось оптимальное натяжение. Оптимальным натяжением считалась такая точка растяжения препарата, после преодоления которой начиналось снижение силы сокращения препарата. Определение реакции сократительной функции миокарда на АТФ в трех последовательно возрастающих концентрациях. Запись кривой регистрировали на персональном компьютере при помощи программного обеспечения Chart 5.1. По окончанию проработки в течение 5 мин регистрировались исходные параметры сокращения, затем в течение 20 мин с добавлением в рабочий раствор агониста одной из концентраций. По окончании стимуляции препараты трехкратно отмывали рабочим раствором в течение 20 мин, затем регистрировали исходные показатели для каждой последующей дозы. Рассчитывали реакцию силы и длительности сокращения в ответ на действие фармакологических веществ в процентах от контрольной записи без добавления фармакологического препарата. Исходные сокращения полосок миокарда принимали за 100%, относительно них рассчитывали влияние используемых фармакологических агентов. Силу сокращения (F) выражали в граммах. Обработка полученных результатов проводилась с помощью программы Chart 5.1. Достоверность различий рассчитывали по парному критерию Стьюдента (р < 0.05).

1.3. Регистрация электрической активности. Электрическую активность кардиомицитов в эксперименте изучали с использованием микроэлектродного отведения на препарате правого предсердия крыс с сохраненным синусно-пред-сердным узлом и спонтанной активностью. Все эксперименты проводились с соблюдением всех этических норм. Определение электрической активности кардиомиоцитов на аппликацию АТФ проводили в трех последовательно возрастающих концентрациях (10-8, 10-7, 10-6 М).

Наркотизированным уретаном животным вскрывали грудную клетку, сердце быстро извлекали и помещали в чашку Петри с оксигенированным рабочим раствором. Далее препарировали сердце и изготавливали препарат ушка правого предсердия с синусно-предсердным узлом, поперечным гребешком и фрагментами верхней и нижней полых вен. Препарат помещали в камеру, куда подавался термостатируемый раствор (37 ± 1 °С) следующего состава: (ммоль/л: NaCl -129, КС1 - 4, СаС12 - 1.2, MgSO4 - 0.5, NaH2PO4 - 20.9, NHCO3 - 20, глюкоза -5), с кислородом (95%-ный О2 и 5%-ный СО2). Для поддержания рН в пределах 7.3-7.4 в раствор добавляли основной и кислотный буферы Trizma (Sigma).

Регистрацию мембранного потенциала (МП) и потенциала действия (ПД) проводили с использованием стеклянных микроэлектродов (диаметр кончика менее 1 мкм, сопротивление 30-80 МОм). Анализ полученных записей электрической активности миокарда осуществляли с помощью оригинальной программы Elph 3.0. Обработка включала в себя определение величины МП, амплитуды ПД, длительности фазы деполяризации ПД, длительности фазы реполя-ризации ПД на уровне 20%, 50% и 90% спада ПД (ДПД 20, ДПД 50 и ДПД 90). Регистрация параметров ПД проводилась на 7-й и 15-й минуте после аппликации нейропептида Y. В эксперименте использовали химические реактивы фирмы Sigma.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы PowerGraph Profeessiional 3.3 (Disoft). Достоверность рассчитывали по парному /-критерию Стьюдента.

2. Результаты

Эффект АТФ на параметры сократимости, мембранного потенциала и потенциала действия изучали в концентрации 10 - 10 М. Исходная спонтанная активность сокращений правого предсердия взрослых крыс составляла 332 ± 12 в минуту (n = 6). Добавление АТФ вызывает дозозависимое изменение электрической активности, инотропное и хронотропное действие на препарат правого предсердия.

АТФ в концентрации 10-8 М не вызывает достоверных изменений амплитудно-временных параметрах сократимости и электрической активности миокарда.

АТФ в концентрации 10-' М вызывает двухфазное изменение частоты и силы сокращения полосок миокарда. На 2-й минуте регистрации АТФ вызывает краткосрочное увеличение частоты сокращений на 8% (р < 0.05), при этом амплитуда сокращений достоверно не изменяется. К 20-й минуте АТФ уменьшает частоту спонтанной активности миокарда правого предсердия на 12% (р < 0.05) и амплитуду сокращения на 31% (р < 0.05) (рис. 1).

а)

Рис. 1. Влияние АТФ (10 М) на силу сокращения (а) и частоту спонтанного сокращения миокарда правого предсердия (б - 2-я минута, в - 20-я минута эксперимента)

а)

б)

120 100 80 60 40 20 0

1111

АТФ КОНТРОЛЬ

в)

КОНТРОЛЬ АТФ

дпд 20

дпд 50

дпд 90

Рис. 2. Влияние АТФ (10 М) на параметры ПД (а) и частоту спонтанного сокращения миокарда правого предсердия (б - 4-я минута, в - 15-я минута эксперимента)

Увеличение концентрации агониста до 10-6 М приводит к дальнейшему усилению ингибирующего эффекта АТФ с одноминутной аппликации вещества. Частота спонтанного сокращения уряжается на 32% (р < 0.05), амплитуда сокращения уменьшается на 42% (р < 0.05).

В препарате со спонтанной активностью АТФ(10-7 М) не изменяет мембранный потенциал, амплитуду потенциала действия и длительность деполяризации. На 4-5-й минуте эксперимента наблюдается краткосрочное увеличение длительности потенциала действия на уровне 20%, 50% и 90% реполяризации на 12% (р < 0.05), 14% (р < 0.05) и 13% (р < 0.05) (п = 8) соответственно. К 15-й минуте эксперимента происходит восстановление длительности потенциала действия к исходным значениям.

Частота спонтанной активности препарата увеличивается к 4-5-й минуте эксперимента с 303 ± 19 до 328 ± 14 (р < 0.05), что соответствует 9%. На 15-й

минуте частота возникновения потенциала действия составляет 301 ± 16. Таким образом, все изменения потенциала действия являются краткосрочными и восстановление всех параметров к исходным значениям наблюдается к 15-й минуте эксперимента (рис. 2).

Добавление АТФ в концентрации 10-6 М не вызывает изменения мембранного потенциала, амплитуды потенциала действия и длительность деполяризации. Увеличение длительности потенциала действия на уровне 20%, 50% и 90% реполяризации наблюдается на первых минутах эксперимента, достигая к 15-й минуте 21%р < 0.05), 25% (р < 0.05), 27% (р < 0.05) соответственно.

Увеличение длительности потенциала действия сопровождалось замедлением спонтанного ритма. Частота спонтанной активности к 15-й минуте уменьшается с 308 ± 13 до 273 ± 12 (р < 0.05), что соответствует 12%.

3. Обсуждение

Методами имуногистохимии показано присутствие Р2Х-рецепторов на клетках синусно-предсердного узла и рабочих кардиомицитах сердцах крыс [14]. По нашим данным, АТФ изменяет спонтанную активность миокарда правого предсердия. АТФ в концентрации 10-7 М вызывает краткосрочное увеличение частоты спонтанных сокращений правого предсердия, что указывает на прямой эффект АТФ. Известно, что стимуляция Р2Х-рецепторов приводит к открытию неселективных ионных каналов с почти равной проницаемостью для ионов К+, а затем потенциал зависимых Са -каналов L-типа. Повышение уровня внутриклеточного Са приводит к увеличению сократительного ответа.

Увеличение частоты спонтанной активности препарата сопровождалось уменьшением длительности потенциала действия. По данным литературы известно, что связывание АТФ с Р2-рецепторами вызывает усиление выходящего К-тока, через ацетилхолин-зависимые и АТФ-зависимые калиевые каналы, что приводит к укорочению длительности потенциала действия, которое является кратковременным [15].

Долгое время влияние АТФ на сердце связывали с его распадом до адено-зина, который оказывает отрицательное хронотропное и инотропное действие через Р1-рецепторы. Этот механизм зависит от того, с каким рецептором взаимодействует молекула АТФ и от степени длительности взаимодействия. Существует целый ряд экспериментальных доказательств прямого действия АТФ на сократимость миокарда независимо от его превращения в аденозин [16].

Известно, что АТФ под действием эктонуклеотидаз быстро распадается до АДФ, АМФ и аденозина. АМФ и аденозин активируют Р1-рецепторы, что приводит к уменьшению частоты и силы сокращения миокарда. АТФ в небольших количествах вызывает кратковременную тахикардию, а в высоких замедляет работу сердца [10]. Р1-рецепторы, локализованные в клетках синусно-предсердного узла, связываясь с аденозином, вызывают отрицательное хронотропное действие, подавляя автоматию пейсмейкерных клеток сердца [17].

В нашем исследовании АТФ в концентрации 10 М вызывает уменьшение частоту и силу спонтанного сокращения правого предсердия, что связанно с распадом АТФ до аденозина, который активирует собственные Р1-рецепторы. Затя-

гивание длительности фазы реполяризации сопровождалось уменьшением частоты спонтанной активности правого предсердия через активацию Р1 -рецепторов.

Литература

1. Champe P.C., Harvey R.A., Ferrier D.R. Lippincott's Illustrated Reviews: Biochemistry. -Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2004. - 608 p.

2. Ralevic V., Burnstock G. Roles of P2-purinoceptors in the cardiovascular system // Circulation. - 1991. - V. 84, No 1. - P. 1-14. - doi: 10.1161/01.CIR.84.1.1.

3. Burnstock G. Purinergic nerves // Pharmacol. Rev. - 1972. - V. 24, No 3. - P. 509-581.

4. White T.D. Characteristics of neuronal release of ATP // Prog. Neuro-Psychopharmacol. Biol. Psychiatry, 1984. - V. 8, No 4-6. - P. 487-493. - doi: 10.1016/0278-5846(84)90005-8.

5. Zimmermann H. Signaling via ATP in the nervous system // Trends Neurosci. - 1994. -V. 17, No 10. - P. 420-426. - doi: 10.1016/0166-2236(94)90016-7.

6. Forrester T. Release of ATP from heart. Presentation of a release model using human erythrocyte // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1990. - V. 603. - P. 335-352. - doi: 10.1111/j. 1749-6632.1990.tb37684.x.

7. Katsuragi T., Tokunaga T., Ohba M., Sato C., Furucawa T. Implication of ATP released from atrial, but not papillary, muscle segments of guinea-pig by isoproterenol and for-skolin // Life Sci. - 1993. - V. 53, No 11. - P. 961-967. - doi: 10.1016/0024-3205(93)90449-D.

8. Abbracchio M.P., Burnstock G., Boeynaems J.M., Barnard E.A., Boyer J.L., Kennedy C., Knight G.E., Fumagalli M., Gachet C., Jacobson K.A., Weisman G.A. International Union of Pharmacology LVIII: Update on the P2Y G protein-coupled nucleotide receptors: From molecular mechanisms and pathophysiology to therapy // Trends Pharmacol. Sci. - 2003. -V. 58, No 3. - P. 281-341.

9. Ralevic V. Receptors for purines and pyrimidines // Pharmacol. Rev. -1998. - V. 50, No 3. - P. 413-492.

10. Vassort G. Adenosine 5'-triphosphate: A P2-purinergic agonist in the myocardium // Physiol. Rev. - 2001. - V. 81, No 2. - P. 767-806. - doi: 10.1152/physrev.2001.81.2.767.

11. Ennion S., Hagan S., Evans R.J. The role of positively charged amino acids in ATP recognition by human P2X1 receptors // J. Biol. Chem. - 2000. - V. 275, No 38. -P. 29361-29367. - doi: 10.1074/jbc.M005481200.

12. Boehm S., Kubista H. Fine tuning of sympathetic transmitter release via ionotropic and metabotropic presynaptic receptors // Pharmacol. Rev. - 2002. - V. 54, No 1. - P. 43-99.

13. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария ЕА., Западнюк Б.В. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. - Киев: Вища шк., 1983. -383 с.

14. Hansen M.A, Bennett M.R, Barden J.A. Distribution of purinergic P2X receptors in the rat heart // J. Auton. Nerv. Syst. - 1999. - V. 78, No 1. - P. 1-9. - doi: 10.1016/S0165-1838(99)00046-6.

15. Hara Y., Nakaya H. Dual effects of extracellular ATP on the muscarinic acetylcholine receptor-operated K+ current in guinea-pig atrial cells // Eur. J. Pharmacol. - 1997. -V. 324, No 2-3. - P. 295-303. - doi: 10.1016/S0014-2999(97)00088-5.

16. Anikina T.A., Bilalova G.A., Zverev A.A., Sitdikov F.G. Effect of ATP and its analogs on contractility of rat myocardium during ontogeny // Bull. Exp. Biol. Med. - 2007. -V. 144, No 1. - P. 4-7. - doi: 10.1007/s10517-007-0239-z.

17. Gessi S., Merighi S., Varani K., Borea P.A. Adenosine receptors in health and disease // Adv. Pharmacol. - 2011. - V. 61. - P. 41-75. - doi: 10.1016/B978-0-12-385526-8.00002-3.

Поступила в редакцию 10.07.18

Зверев Алексей Анатольевич, кандидат биологических наук, доцент кафедры охраны здоровья человека