CC BY
40
К^Ш /ребёнка
КёУчна пед1атр1я / Clinical Pediatrics
УДК 616.5-002.2
ВОЛОСОВЕЦЬ О.П., КРИВОПУСТОВ С.П., ПАВЛИК О.В., еМЕЦЬ О.В., СТРОЙ Д.О., ДОСЕНКО в.е. Нацюнальний медичний унверситет¡мен/ О.О. Богомольца, м. Ки!в
ACOUiAUiß BAPiAUM TEHiB POMP, FLG, MTORTA ATG5 ¡3 РИЗИКОМ PO3BMTKY BPOHXiAAbHOI ACTMM B ДЛЕЙ
Резюме. Метою даного до^дження було визначити зв'язок однонуклеотидних nолiморфiзмiв у гет быка дозрiвання протеасоми (POMP), фыагрину (FLG), быка-мшеш рапамщину (MTOR) та автофаги (ATG5) i3розвитком бронхiальноiастми в дтей.
Методи: ^тчт, генетичн — визначення генотипу хворих i здорових дтей за допомогою полiмеразно'i ланцюгово1'реакци в реальному чаа; статистичт.
Результати. Установлено, що розподл генотитв у дослгджених групах вiрогiдно вiдрiзняeться при аналiзi полiморфiзму POMP: GG-варiант виявлений у 9 здорових дтей та вiдсутнiй у груп хворих, 32 пащенти i 37здорових дтей мали AG-варiант, 62 i 52 вiдповiдно — мали алельний варiант AA, до того ж мшорний варiант взагалi не зустрiчався у хворих на бронхiальну астму (р < 0,05за %2-криmерiем). Ва-рiанти з мторним генотипом гена FLG виявилися у 2,5 раза частше у хворих, тж у контрольтй грут: у 5 пацiентiв i у 2 здорових дтей був наявний алельний варiант AA, 27i 36 — вiдповiдно мали гетерози-готний варiант GA, 67 i 61 — вiдповiдно мали варiант GG. Варiанти з мшорним генотипом у ген MTOR виявилися у 2,4раза частше в контрольтй грут, тж серед хворих: у 50 пацiентiв i 43 здорових дтей наявний мажорний алельний варiант ТТ, 36пацiенmiв i 32здоровi дитини мали варiант ТС, 5i 12 — вгд-повiдно мали варiанm СС. Отримано статистично вiрогiднурiзницю врозподiлi генотитв полiморфiзму гена ATG5: у 51 хворо'1' дитини та 43здорових дтей був гетерозиготний варiанm СТ, у 29 та 21 вiдпо-вгдно — мторний варiанm ТТ, у 18 та 33 вiдповiдно — мажорний варiанm СС (р < 0,05за %2-криmерiем). Мнорний генотип полiморфiзму гена ATG5 асоцтеться з тдвищеним ризиком ранньо'1' матфестаци бронхiальноi астми (до 3 ротв життя) (р < 0,05 за %2-криmерiем). За результатами MDR-аналiзу вияв-лено, що полiморфiзм гена ATG5 виявився найбльш сильним предикторомрозвитку бронхiальноi астми, оскшьки зменшуе рiвень ентропп на 7,88 %. При цьому полiморфiзм гена POMP зменшуе рiвень ентропи на 5,21 %, полiморфiзм гена MTOR — на 1,18 %, полiморфiзм гена FLG — на 1,04 %. Висновки. До^джет полiморфiзми можуть бути використан як прогностичн маркерирозвитку брон-хiальноi астми в дтей.
Ключовi слова: однонуклеотидний полiморфiзм, фиагрин, протеасомний проmеолiз, авmофагiя, MTOR, бронхiальна астма, педiаmрiя.
Вступ
Сьогодш найбшьш поширеним методом вивчен-ня генетичних основ бронхiальноI астми е пошук асощацш захворювання з полiморфiзмом кандидат-них гешв. Наявнють полiморфiзму може призводи-ти до змши рiвня експресп даних гешв у'або змши структури 1х бшкових продукпв. Для полiморфiзмiв у кодуючих репонах можна передбачити наслщки для структури та функцп протешв, хоча таю про-гнози повинш бути емшрично перевiренi. Однак бшьшють полiморфiзмiв у геномi людини знахо-дяться в некодуючш ДНК. Варiанти, розташоваш в промоутер^ можуть змшити експресш гешв шляхом змши зв'язуючих сайпв транскрипцшних фак-торiв або шляхом бшьш тонких механiзмiв.
Установлено, що в naToreHe3i атошчних захво-рювань характерним е спрямування антигенпрезен-туючими клггинами (АПК) iмунолоriчноI вщповщ в 6iK Т-хелперiв 2-го типу, що продукують цитою-ни, яю регулюють алергенспецифiчний синтез IgE (1Л-4), поповнюють пул еозинофшв (1Л-5), тучних
Адреса для листування з авторами: Досенко Вштор бвгенович E-mail: dosenko@biph.kiev.ua
© Волосовець О.П., Кривопустов С.П., Павлик О.В.,
бмець О.В., Строй Д.О., Досенко В.6., 2016 © «Здоров'я дитини», 2016 © Заславський О.Ю., 2016
клiтин (1Л-9) та зумовлюють гiперреактивнiсть ди-хальних шляхiв при бронхiальнiй acrni (1Л-13) [1, 2]. Отже, можна передбачити, що саме особливостi презентацп антигенiв АПК лежать в ochobí розвитку атопп.
У даному контексп особливу увагу дослiдникiв привертають автофапя (забезпечуеться лiзосомним апаратом) та протеасомний протеолiз, що забезпе-чують деградацго проте'Мв, здiйснюють контроль якостi протешв, якi синтезуються в клiтинi, та зага-лом забезпечують функцiонування та життездатшсть клiтин. Продукти деградацп протешв, що утворю-ються при робот лiзосомного та протеасомного про-теолiзу, е не просто «вщпрацьованим» матерiалом, а ключовими факторами стимуляцй iмунiтету, бо пре-зентуються АПК уам iншим iмунним клiтинам [3].
1мунопротеасоми, формування яких вщбуваеть-ся пщ впливом IFN-y, виконують функцй презентацп антигешв у МНС I типу CD8+-Т-клiтинам. Також останнiм часом у вивченш патогенезу алер-пчно^ вiдповiдi увага придiляеться продуктам протеасомного протеолiзу, що призводять до активаци факторiв транскрипцй та внутршньоклггинних сигнальних шляхiв. Наприклад, протеасоми здш-снюють деградацiю iнгiбiторних бiлкiв IkB, що при-зводить до активаци Nuclear factor-кВ — фактора транскрипцп, який вiдiграе ключову роль в експре-сй прозапальних генiв, що призводить до синтезу хемоюнш, цитоюшв, молекул адгезiй, ензимiв, у тому чи^ 1Л-4, 1Л-5, 1Л-13. У неактивному сташ Nuclear factor-кВ е приеднаним до IkB шпбуючо-го протешу, що маскуе послiдовностi нуклеотвддв i утримуе комплекс у цитоплазма
Формування каталiтично активное протеасоми вщбуваеться шляхом об'еднання двох симетричних прехолопротеасом, що стае можливим при наяв-носп протеину дозрiвання протеасом РОМР, який одразу стае першим субстратом для деградацп ново-створено^ органели.
З урахуванням участi протеасом у деградацп ш-гiбiторiв факторiв транскрипцп ключових для атопй прозапальних генiв застосування блокаторiв протеасом розглядаеться як можливий напрямок терапп. Однак, з шшого боку, данi препарати впливають на посттрансляцшну обробку структурних бглюв шкь ри, особливо фшагрину, що спричиняе зниження захисного бар'ера [11].
При дослщженш ролi POMP у нормальнш еш-дермальнiй диференшацп при iмуногiстохiмiч-ному аналiзi бiоптатiв шюри пацiентiв iз KLICK-синдромом було виявлено уражену експресiю POMP, субодиниць протеасоми та маркера етдер-мально^ диференшацп фiлагрину [12].
Залишаеться незрозумшим, як дефект у FLG може вплинути на розвиток таких захворювань, як алерпчний ринiт, астма та харчова алерпя. Адже фь лаггрин знайдений лише в епiдермiсi, слизовiй рота, ештелп присiнку порожнини носа, i його немае в слизовш оболонцi тих оргашв, де проявляються цi захворювання [13, 14].
Разом з антигенпрезенташею та позаклгганни-ми цитокiновими сигналами в Гмуннш стимуляцп лiмфоцитiв важливе значення мають внутршньо-клiтиннi мехашзми автофагiчного каскаду. Так, дослiдниками [8] була вивчена здатшсть сигнального шляху MTOR (mammalian target of rapamycin) модулювати iмyннy вiдповiдь та кл™нну проль ферацiю. MTOR також вщграе значну роль у ре-гуляцп сигналiв цитокiнiв, диференцiюваннi та розвитку ефекторних Th-клггин, дозрiваннi та де-грануляцп тучних клiтин, регуляцп процесу презентацп антигену шляхом автофагп, що згодом призведе до формування та2-клггинного фенотипу. До того ж ведомо, що MTOR також бере участь у процес росту, дозрiвання тучних клiтин i секре-цп цитокiнiв.
Автофагiя вщграе ключову роль у презентацп цитозольних, ядерних антигешв, а також антигешв внутршньоклггинних патогешв у МНС II комплекс АПК СD4+-Т-клiтинам. Тобто актива-ц1я Т-хелперiв залежить в1д р1вня активностi автофагп. Щкаво, що Т-хелпери 2-го типу мають вищ1 показники активностi автофагп, шж Т-хелпери 1-го типу [4]. Окр!м того, як свiдчать данi, авто-фагiя бере участь у розвитку та диференшацп В-л1мфоцит1в, ll активац!я асоцiюеться з посилен-ням експресп В-кл1тинного рецептора [5]. Вияв-лена також роль автофагп в процесах дегрануляцп тучних кл1тин 1з вивгльненням типових для атопп медiаторiв [6].
Формування автофагосоми е складним процесом 1з залученням щонайменш 31 протешу, пов'язаного з автофапею (Atg). Процес елонгаци мембрани дано! структури залежить в1д фyнкцiонyвання комплексу Atg12 — Atg5 — Atg16, при цьому вирiшальне значення мае наявшсть протешу Atg5 [7].
Виходячи з наведених даних, ми припустили, що пол!морф!зми в генах POMP, FLG, MTOR та ATG5 можуть бути пов'язаш з розвитком алергiчного фенотипу в дитячому вщ1. Для перев!рки ще! гiпотези ми дослщжували вщмшносп в частотi чотирьох по-л!морф!зм!в у дiтей без алерпчно! патологи (контрольна група) та дггей 1з бронхiальною астмою та шшими супутн1ми алергiчними захворюваннями (атопiчний дерматит або алерпчний ришт), а також взаемозв'язок м1ж цими чотирма пол!морф!змами за допомогою методу багатофакторного зменшення просторовост (MDR).
Матер1али та методи
Пол1морф1зм rs11121704 у генi MTOR досль джувався в 91 дитини, пол!морф!зм rs510432 у генi ATG5 — у 98 дггей, пол!морф!зм rs11204981 у генi FLG — у 99 дггей та пол1морф1зм rs4769628 гена POMP — у 95 дггей вжом в1д 5 до 18 роюв 1з брон-х!альною астмою та шшими супутн1ми алергчними захворюваннями (атопiчний дерматит або алер-г1чний рин1т), як1 перебували на стацюнарному лiкyваннi в алергологiчномy вщдгленш Кишсько! мгсько! дитячо! ктшчно! лжарш № 2. Групу конт-
ролю становили 99 дiтей вгком вщ 5 до 18 рокгв без алерпчно! патологи на момент огляду чи в aHaMHe3i для rs11204981 у генi FLG, 98 дiтей - для rs4769628 у ген РОМР, 97 - для rs510432 у генi ATG5, 87 - для rs11121704 у генi MTOR. Дии з групи контролю мали негативнг результати шкiрних прiк-тестiв та/або за-довiльнi результати спiрографГi, а також негативш дат щодо наявностг алерггчних захворювань у бать-кгв та найближчих родичгв.
Установлення дгагнозу атопгчного дерматиту вгдбувалося на основг даних, внесених батьками в адаптовану затверджену анкету (ISAAC), що включали в себе скарги на висип, сухгсть шкгри, лущення, свербгж упродовж дитинства. Наявнгсть бронхгально! астми встановлювалася на основг даних зг слгв батькгв щодо персистуючого свистя-чого дихання (> 2 епгзодгв нападгв, не пов'язаних з гнфекцгею верхнгх дихальних шляхгв), даних спгрографг! (знижений ОФВ1 i спгввгдношення ОФВ/ФЖбЛ, позитивний тест з Р2-агонгстами), з урахуванням пгдвищення ргвня сироваткового за-гального IgE, позитивного шкгрного пргк-тесту з алергенами. Шкгрнг пргк-тести були проведет та гнтерпретованг зггдно з протоколом Global Allergy and Asthma European Network гз використанням загально! панелг гнгалящйних алергенгв на основг опублгкованих методичних рекомендацгй (документ EAACI та протокол ISAAC II фаза). Батьки пгдписали гнформовану згоду до включення до до-слгдження.
BMÖip SNP
Полгморфгзм rs11121704 у генг MTOR, rs510432 у генг ATG5, rs11204981 у генг FLG та rs4769628 гена POMP були обранг для генотипування, оскгльки, за лгтературними даними, зустргчаються у европей-ськгй популяцг! та ггпотетично можуть впливати на розвиток алерггчного фенотипу.
Видшення ДНК
Забгр букального епгтелгю проводився з використанням букальних щгток гз наступним заморо-жуванням зразкгв та !х збергганням при температу-рг —20 °С. ДНК для генотипування екстрагували гз зразкгв гз використанням наборгв DiatomTMPrep 200 («Лаборатория Изоген», РФ) вгдповгдно до протоколу виробника. Концентрацгю ДНК визначали за допомогою NanoDrop спектрофотометра ND1000 (NanoDrop Technologies Inc., США).
По^меразна ланцюгова pеaкцiя
Реакцг! амплгфгкащ! проводили з використанням Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems, США), у кгнцевгй реакцг! C_910351_10 — для гена ATG5, assay C_1792560_10 — для гена FLG, C_1445481_10 — для гена POMP, assay C_31720978_30 — для гена MTOR г матричну ДНК. Амплгфгкацгя фрагментгв генгв складалася зг ста-дг! денатурацг! при 95 °С протягом 20 с, а потгм 40 циклгв амплгфгкаци при 95 °С протягом 3 с г 60 °С
протягом 30 с. Аналгз даних проводився з 7500 Fast Real-Time PCR Software.
Статистичний аналiз
Отриманг данг обробляли статистично з вико-ристанням програми SPSS (версг! 22.0) та програм-ного середовища R (версг! 3.0). Для перевгрки роз-подглу частот генотипгв зггдно гз законом розподглу Хардг — Вайнберга використовували SNP Analyzer (веб-програмне забезпечення).
Вгдмгннгсть у частотг генотипу мгж групою па-цгентгв гз бронхгальною астмою г контрольною групою за допомогою %2-тесту Пгрсона, визна-чення вгдношення шансгв (ВШ) та регресгйного аналгзу. Вгдмгннгсть у розподглг генотипгв вважа-лася статистично значущою при ргвнг p < 0,05. Для визначення та пгдтвердження взаемодг! мгж полг-морфгзмами, визначення типу цге! взаемодг! вико-ристовувався метод багатофакторного зменшення просторовостг (MDR) [18], а також графгчне зо-браження епгстазу за допомогою побудови дендро-грам взаемодг!.
Результати
72 дитини (73,4 %) мали загострення бронхгально! астми, що проявлялось експграторною за-дишкою, наявнгстю свистячих хрипгв г кашлем. У 40 хворих (55,5 %) дгагностовано легкий ступгнь загострення, 31 (43,1 %) — мав загострення середньо! тяжкостг, 1 (1,4 %) — мав тяжке загострення. 28 дг-тей (28,3 %) гз дгагнозом «бронхгальна астма в стадг! ремгсг!» проходили планове обстеження. Загалом у 60 пацгентгв (83,3 %) виявлено зниження показника ОФВ1 (< 80 %), 34 (47,2 %) — мали позитивний тест гз р2-агонгстом. Усг дгти мали випадки атопгчних за-хворювань в сгмейному анамнезг. 98 дгтей (100 %) мали атопгчний дерматит в анамнезг, гз них 35 хво-рих (35,7 %) упродовж останнього часу вгдмгчають прояви атопгчного дерматиту у виглядг висипу, су-хостг шкгри, лущення, свербежу, лгхешзацц. У 34 осгб (34,7 %) прояви атопгчного дерматиту вгдмгча-лися вгд народження до 1 року, у 16 (16,3 %) — до 3 рокгв, у 8 (8,2 %) — до 7 рокгв, у 7 (7,2 %) — до 10 рокгв, у 5 (5,1 %) прояви з'явилися пгсля року.
1нша супутня алергологгчна патологгя визнача-лась у 46 дгтей (46,9 %). У 23 осгб (23,5 %) мав мгсце алерггчний рингт: гз них 18 (18,4 %) мали алерггч-ний рингт гз персистуючим перебггом, 5 (5,1 %) — алерггчний рингт з гнтермгтуючим перебггом. Серед алерггчних захворювань в анамнезг вгдмгчалася го-стра алерггчна кропив'янка — у 4 дгтей (4,1 %), хар-чова алерггя — у 9 (9,2 %).
Генотипування показало такий розподгл алель-них варганив у генг POMP. Розподгл генотипгв rs4769628 у генг POMP вгдповгдав закону Хардг — Вайнберга. Мгнорний варгант (GG) виявлений у 9 здорових дгтей (9,2 %) та вгдсутнгй у груш хворих, 32 пацгенти (34,7 %) г 37 здорових дгтей (37,7 %) мали гетерозиготний варгант (AG) (р < 0,05; ВШ — 0,73, довгрчий гнтервал (Д1) — 0,41—1,36), 62 (65,3 %) г
52 (53,1 %) вщповщно — мали мажорний алельний BapiaHT (AA) (табл. 1). ВарГанти з генотипом GG i3 rs4769628 виявилися в 9 paзiв чaстiше в контpольнiй rpyni, н1ж серед хворих (р < 0,05).
Розподш генотипiв rs11204981 у гет FLG вщпо-вщав закону Хapдi — Вайнберга. Було виявлено, що в 5 пaцieнтiв (5,1 %) i у 2 здорових дгтей (2,0 %) був наявний мшорний алельний вapiaнт (AA) (р > 0,05 за %2-тестом, ВШ — 2,28; 95% Д1 0,42-12,2), 27 (27,3 %) i 36 (36,4 %) вщповщно — мали гетерозигот-ний вapiaнт (GA) (р > 0,05 за %2-тестом, ВШ — 1,69; 95% Д1 0,92-3,1), 67 (67,7 %) i 61 (61, %) вщповщ-но — мажорний вapiaнт (GG) (р > 0,05 за %2-тестом) (табл. 1). Bapiaнти з генотипом АА з rs11204981 FLG виявилися у 2,5 раза частше серед хворих, н1ж у контрольнш груш.
Розподш генотитв rs11121704 у геш MTOR вщ-повщае закону Хapдi — Вайнберга. Виявлено, що в 50 хворих (54,9 %) i 43 здорових дгтей (49,4 %) наявний мажорний алельний вapiaнт (ТТ) (р > 0,05 за %2-тестом), 36 хворих (39,6 %) i 32 здоров! дитини (36,8 %) мали гетерозиготний вapiaнт (ТС) (р > 0,05 за %2-тестом, ВШ — 0,97; 95% Д1 0,52-1,81), 5 (5,5 %) i 12 (13,8 %) вщповщно — мшорний вapiaнт (СС) (р > 0,05 за %2-тестом, ВШ — 0,36; 95% Д1 0,11-1,05) (табл. 1). Bapiaнти з генотипом СС rs11121704 у геш MTOR виявилися у 2,4 раза частше в контрольнш груш, н1ж серед хворих.
Розподш генотитв rs510432 у геш ATG5 також вщповщав закону Хapдi — Вайнберга. Виявлено, що в 51 хворо! дитини (52,0 %) та 43 здорових дгтей
(44,3 %) був гетерозиготний вapiaнт (СТ) (р < 0,05 за %2-тестом, ВШ — 2,53; 95% Д1 1,14-5,74), у 29 хворих (29,6 %) та в 21 дитини контрольно! групи (21,6 %) — мшорний вapiaнт (ТТ) (р < 0,05 за %2-тестом, ВШ — 1,00), у 18 пащенпв (18,4 %) та 33 здорових дгтей (34 %) — мажорний вapiaнт (СС) (р < 0,05 за %2-тестом, ВШ — 2,17; 95% Д1 1,09-4,46) (табл. 1). ТТ-генотип полГморфГзму rs510432 у геш ATG5 асоцгоеться з шдвищеним ризиком ранньо! машфестацИ бpонхiaльноï астми (до 3 роюв життя) (р < 0,05).
ПолГморфГзм rs4769628 у генi POMP, rs11204981 у геш FLG, rs11121704 у геш MTOR та rs510432 у геш ATG5 були пpоaнaлiзовaнi за допомогою методу логiстичноï регресИ (табл. 2). Як видно з табл. 2, два полГморфГзми були статистично значущими, а саме rs4769628 у геш POMP та rs510432 у геш ATG5. Отже, даш полГморфГзми можуть розгляда-тись як значим! предиктори бpонхiaльноï астми в дгтей. Було визначено величину ВШ: полГморфГзм rs4769628 у генi POMP мае протективний ефект (ВШ < 1), полГморфГзм rs510432 у генi ATG5 асоць юеться з пiдвищеним ризиком розвитку захворю-вання (ВШ > 1).
Для з'ясування характеру взаемодш м1ж цими чотирма полiмоpфiзмaми була застосована графа взаемодИ (дендрограма), що формуеться за результатами кластерного aнaлiзy i наведена на рис. 1.
Як видно на рис. 1, м1ж полiмоpфiзмaми FLG та MTOR не спостертаеться ефект взаемодИ та вони представляють незaлежнi головш ефекти. М1ж поль
Таблиця 1. Вдношення шанс1в для кодомшантно'!' моделi успадкування пол1морф1зму rs4769628 у ген POMP, rs11204981 у ген FLG, rs11121704 у ген MTOR та rs510432 у ген ATG5 у дтей з алерпчною патологею. Вдношення шансв i3 95% дов'рчим iнтервалом
Генотип Генотип ВШ та 95°% Д1 Р-значення
Здоровi XBopi
n % n %
rs4769628 у ген\ POMP
AA 52 53,1 62 65,3 1,00 < 0,05
AG 37 37,7 33 34,7 0,75 (0,41-1,36)
GG 9 9,2 0 0,0 0
rs11204981 у ген FLG
GG 61 61,6 67 67,7 1,00 > 0,05
GA 36 36,4 27 27,3 1,69 (0,92-3,1)
AA 2 2,0 5 5,1 2,28 (0,42-12,2)
rs11121704 у ген MTOR
ТТ 43 49,4 50 54,9 1,00 > 0,05
ТС 32 36,8 36 39,6 0,97 (0,52-1,81)
СС 12 13,8 5 5,5 0,36 (0,11-1,05)
rs510432 у ген ATG5
СС 33 34 18 18,4 1,00 < 0,05
СТ 43 44,3 51 52,0 2,17 (1,09-4,46)
ТТ 21 21,6 29 29,6 2,53 (1,14-5,74)
Примтки: тут i в табл. 2: Р-значення — статистична значущсть, ВШ — вдношення шан&в, Д1 — дов 'рчий iнтервал.
морфiзмами ATG5 та MTOR також не спостертаеть-ся ефект взаемодп, i вони представляють незалежнi головнi ефекти. Miж полiморфiзмами ATG5 та FLG спостерпаеться антагонiстична взаемодiя середньо! сили, а мiж полiморфiзмами FLG та POMP i MTOR та POMP — антагонютична взаемодiя значно! сили. Полiморфiзм rs510432 гена ATG5 виявився найбiльш сильним предиктором розвитку бронхiальноi астми, оскiльки зменшуе рiвень ентропй на 7,88 %. До того ж полiморфiзм rs510432 у геш POMP зменшуе рiвень ентропй на 5,21 %, полiморфiзм rs11121704 у геш MTOR — на 1,18 %, полiморфiзм rs11204981 у геш FLG — на 1,04 %.
Обговорення
Порушення лiзосомного (автофапчного) та про-теасомного протеолiзу може мати визначальне зна-чення в етюлогй та патогенезi алергiчних захворю-вань. Наслiдком таких порушень е змши в процесах диференшацп iмунних клiтин, функцiонуваннi та антигеннш презентацп, що, ймов1рно, призводить до поляризацп ¡мунно! в1дпов1д1 в бж Т-хелперiв 2-го типу, синтезу вщповщних iнтерлейкiнiв,
Рисунок 1. Дендрограма м'жгенних взаемодй. Орим кольором видлен незалежн головн1 ефекти, пунктирною лiнieю — антагонстична взаемод1я середньоí сили, чорний кол'\р — антагонстична взаемод1я значно/' сили
зокрема, через активацго Nuclear factor-кВ, системи МАРК, вившьненню мед!атор!в тощо.
Даш попереднк дослщжень свiдчать, що бло-кування протешу РОМР призводить до зниження каталггично! активностi протеасом [21]. Позитивн1 результати застосування блокаторiв протеасом при бронх!альнш астмi на тваринних моделях свщчать про наявнють протизапального ефекту внаслщок iнгiбування транскрипцiйних факторiв [22]. Було визначено взаемозв'язок пол!морф!зму rs4769628 у геш POMP 1з розвитком атопй в дiтей. М1норний варiант rs4769628 гена РОМР асоцiюеться з1 зниже-ним ризиком розвитку атопiчних хвороб серед дггей (р < 0,05) i в!ропдно мае протективний ефект внаслщок зниження протеолггично! активност протеасом. Можна зробити висновок, що структурш осо-6ливост1 протешу РОМР внаслщок пол!морф!зму гена можуть вплинути на розвиток атопiчних захво-рювань серед дiтей.
Подальшi дослщження е необхщними для з'ясування рол! РОМР у патогенез! атопп.
Дослщження кандидатних генiв показало зв'язок пол1морф1зм1в або мутацiй генiв, залучених у регу-ляц1ю структури та функцп епiдермального бар'еру з алергiчними захворюваннями, а саме FLG. Шюр-на сенсибiлiзацiя алергенами е одним ¡з найваж-лив1ших початкових етапiв у патогенезi атопiчного дерматиту. Також важлива ii роль для атопiчних за-хворювань, коли дефекти в генах шюрного бар'ера асоцiюються ¡з захворюваннями шших органiв, включаючи харчову алерпю, бронхiальну астму, алергiчний рин1т. У даному дослщженш ми показали, що варiанти з м1норним генотипом rs11204981 гена FLG виявилися у 2,5 раза часпше серед хворих, н1ж у контрольн1й груп1.
Безлiч дослiджень iдентифiкують MTOR i його наведеш нижче ефектори як потенцшш фармаколо-г1чн1 мiшенi для профшактики розвитку ефекторних Т-кл1тин i просування та забезпечення толерантность
Fredrikkson et al. описали, що гальмування MTOR сигналiзацii рапамiцином мало парадоксальш ефекти на прояви бронхiальноi астми, шдуковано! кль щами домашнього пилу [19]. Iнгiбування MTOR сигналiзацii рапамiцином до початку астми ефек-тивно пригнiчувало запалення в дихальних шляхах, келихоподiбних епiтелiальних клiтинах i запобиало гiперреактивностi дихальних шлях1в. Ми отримали результати, у яких варiанти з м1норним генотипом
Таблиця 2. Результати аналiзу пол1морф1зму rs4769628 у ген POMP, rs11204981 у ген FLG, rs11121704 у ген MTOR та rs510432 у ген ATG5 за допомогою методу лопстичноí регреси
B Р-значення ВШ Нижшй 95% Д1 Верхнш 95% Д1
Константа 0,04 0,88 1,04 0,58 1,89
rs4769628 у reHi POMP -0,69 р < 0,05 0,50 0,29 0,83
rs11204981 у reHi FLG -0,16 р > 0,05 0,85 0,50 1,44
rs11121704 у ген MTOR -0,23 р > 0,05 0,79 0,50 1,23
rs510432 у reHi ATG5 0,46 р < 0,05 1,59 1,11 2,32
Примтка: B — коеф1ц1ент регресп.
rs11121704 у ген MTOR виявилися у 2,4 раза часть ше в контрольнш груш, нгж серед хворих, що може свщчити про протекторну роль даного полГморфГз-му в розвитку алерпчних захворювань.
Результати проведених дослщжень свщчать про взаемозв'язок полГморфГзму rs510432 гена ATG5 ¿з розвитком бронхГально'1 астми в дгтей в американ-ськш популяцш Так, зпдно з дослщженнями Martin et al. мшорна алель G rs510432 пщвищуе актившсть промоутера гена на 23 % порГвняно з алельним варь антом А та асоцшована з пщвищеним ризиком розвитку астми (р < 0,05; ВШ — 1,47; 95% Д1 1,14-1,88) [20]. У дгтей ¡з загостренням бронхГально! астми екс-пресГя мРНК ATG5 в епгтелГальних клгтинах верхшх дихальних шляхГв значно зростае, що, ймовГрно, свщчить про вищГ показники активност автофагИ порГвняно з контрольною групою.
НашГ дослщження розподглу алельних варГанпв гена ATG5 rs510432 у дгтей з атотчними захворюван-нями в украшськш популяцИ подтвердили асощащю мшорного варГанта ТТ ¡з розвитком атопИ (р < 0,05). ОкрГм того, дослщжуючи особливосп клтчного перебцу, ми виявили, що ТТ-генотип полГморфГзму rs510432 у ген ATG5 асоцшеться з пщвищеним ризиком ранньо'1 машфестацИ бронхГально'1 астми (до 3 роюв життя) (р < 0,05).
У даному дослщженш нами було продемон-стровано взаемозв'язок полГморфГзмГв гешв, що кодують бГлки протеасомного та лГзосомного про-теолГзу, факторГв 1х регуляцИ та кшцевих продукпв протеолГзу з атошчними захворюваннями в дгтей. Ми з'ясували, що rs510432 у геш ATG5 асоцшеться з ризиком ранньо'1 машфестацИ бронхГально'1 астми в дгтей з атотею. Дослщження продемонструвало протективну роль мшорного генотипу полГморфГз-му гена MTOR, отже, цей полГморфГзм мае предик-тивне значення в розвитку бронхГально'1 астми, вра-жаючи експресго цього гена.
Висновок
Подан результати свщчать про можливють ви-користання даних полГморфГзмГв для прогнозуван-ня ризику розвитку бронхГально'1 астми в дгтей.
Конфлiкт ÏHTepecÏB. Автори заявляють про вщсут-шсть конфлжту штереав.
Список AiTepaTypè
1. Lin Ko-Wei, Li Jinghong, Finn P. Emerging pathways in asthma: Innate and adaptive interactions//Biochimica et Biophysica Acta. — 2011. — 1810. — 1052-1058.
2. Hansel T.T., Johnston S.L., Openshaw P.J. Microbes and mucosal immune responses in asthma//Lancet. — 2013. — 381. — 861-73.
3. Hussey S., Travassos L.H., Jones N.L. Autophagy as an emerging dimension to adaptive and innate immunity // Semin. Immunol. — 2009. — 21. — 233-241.
4. Li C. Autophagy is induced in CD4+ T cells and important for the growth factor-withdrawal cell death // J. Immunol. — 2006. — 177. — 5163-5168.
5. Macian F. Autophagy and the regulation of the immune response //Pharmacological Research. — 2012. — 66. — 475-483.
6. Nakano H., Ushio H. An unexpected role for autophagy in degranulation of mast cells //Autophagy. — 2011 Jun. — 7(6). — 657-9.
7. Mizushima N., Ohsumi Y., Yoshimori T. Autophagosome formation in mammalian cells // Cell. Struct. Funct. — 2002 Dec. — 27(6). — 421-9.
8. Delgoffe G.M., Pollizzi K.M., Waickman A.D., Heikamp E., Meyers D.J., Horton M.R., Bo Xiao, Worley P.F., Powell J.D. The mammalian Target of Rapamycin (MTOR) regulates T helper cell differentiation through the selective activation of MTORC1 and MTORC2signaling//Nature immunology. — 2011. — 12(4). — 295303.
9. Venuprasad K., Elly C, Gao M, Salek-Ardakani S., Hara-da Y., Luo J.L., Yang C., Croft M., Inoue K, Karin M., Liu Y.C. Convergence of Itch-induced ubiquitination with MEKK1-JNK signaling in Th2 tolerance and airway inflammation // J. Clin. Invest. — 2006Apr. — 116(4). — 1117-26.
10. Moutzouris J.P., Che W., Ramsay E.E., Manetsch M., Alk-houri H, Bjorkman A.M., Schuster F., Ge Q., Ammit A.J. Proteaso-mal inhibition upregulates the endogenous MAPKdeactivator MKP-1 in human airway smooth muscle: mechanism of action and effect on cytokine secretion // Biochim. Biophys. Acta. — 2010 Mar. — 1803(3). — 416-23.
11. Mudnakudu Nagaraju K.K., Babina M, Worm M. Opposing effects on immune function and skin barrier regulation by the pro-teasome inhibitor bortezomib in an allergen-induced eczema model// Exp. Dermatol. — 2013Nov. — 22(11). — 742-7.
12. Dahlqvist J., Törmä H, Badhai J., Dahl N. siRNA Silencing ofProteasome Maturation Protein (POMP) Activates the Unfolded Protein Response and Constitutes a Model for KLICK Genodermato-sis//PLoS ONE. — 2012. — 7(1). — e29471.
13. De Benedetto A., Qualia C.M., Baroody F.M. Filaggrin expression in oral, nasal, and esophagealmucos // J. Invest. Dermatol. — 2008. — 128. — 1594-7.
14. Weidinger S., O'Sullivan M., Illig T. Filaggrin mutations, atopic eczema, hay fever, and asthma inchildren // J. Allergy Clin. Immunol. — 2008. — 121. — 1203-9.
15. Tao Zheng, Jinho Yu, Min Hee Oh, Zhou Zhu The Atopic March: Progression from Atopic Dermatitis to Allergic Rhinitis and Asthma // Allergy Asthma Immunol. Res. — 2011 April. — 3(2). — 67-73.
16. Herrick C.A., Xu L., McKenzie A.N. IL-13 is necessary, not simply sufficient, for epicutaneously induced Th2 responses to soluble protein antigen // J. Immunol. — 2003. — 170. — 2488-95.
17. Akei H.S., Brandt E.B., Mishra A. Epicutaneous aeroallergen exposure induces systemic TH2 immunity that predisposes to allergic nasal responses // J. Allergy Clin. Immunol. — 2006. — 118. — 62-9.
18. Ritchie M.D., Hahn L.W., Roodi N., Bailey L.R., Dupont W.D., Parl F.F., Moore J.H. Multifactor-dimensionality reduction reveals high-order interactions among estrogen-metabolism genes in sporadic breast cancer//Am. J. Hum. Genet. — 2001 Jul. — 69(1). — 138-47.
19. Fredriksson K., Fielhaber J.A., Lam J.K., Yao X, Meyer K.S. Paradoxical Effects of Rapamycin on Experimental House Dust Mite-Induced Asthma // PLoS ONE. — 2012. — e33984.
20. Martin L.J., Gupta J., Jyothula S.S., Butsch Kovacic M., Biagini Myers J.M., Patterson T.L., Ericksen M.B., He H., Gibson A.M., Baye T.M., Amirisetty S., TsorasA.M., Sha Y, Eissa N.T., Hershey G.K. Functional variant in the autophagy-related 5genepro-motor is associated with childhood asthma // PLoS One. — 2012. — 7(4). — e33454.
21. Heink S., Ludwig D., Kloetzel P-M, Krüger E. IFN-y-induced immune adaptation of the proteasome system is an accelerated and transient response Proc. Natl Acad. Sci USA. — 2005, June 28. — 102(26). — 9241-9246.
22. Wegmann M, Lunding L., Orinska Z, Wong D.M., Manz R.A., Fehrenbach H. Long-term bortezomib treatment reduces allergen-specific IgE but fails to ameliorate chronic asthma in mice // Int. Arch. Allergy Immunol. — 2012. — 158(1). — 43-53.
OTpuMaHO 05.01.16 ■
Волосовец А.П., Кривопустов С.П., ПавликЕ.В., Емец О.В., Строй A.A., Досенко В.Е. Национальный медицинский университет имени A.A. Богомольца, г. Киев
АССОЦИАЦИЯ ВАРИАЦИЙ ГЕНОВ POMP, FLG, MTOR И ATG5 С РИСКОМ РАЗВИТИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У ДЕТЕЙ
Резюме. Целью данного исследования было определить связь однонуклеотидных полиморфизмов в гене белка созревания протеасомы (POMP), филаггрина (FLG), белка-мишени рапамицина (MTOR) и аутофагии (ATG5) с развитием бронхиальной астмы у детей.
Методы: клинические, генетические — определение генотипа больных и здоровых детей с помощью полимераз-ной цепной реакции в реальном времени; статистические.
Результаты. Установлено, что распределение генотипов в исследованных группах достоверно отличается при анализе полиморфизма POMP: GG-вариант обнаружен у 9 здоровых детей и отсутствует в группе больных, 32 пациента и 37 здоровых детей имели AG-вариант, 62 и 52 — соответственно имели аллельный вариант AA, при этом минорный вариант не встречался у больных бронхиальной астмой (р < 0,05 по х2-критерию). Варианты с минорным генотипом гена FLG отмечались в 2,5 раза чаще у больных, чем в контрольной группе: у 5 пациентов и у 2 здоровых детей наблюдался аллельный вариант AA, 27 и 36 соответственно — имели гетерозиготный вариант GA 67 и 61 соответственно — вариант GG. Варианты с минорным генотипом в гене MTOR отмечались в 2,4 раза чаще в контрольной группе, чем среди больных: 50 пациентов и 43 здоровых ребенка имели мажорный аллельный вариант ТТ, 36 и 32 соответственно — имели вариант ТС, 5 и 12 соответственно — вариант СС. Получена статистически достоверная разница в распределении генотипов полиморфизма гена ATG5: у 51 больного ребенка и 43 здоровых детей был гетерозиготный вариант (СТ), у 29 и 21 соответственно — минорный вариант ТТ, 18 и 33 соответственно — мажорный вариант СС (р < 0,05 по х2-критерию). Минорный генотип полиморфизма гена ATG5 ассоциируется с повышенным риском ранней манифестации бронхиальной астмы (до 3 лет жизни) (р < 0,05 по х2-критерию). По результатам MDR-анализа выявлено, что полиморфизм гена ATG5 оказался наиболее сильным предиктором развития бронхиальной астмы, поскольку уменьшает уровень энтропии на 7,88 %. При этом полиморфизм в гене POMP уменьшает уровень энтропии на 5,21 %, полиморфизм в гене MTOR — на 1,18 %, полиморфизм в гене FLG — на 1,04 %.
Выводы. Исследованные полиморфизмы могут быть использованы в качестве прогностических маркеров развития бронхиальной астмы у детей.
Ключевые слова: однонуклеотидный полиморфизм, филаггрин, аутофагия, MTOR, протеасомный протеолиз, бронхиальная астма, педиатрия.
Volosovets O.P., KryvopustovS.P., PavlykO.V., Yemets O.V., StroiD.O., Dosenko V.Ye.
National Medical University named after O.O. Bohomolets, Kyiv, Ukraine
ASSOCIATION OF GENE VARIATIONS POMP, FLG, MTOR
AND ATG5 GENE WITH THE RISK OF ASTHMA IN CHILDREN
Summary. The aim of this study was to determine the correlation between single-nucleotide polymorphisms in the proteasome maturation protein gene (POMP), filaggrin gene (FLG), mammalian target of rapamycin gene (MTOR) and autophagy gene (ATG5) and the development of asthma in children.
Methods: clinical, genetic — determining the genotype of patients and healthy children using real-time polymerase chain reaction; statistical ones.
Results. It was found that the distribution of genotypes in the studied groups was significantly different when analysing polymorphism in POMP gene: GG variant was detected in 9 healthy children and was absent in ill people, 32 patients and 37 healthy children had AG variant, 62 and 52 — allelic AA variant, while minor variant wasn't detected in patients with asthma at all (p < 0.05 by the x2 criterion). Variants with the minor genotype of the FLG were found to be 2.5 times more frequent among patients than in control group: 5 patients and 2 healthy children had allelic variant AA, 27 and 36 — heterozygous variant GA, 67 and 61 — GG. Variants with minor genotype in MTOR gene were 2.4 times more often in the control group than in patients: 50 patients and 43 healthy children had major allelic variant TT, 36 patients and 32 healthy children had TC variant, 5 and 12 — CC variant. There was found a statistically significant difference in the distribution of genotypes of polymorphism in ATG5 gene: 51 patients and 43 healthy children were heterozygous (CT), 29 and 21 — had minor variant TT, 18 and 33 — major variant CC (p < 0.05 by the x2). Minor polymorphism of ATG5 gene was associated with increased risk of early manifestation of the asthma (up to 3 years of life) (p < 0.05 by x2). MDR-analysis has showed that polymorphism in ATG5 gene was the strongest predictor of asthma as it reduced entropy level by 7.88 %. Polymorphism in the POMP gene reduces entropy level by 5.21 %, polymorphism in the MTOR gene — by 1.18 %, polymorphism in the FLG gene — by 1.04 %.
Conclusions. These polymorphisms may serve as prognostic markers for the development of asthma in children.
Key words: single-nucleotide polymorphism, filaggrin, proteasome proteolysis, autophagy, MTOR, asthma, pediatrics.
