CC BY
33
®
ребенка
КлУчна пед1атр1я / Clinical Pediatrics
удк 616.5-002.2
ВОЛОСОВЕЦЬ О.П., ДОСЕНКО B.C., КРИВОПУСТОВ С.П., ПАВЛИК О.В., еМЕЦЬ О.В., СТРОЙ д.о. Нацюнальний медичний унверситет¡мен/ О.О. Богомольца, м. Ки!в
функцюнальне значения однонуклеотидного пол1морф13му (rs11204981) в ген! ф1лагрину (flg) для лкування бронжальнот астми у д1тей 3 атоп1чним дерматитом
Резюме. Мета. Метою даного до^дження було визначити зв'язок однонуклеотидного пол1морф1зму в гет фиагрину й експреси мРНК фиагрину в букальному ештели з фенотипом бронх1ально1 астми з атотчним дерматитом в анамнезiу дтей. Методи. Генотипування фиагрину (rs11204981) проводили в груш хворих 1з бронхiальною астмою i контрольнт груш за допомогою ПЛР у реальному чаа. Рiвень експреси мРНК оцнювався з використанням зворотноЧ транскрипщ та наступно'1 ПЛР у реальному чаа. Результати. Ми виявили, що 5 % пацieнтiв основно'1 групи i 2 % контрольноi групи мали мнорну алель (АА), 27 i 36 % вiдповiдно мали гетерозиготну алель, 67 i 61 % вiдповiдно — мажорну алель. Варiанти з генотипом АА з rs11204981 FLG виявилися в 2,4раза частше у пацieнтiв основной тж контрольно'i групи. Гетерозиготний варiант мав значно вищу експрест фиагрину в букальному ештели. Висновки. Ми вважаемо, що полiморфiзм в гет фиагрину (rs11204981) може служити як важливий прогностичний маркер для фенотипу бронхiальноi астми та атотчного дерматиту i що високийрiвень експреси в гетерозиготному стан може свiдчити про протекторну роль даного генотипу у розвитку алерги. Ключовi слова: однонуклеотидний полiморфiзм, фшагрин, астма, педiатрiя.
Вступ
Атотчний дерматит (АД) е хрошчним запальним захворюванням шюри, що зазвичай пов'язане з íh-шими атотчними захворюваннями, такими як астма. Генетичш дефекти епщермальних бшюв, таких як фшагрин (FLG), вщграють важливу роль у розвитку атотчного дерматиту. На сьогодш вивчаеться також 1х зв'язок iз комбшащею АД та астми [4].
Фшагрин вщграе важливу роль у бшково-ль шднш структурi рогового шару, який замшюе плазматичну мембрану диференцшованих кера-тиноципв, утворюючи бар'ер, що перешкоджае втрат води i зменшуе потрапляння алергешв i мь кроорганiзмiв [7]. Ген фшагрину розташований у комплекс ешдермально! диференщацп, на хромо-сомi 1q21. Мутацп в геш фiлагрину е найбiльш зна-чним вщомим генетичним фактором для розвитку АД [1]. Дослщження дефектiв у геш FLG вказало на важливий зв'язок порушеного шюрного бар'ера з розвитком астми та алергп. У первинному досль дженш, яке продемонструвало зв'язок м1ж АД i мутацiями у FLG, Palmer i ствавт. (C.N. Palmer, 2006) також показали, що мутацп в геш були тюно
пов'язаш з астмою, але тшьки в тих oci6, у яких в aHaMHe3i був АД.
Дефекти у FLG е важливими факторами ризику для кожного кроку атопiчного маршу: атопiчного дерматиту, алерпчно! сенсибшзацп, астми з попе-редшм атопiчним дерматитом, алергiчного ринiту. Генетичш варiанти (однонуклеотидний полiмор-фiзм, SNPs) у FLG також е факторами ризику для алерпчних захворювань, таких як астма [2, 5, 6, 8, 9]. Наявшсть полiморфiзму може призводити до змши рiвня експреси даного гена i/або змiни структури його бiлкового продукту — фшагрину. Це знижен-ня бар'ерноi функци може призводити до розвитку
Адреса для листування з авторами:
Кривопустов Сергш Петрович E-mail: [email protected] Павлик Олена Вжтс^вна E-mail: [email protected]
© Волосовець О.П., Досенко В.6., Кривопустов С.П.,
Павлик О.В., бмець О.В., Строй Д.О., 2015 © «Здоров'я дитини», 2015 © Заславський О.Ю., 2015
запалення у зв'язку 3i збшьшенням проникнення алергену через шкiру, призводячи до сенсибшзацй до iмуноглобулiну E (IgE). Дослiдження функцю-нального значення генетичних варiантiв у FLG показало, що цей ген, iмовiрно, робить свш внесок у механiзми, за допомогою яких кiлькiсне скорочен-ня рiвня внутрiшньоклiтинного фiлагрину (експре-сгя матрично! рибонуклешово! кислоти (мРНК)) призводить до парацелюлярного бар'ерного дефекту [3].
Ми припустили, що полiморфiзм rs 11204981 у промоторнш дiлянцi FLG може бути пов'язаний з АД у дитячому вщ та фенотипом АД плюс астма. Щоб перевiрити цю гiпотезу, ми дослiджували вщ-мiнностi в частотi цього SNP мГж дiтьми без алерпч-но! патологГ! (контрольна група) та дГтьми з брон-хiальною астмою та АД в анамнезь Було виявлено, що варiанти з генотипом АА на rs11204981 FLG у 2,4 раза частше зустрiчаються в пащенпв основно!, нгж контрольно! групи. Функщональний аналiз цього SNP показав, що мРНК FLG експресуеться в гете-розигот у 4 рази частше, нГж у пацieнтiв iз генотипом GG (р = 0,03), i в 4,3 раза частше, шж у геноти-пi АА (р = 0,9).
MaTepiaAM та методи
Всi дiти мали симптоми астми, АД на момент огляду або в анамнез^ алергiчний ришт або при-наймнi один позитивний результат шорного прик-тесту з панелi з 15 алергенами. Шюрш прик-тести були проведенi та штерпретоваш згiдно з протоколом Global Allergy and Asthma European Network, з використанням загально! панелi шгаляцшних алергенiв на основi опублiкованих методичних ре-комендацiй (документ бвропейсько! академГ! алер-гологГ! та клшГчно! ГмунологГ! (EAACI) та протокол Пiвнiчних стандарпв i м1жнародного дослiдження астми та алергп серед дiтей (ISAAC), II фаза). Батьки тдписали шформовану згоду на включения в дослщження. Дослiдження включало дiтей вiком вщ 5 до 18 рокiв iз бронхiальною астмою та АД, яю перебували на стацiонарному лiкуваннi в алерголо-гiчному вГддГленнГ Кишсько! мгсько! дитячо! кль шчно! лiкарнi № 2.
Встановлення дiагнозу АД вщбувалося на основi даних, внесених батьками в адаптовану затверджену анкету (ISAAC), i включало в себе скарги на висип, сухють шкiри, лущення, свербГж упродовж дитин-ства. Результатами клтчного обстеження вщпо-вщно до АД були висип, сухють шири, лущення, свербГж, лiхенiзацiя. Наявнiсть бронхГально! астми встановлювалась на основi даних, зi слiв батькiв, щодо персистуючого свистячого дихання (> 2 етзо-дiв нападiв, не пов'язаних з шфекщею верхнiх ди-хальних шляхiв), даних строметрп (знижений об'ем у кшщ першо! секунди форсованого видиху (FEV1) i спiввiдношения FEV1/FVC (форсована життева eмкiсть легень), позитивний тест з р2-агонютами), пщвищення рiвия IgE, позитивних шкiрних прик-тестiв з аероалергенами (табл. 1).
Виб'р SNP
SNP rs11204981 у ген фшагрину, розташований у промоторнiй дiлянцi, був обраний для генотипування, тому що гшотетично вiн може впливати на експресш мРНК фiлагрину i, як повщомляеться, зустрiчаеться в европейських популяцiях.
Видлення ДНК i РНК
Забiр букального епiтелiю проводився з використанням букальних щiток з наступним заморо-жуванням зразкiв та !х зберiганиям при температурi —20 °С. Дезоксирибонуклешову кислоту (ДНК) для генотипування екстрагували зi зразкiв iз використанням наборiв Diatom™ Prep 200 («Лаборатория Изоген», РФ) вщповщно до протоколу виробника. РНК екстрагували зi зразкiв букального епiтелiю з використанням екстракщ! фенолом-хлороформом. Концентрацiю загально! ДНК i РНК визначали за допомогою NanoDrop спектрофотометра ND1000 (NanoDrop Technologies Inc., США).
Генотипування методом noAiMepa3Ho'f ланцюгово'1 реакцп (ПАР)
РеакцГ! амптфжацй проводили з використанням Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems, США), у кшцевш реакцй об'емом 20 мкл, що мютив 2X TaqMan Унiверсальний Master Mix (Applied Biosystems, США), assay C_1792560_10 i матричну ДНК. Амплiфiкацiя фрагмента генiв складалася зГ стад! денатуращ! при 95 °С протягом 20 с, а потам 40 циклгв амплГфгкацГ! при 95 °С протягом 3 с i 60 °С протягом 30 с. АналГз даних проводився з 7500 Fast Real-Time PCR Software.
Оцнка експресП за допомогою зворотно'1 транскрипцп i ПАР у реальному часi
Зворотну транскрипщю проводили з використанням RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США). Отриману одноланцюго-ву ДНК використовували для ПЛР Гз застосуванням праймерГв. ЕкспресГя гена FLG визначалась за допомогою TaqMan assay експресГ! гешв (HS 00856927_g1, Applied Biosystems, США). Пари прямого i зворотно-го праймерГв для гешв, зазначених вище, i TaqMan зондГв для цгльових мРНК були розробленГ Applied Biosystems на основГ послГдовностГ мРНК людини. Для контролю за якютю видглення РНК та порГв-няння штенсивносп експресГ! гена FLG паралель-но амплГфжували фрагмент гена ß-актину — одного з house-keeping гешв Гз використанням TaqMan ß-актину контроль реагенту (FAM Probe). АмплГфь кацгя гена FLG складалася з таких циклГв: денатура-цгя — 95 °С протягом 20 с, приеднання праймерГв — 95 °С протягом 3 с, елонгацГя — 60 °С протягом 30 с (45 циклГв) Гз використанням 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). АналГз даних проводився з 7500 Fast Real-Time PCR Software.
Статистичний аналз
Отримаш дан обробляли статистично з використанням програми Excel 2000 та Origin 7.0. ВГд-
мшшсть у 4acTOTi генотипу й алелей мГж групою пацieнтiв i3 бронхiальною астмою i контрольною групою визначалась за допомогою %2-тесту. Зна-чення р < 0,05 вважалося статистично значущим. Розподш частот генотипiв був проаналiзований i3 використанням тесту %2 Пiрсона з програмним за-безпеченням Excel 2000. Для перевiрки рiвноваги Хардi — Вайнберга використовували SNPAnalyzer (веб-програмне забезпечення).
Резудьтати
Атопiчний дерматит в анамнезi був присутнiй у 100 % дггей, 35 % iз них мали прояви атотчного дерматиту на момент огляду у виглядi висипу, сухостi шюри, лущення, свербежу, лГхешзацп. 80 % пащен-тiв основное групи мали АД легкого ступеня тяжко-сп за шкалою SCORAD, 20 % — середнього ступеня тяжкосп. 1нша супутня алергiчна патологiя виявле-на в 46 % дггей (алерпчний ринiт, харчова алергiя). 72 % дггей мали загострення астми, що проявлялось наявнiстю свистячих хритв i кашлем (з яких 60 %
мали загострення легкого ступеня, 39 % — середньо^ тяжкосп, 1 % — тяжке загострення), 28 % дггей мали ремiсiю. У 60 % пащенпв основное групи виявлено зниження показника FEV1 (< 80 %), 34 % мали по-зитивний тест ¡з р2-агошстом (табл. 1).
РозподГл генотипiв SNP вщповщае закону Хар-дГ — Вайнберга. Було виявлено, що у 5 % пащенпв основное групи i у 2 % здорових дней була наявна мшорна алель (AA) (р > 0,05 за %2-тестом, вщношен-ня шанав (OR) — 2,28, 95% довГрчий штервал (Д1) 0,42—12,2), 27 % пащенпв основное групи i 36 % здорових дней мали гетерозиготну алель (GA) (р > 0,05 за %2-тестом, OR — 1,69, 95% Д1 0,92-3,1), 67 i 61 % вщповщно мали мажорну алель (GG) (р > 0,05 за %2-тестом) (табл. 2-4, рис. 1). ВарГанти з генотипом АА з rs11204981 FLG виявилися у 2,4 раза часпше в основнш, н1ж у контрольнш груш.
Експрес1я фёагрину
Також виявлено, що рГвень експресп мРНК фь лагрину у пащенпв основное групи ¡з генотипом GG
Таблиця 1. Характеристика па^ен^в основно/ групи з АД та бронх'альною астмою
Характеристика Кшьшсть пацieнтiв i3 доступними даними (n) Значення
Середнш BiK (роки) 100 8,0 ± 2,1
Стввщношення стат (вщсоток хлопчишв) 100 57
Середне значення SCORAD (CI) 18 20 (16-24)
Середнш загальний IgE, kU • l-1 (IQ) 24 821,4 (42-8000)
Наявнють АД, % 100 35
FEV1, % 76 76,4 (28,64-117,8)
FEV1/FVC 76 106,74 (84,4-118,39)
Покращення FEV1 пюля сальбутамолу, % 76 12,5 (0,4-87,2)
Таблиця 2. Вдношення шан&в для кодомiнaнтноl моделi успадкування в дтей iз бронх'альною астмою
('¡з 95% дов'рчим нтервалом)
Генотип Генотип (N) Вщношення шанав та 95% Д1
XBopi Здоровi
GG 67 61 1 (ref)
GA 27 36 1,69 (0,92-3,1)
AA 5 2 2,28 (0,42-12,2)
Таблиця 3. Вдношення шан&в для домiнaнтноl моделi успадкування у дтей iз бронх'альною астмою
(i3 95% дов'рчим нтервалом)
Генотип Генотип (N) Вщношення шансiв та 95%% Д1
XBopi Здopoвi
GG 67 61 1
GA/AA 32 38 0,77 (0,43-1,38)
Таблиця 4. Вдношення шан&в для рецесивноi моделi успадкування у дтей iз бронх'альною астмою
(i3 95% дов'рчим iнтервалом)
Генотип Генотип (N) Вщношення шансiв та 95%% Д1
Xвopi Здopoвi
GG/GA 94 97 1
AA 5 2 2,58 (0,49-13,62)
TOpiB ризику, що можуть вплинути на ризик розви-тку бронхiальноI астми у дггей з АД, дуже важлива. KpiM того, бiльш глибоке розумшня взаемозв'язку м1ж АД та астмою може забезпечити розумшня патогенезу астми. Ми дослщжували взаемозв'язок ди-тячого АД та астми з епщермальним быком, зако-дованим на 1q21, а також iз даними експресп РНК i дослщженням вiдмiнностей частот алелей у дггей з астмою. Було виявлено можливий зв'язок мгж SNP у геш FLG та фенотипом АД плюс астма в дггей. АА-генотип SNP rs11204981 е фактором ризику фенотипу АД плюс астма. Отримаш результати експресп РНК фГлагрину в букальному ештелп, можливо, ма-ють зв'язок гз FLG-полiморфiзмом. Таким чином, полгморфгзм у геш FLG може вплинути на експре-сш фглагрину у ширь
У данш робот ми визначили частоту rs11204981 SNP i показали, що мшорна алель зустрГчаеться в 2,4 раза частше у пацiентiв основно! групи, хоча не було отримано статистично! значущостi. Асощацп генотипу з клш!чними параметрами також не було встановлено рашше. Дослiдниками був показаний зв'язок шдвищеного ризику розвитку атопiчного дерматиту з шшими полiморфiзмами FLG, а саме S. Weidinger, A.G. Saffron (2013), M.H. Lambert та ш. (2010). Зокрема, були визначеш позитивш асощацп rs2184951 i rs12730241 [6] 1з бронхiальною астмою та алерпчними захворюваннями. пол1мор-ф1зм rs11204981 був широко вивчений у европей-ськш популяцп i, отже, був обраний нами для до-слiдження.
становить 22,80 ± 11,67 (р > 0,05 пор!вняно з генотипом АА), 92,95 ± 35,30 -у генотип GA (р < 0,05 по-р1вняно з генотипом GG) i 21,8 ± 13,4 — у генотит АА (р > 0,05 пор!вняно з генотипом GA). Таким чином, гетерозиготний вар!ант мае значно вищу експре-сго фшагрину в ештелп слизово! оболонки рота (рис. 2).
Обговорення та висновки
Лiтерaтурнi данi ви-сви\люють важливу роль порушення функцп ет-дермального бар'ера в розвитку АД i, можливо, фенотипу АД плюс астма. Поеднання АД та астми може становити особли-вий ендофенотип з уш-кальними патогенетичним i прогностичним значен- Рисунок 2. Експреся гена FLG визначалась за допомогою TaqMan assay нями. 1дентифжаЦш фак- експресп ген/в (HS 00856927_g1, Applied Biosystems, США)
Рисунок 1. Результати визначення алельного пол'морф'зму у промотор'1 гену FLG: виявлено, що у 5 % пащент'в основноi групи i у 2 % здорових дтей була наявна мнорна алель, 27 % па^енлв
основноi групи i 36 % здорових дтей мали гетерозиготну алель, 67 i 61 % вщповщно мали мажорну алель
Тим не менше при вивченнi piBra мРНК фша-грину ми змогли показати, що цей полiмоpфiзм функщональний i впливае на експpесiю фшагрину. Експpесiя мРНК FLG в гетерозигот у 4 рази вища, шж у гомозиготному генотипi GG (р < 0,05), i в 4,3 раза вища, н1ж у гомозиготному генотит ризику (р > 0,05).
Отримат данi щодо функцiонального значення АА-генотипу FLG полiмоpфiзму, таким чином, да-ють можливiсть припустити, що цей полiмоpфiзм впливае на експресш цього гена та може мати про-гностичне значення в розвитку астми та АД.
Таким чином, полiмоpфiзм гена фшагрину може самостшно служити корисним маркером для про-гнозування розвитку бpонхiальноï астми у дггей з АД.
Список лператури
1. Brown S.J., Irwin McLean W.H. One remarkable molecule: Filaggrin//J. Invest. Dermatol. — 2012. — 132(3Pt. 2). — 751-762. doi:10.1038/jid.2011.393.
2. Chang Y.C., Wu W.M, Chen C.H, Hu C.F., Hsu L.A. Association between P478S polymorphism of the filaggrin gene and risk of psoriasis in a Chinese population in Taiwan //Arch. Dermatol. Res. — 2008. — 300. — 133-7. doi:10.1007/s00403-007-0821-2.
3. Cole C., Karin Kroboth K., Schurch N.J. Filaggrin-stratified transcriptomic analysis of pediatric skin identifies mechanistic pathways in patients with atopic dermatitis// J. Allergy Clin. Immunol. — 2014. — 134(1). — 82-91. doi: 10.1016/j.jaci.2014.04.021
4. De Benedetto A., Kubo A., Beck L.A. Skin barrier disruption: a requirement for allergen sensitization? // J. Invest. Dermatol. — 2012. — 132. — 949-63.
5. Eun Joo Kim, Mi Sook Jeong et al. Genetic Polymorphism of FLG in Korean Ichthyosis Vulgaris Patients // Ann. Dermatol. — 2011. — 23(2). — 170-176. doi: 10.5021/ad.2011.23.2.170
6. Lambert M.H., Tremblay K. et al. Association between filaggrin family member genes, asthma, atopy and atopic asthma with atopic dermatitis history in the subjects from the Saguenay-Lac-Saint-Jean founder population // Allergy Asthma Clin. Immunol. — 2010. — 6(Suppl. 3). — P. 4. doi: 10.1186/1710-1492-6-S3-P4.
7. Palmer C.N.A., Irvine A.D., Terron-Kwiatkowski A. et al. Common loss-of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis // Nat. Genet. — 2006. — 38. — 441-6.
8. Seon-Young Kim, Sung Wan Yang et al. Association between P478S polymorphism of the filaggrin gene & atopic dermatitis // Indian. J. Med. Res. — 2013. — 138(6). — 922-927.
9. Wang I.J, Lin T.J., Kuo C.F., Lin S.L., Lee Y.L., Chen P.C. Filaggrin polymorphism P478S, IgE level, and atopic phenotypes // Br. J. Dermatol. — 2011. — 164. — 791-6.
otpumaho 05.01.15 ■
Волосовец А.П., Аосенко В.Е., Кривопустов С.П., ПавликЕ.В., Емец О.В., Строй А.О. Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, г. Киев
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОДНОНУКЛЕОТИДНОГО
ПОЛИМОРФИЗМА (RS11204981) В ГЕНЕ ФИЛАГГРИНА (FLG) ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У ДЕТЕЙ С АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ
Резюме. Цель. Целью данного исследования было определить связь однонуклеотидного полиморфизма в гене филаггрина и экспрессии мРНК филаггрина в буккаль-ном эпителии с фенотипом бронхиальной астмы и атопи-ческим дерматитом в анамнезе у детей. Методы. Геноти-пирование филаггрина (rs11204981) проводили в группе больных с бронхиальной астмой и контрольной группе с помощью ПЦР в реальном времени. Уровень экспрессии мРНК оценивался с использованием обратной транскрипции и последующей ПЦР в реальном времени. Результаты. Мы обнаружили, что 5 % пациентов основной группы и 2 % контрольной группы имели минорную аллель (AA), 27 и 36 % соответственно имели гетерозиготную аллель, 67 и 61 % соответственно имели мажорную аллель. Варианты с генотипом АА с rs11204981 встречались в 2,4 раза чаще у пациентов основной, чем контрольной группы. Гетерозиготный вариант имел значительно более высокую экспрессию филаггрина в буккальном эпителии. Выводы. Мы считаем, что полиморфизм в гене филаггрина (rs11204981) может служить в качестве важного прогностического маркера для фенотипа бронхиальной астмы и атопического дерматита, и высокий уровень экспрессии в гетерозиготном состоянии может свидетельствовать о протекторной роли данного генотипа в развитии аллергии.
Ключевые слова: однонуклеотидный полиморфизм, фи-лаггрин, астма, педиатрия.
Volosovets O.P., Dosenko V.Ye., KryvopustovS.P., PavlykO.V., Yemets O.V., Stroi D.O.
National Medical University named after O.O. Bohomolets, Kyiv, Ukraine
FUNCTIONAL SIGNIFICANCE OF SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISM (RS11204981) IN FILAGGRIN (FLG) GENE FOR THE TREATMENT OF BRONCHIAL ASTHMA IN CHILDREN WITH ATOPIC DERMATITIS
Summary. Objective. The objective of this study was to determine the correlation between single-nucleotide polymorphism in filaggrin gene and expression of filaggrin mRNA in buccal epithelium and the phenotype of bronchial asthma with atopic dermatitis in medical history of children. Methods. Filaggrin genotyping (rs11204981) was carried out in group of patients with bronchial asthma and control group using real-time poly-merase chain reaction (PCR). The level of mRNA expression was assessed by reverse transcription and subsequent real-time PCR. Results. We have found that 5 % of patients in the study group and 2 % in the control group had a minor allele (AA), 27 and 36 %, respectively, — heterozygous allele (GA), 67 and 61 % — major allele (GG). Variants with the AA genotype ofthe FLG rs11204981 were found 2.4 times more often in patients from the study group than in controls. Heterozygous variant had significantly higher expression in filaggrin in buccal epithelium. Conclusions. We believe that polymorphism in filaggrin gene (rs11204981) can serve as an important prognostic marker for the phenotype of bronchial asthma and atopic dermatitis, and that high levels of expression in the heterozygous state may indicate the protective role of this genotype in the development of allergy.
Key words: single-nucleotide polymorphism, filaggrin, asthma, pediatrics.
