CC BY
8УДК 574.3:575.24/.25]:616.151.5
А.Л. Гончар1, И.Б. Моссэ1, А.А. Иванов1, Н.И. Моссэ2, К.А. Моссэ2
ассоциация полиморфных вариантов гена pai-1
и мутации factor v leiden с генетической предрасположенностью к инфаркту миокарда
1ГНУ « Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», 220072, Беларусь, г. Минск, ул. Академическая, 27 2ГУ РНПЦ «Мать и дитя» МЗ Беларуси, Минск, ул. Орловская, 66
Введение
Инфаркт миокарда определяется как обусловленное расстройством коронарного кровообращения поражение миокарда, возникающее в результате нарушения равновесия между коронарным кровотоком и метаболическими потребностями сердечной мышцы. Развитие этого заболевания обусловлено взаимодействием различных генетических факторов и условий окружающей среды.
К настоящему времени выявлено несколько десятков генетических вариантов, носитель-ство которых ассоциировано с развитием про-тромботических сдвигов в системе гемостаза и/или риском атеротромбоза. Большинство из них кодирует компоненты плазменного и тром-боцитарного звеньев гемостаза. Однако существует множество вопросов относительно их участия в патогенезе различных клинических проявлений и целесообразности диагностики этих маркеров в практических целях. Сложившаяся ситуация во многом объясняется многофакторной природой атеротромбоза и сложным характером взаимодействия генетических и экзогенных факторов риска, лежащих в основе или провоцирующих развитие патологических сдвигов в системе гемостаза. Эпидемиологические исследования указывают также на возможность неодинакового вклада тех или иных факторов (в том числе, генетических) в патогенез атеротромбоза у представителей различных популяционных групп.
Одним из основных компонентов антисвер-тывающей системы крови является ингибитор активатора плазминогена - Plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) [1]. Этот белок регулирует тканевый и урокиназный актива-
торы плазминогена. Он циркулирует в плазме крови, а также присутствует в гранулах тромбоцитов. РА1-1 синтезируется эндотелиаль-ными клетками, моноцитами, макрофагами, гладкомышечными клетками, адипоцитами [2]. РА1-1 обеспечивает до 60% общей инги-биторной активности в отношении активатора плазминогена в плазме, тем самым играет важную роль в регуляции фибринолиза. Повышение уровня РА1-1 связано с увеличением риска тромбозов [3].
Показано, что уровень РА1-1 в плазме крови ассоциирован с полиморфизмом в области промотора гена РА1-1, представляющего собой однонуклеотидную делецию/инсерцию гуанина (4G/5G). Лица, гомозиготные по 4G аллелю, обладают более высоким уровнем содержания РА1-1 в плазме, а гомозиготные по 5G аллелю - более низким. Механизм, лежащий в основе аллельных различий в уровне синтеза РА1-1, был установлен после обнаружения того, что оба аллеля могут связываться с активатором транскрипции гена, тогда как аллель 5G также имеет сайт связывания с транскрипционным репрессором [7]. Отсутствие действия репрес-сора и обеспечивает более высокий уровень транскрипции гена РА1-1 с аллелем 4G. Влияние 4G/5G полиморфизма гена РА1-1 на риск развития инфаркта миокарда до сих пор точно не установлено. Некоторые результаты свидетельствуют, что генотип 4G/4G обуславливает повышенный риск инфаркта миокарда [8], но в то же время имеются сообщения, что этот генотип является нейтральным [9] или даже протекторным [10].
Мутация фактор Лейдена (FactorVLeiden), обу-
Молекулярная и прикладная генетика. Том 9, 2009 г.
Молекулярная и прикладная генетика. Том 9, 2009 г.
словливающая резистентность к активированному протеину «С» [11], получила свое название в связи с тем, что группа исследователей из г. Лейден впервые идентифицировала данную мутацию у пациентов, имеющих нарушение в системе тромбооб-разования. Мутация приводит к замене аргинина на глутамин в 506 положении белка, что является причиной нарушения молекулярной структуры фактора V свертывания крови.
Известно, что защиту организма от избыточной активности факторов свертывания и образования тромбов обеспечивают две мощные антитромбиновые системы: антитромбин III и система протеина «С». В нормальных условиях активированный протеин «С» расщепляет факторы свертывания V и VIII, замедляя процесс свертывания. У лиц с резистентностью к активированному протеину «С» резко ослаблена способность расщеплять фактор свер-
тывания V. Молекула фактора V полностью сохраняет свои прокоагулянтные свойства, однако скорость ее расщепления и инактивации у носителей мутации значительно снижена. В крови у таких лиц содержится избыточное количество активного фактора V и других факторов свертывания, что может явиться основой для развития тромбоза.
Установлено, что лейденская мутация наследуется по аутосомно-доминантному типу. Этот наследственный дефект является известным фактором предрасположенности к венозным тромбозам - у лиц с частыми тромбозами он встречается в 52% случаев, у пациентов с первичным тромбозом глубоких вен - в 20%, а среди здорового населения - в 3-7%. [12].
В то же время роль мутации Factor V Leiden в развитии артериальных тромбозов изучена недостаточно.
Материалы и методы
Образцы крови больных, перенесших острый инфаркт миокарда, были предоставлены Республиканским научно-практическим центром «Кардиология» МЗ Беларуси. Контрольная группа состояла из лиц, старше 50 лет, без явной сердечно-сосудистой патологии. В качестве биологического материала для исследования была использована ДНК, экстрагированная из пятен крови, высушенных на специальных бланках.
Идентификацию мутации Factor V Leiden выполняли методом ARMS (amplification refractory mutation system) [13]. Разделение продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в 2-процентном агарозном геле
с последующим окрашиванием бромистым этидием.
Для идентификации аллелей полиморфизма 4G/5G гена РА1-1 использовался оригинальный протокол, включающий анализ продуктов ПЦР методом автоматического капиллярного электрофореза с полихромным лазерным сканированием.
Амплификацию проводили с праймерами, фланкирующими участок ДНК, содержащий данный полиморфизм. Для детекции образцов ДНК в автоматическом анализаторе был синтезирован меченый вариант прямого прай-мера РА1-№:
1. PAI-1F - CACAGAGAGAGTCTGGCCACGT-FAM
2. PAI-1R - CCAACAGAGGACTCTTGGTCT
Обработку данных и определение аллелей ных программ GENESCAN (Applied Bio-выполняли с помощью пакета компьютер- systems).
Результаты и обсуждение
1.Исследование частот генотипов и полиморфных аллелей 4G/5G гена РА1-1. Распределение аллелей гена РА1-1 исследовано в контрольной группе из 150 человек (300 хромосом). Частота полиморфного варианта 4G в группе составила 53,7%. Выявлено 43 (28,7%) гомозиготных носителя и 75 (50%)
гетерозиготных носителей данного аллеля. Частота аллеля 5G составила 46,3%. В гомозиготном состоянии он был выявлен у 32 (21,3%) человек.
Полученные нами результаты достаточно хорошо согласуются с данными, полученными в США, Швеции и Чехии (рис.1).
Рис. 1. Частоты генотипов полиморфизма 4G/5G гена РА1-1 в различных популяциях [14 -20].
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
по со
^ ГЧ ГЧ
ГЧ со
ГЧ и
>
(К а
\ го
го X ^
н СП ш
Т ш
о
по о
о СП 1Л
1Л
^ и
>
ГС а
\ го
го X ^
н СП ш
Т ш
по
гН
ьп СП гч о
гч по гч А ^ гч
ГС >
(К ■ ;
^ го <г
го н X ш ^ ш
Т ш и
о о"
4 G /4 G
4 G /5 G
5 G /5 G
Однако сравнение с данными, опубликованными в научной литературе, выявило существенные различия с результатами в России и Польше, странах наиболее близких к Беларуси территориально и этнически. Возможно, что причиной этого являются не только популяци-онные различия, но и использовавшиеся ранее методики определения аллелей полиморфизма 40/50, не всегда обеспечивающие получение достоверных данных.
Аллели гена РА1-1 исследованы также у 80 пациентов с инфарктом миокарда (160 хромосом).
Частота варианта 40 в этой группе составила 62,5%. Идентифицированы 33 гомозиготных носителя и 34 гетерозиготных носителя данного аллеля. Частота аллеля 50 составила 37,5%. В гомозиготном состоянии он был выявлен у 13 человек. Распределение генотипов, а также частоты отдельных аллелей приведены в таблице 1. Сравнительный анализ частот аллелей полиморфизма 40/50 гена РА1-1 среди пациентов и в контрольной группе свидетельствует, что генотип 40/40 является предрасполагающим к возникновению ОИМ, а 50/50-протекторным.
Таблица 1
Частоты генотипов по полиморфным аллелям 4G/5G гена PAI-1 у пациентов с инфарктом миокарда и в контрольной группе
Генотип Аллели
4G/4G 4G/5G 5G/5G 4G 5G
Контрольная группа N=150 N=300
43 (28,7%) 75 (50,0%) 32 (21,3%) 161 (54,1%) 139 (45,9%)
Пациенты с инфарктом миокарда N=80 N=160
33 (41,2%) 34 (42,5 %) 13 (16,3%) 100 (62,5%) 60 (37,5%)
х2 7,74 2,84
Р 0,01 0,10
2. Исследование частоты мутации Factor V Leiden. Поиск мутации Factor V Leiden выполнено в группе, состоящей из 100 пациентов с инфарктом миокарда, среди которых мы обнаружили 7 гетерозиготных носителей и ни одного гомозиготного.
Таким образом, установлено, что распространенность данной мутации у пациентов с ОИМ в 2,3 раза превышает данный показатель в контрольной группе. Эти результаты свидетельствует, что мутация Factor V Leiden также вносит определенный вклад в наследственную предрасположенность к инфаркту миокарда.
Частоты данной мутации в разных странах колеблются в зависимости от расовых и этнических групп. Для Европейских популяций низкая частота носителей мутации зарегистрирована у жителей Испании, Ирландии, Италии, Австрии и Франции, а высокая - у жителей Дании, Греции и особенно Швеции (11%). В Голландии, Германии и Исландии частота мутации находится в пределах 6-6,6%.
Для жителей Восточной Азии (Япония, Тайвань, Корея, Индонезия, Китай, Монголия, Гонконг), а также аборигенов Австралии характерно отсутствие Factor V Leiden мутации. В то же время среди белых переселенцев, проживающих в Австралии, но-сительство мутации составляет около 2%. В Африке по данным всех проведенных ис-
Частота мутации Factor V Leiden в данной группе составила 7%. В то же время в контрольной группе численностью 100 человек было выявлено 3 гетерозиготных носителя данной мутации, т.е. частота мутации составила 3 % (табл. 2).
следований не зарегистрировано ни одного случая обнаружения лейденской мутации [34]. Она отсутствует также у жителей США, которые являются переселенцами из стран Африки и Восточной Азии.
Сравнительный анализ популяционных частот мутации Factor V Leiden в разных странах позволяет сделать вывод, что она значительно чаще встречается у белокожего населения планеты по сравнению с людьми с темным цветом кожи, а также имеет место градиент уменьшения распространения мутации в странах Европы с севера на юг (рис.2).
Полученная нами частота встречаемости мутации Factor V Leiden (3,0 %) в контрольной группе полностью совпадает с популя-ционной частотой для Беларуси (2,9%), установленной ранее [22]. Эти величины очень близки к результатам, полученным в Италии (3,0%) и России (2,6%). Таким образом, дополнительный общепопуляционный риск ИМ, определяемый мутацией Factor V Leiden, для Беларуси ниже чем в станах северной и центральной Европы и соответствует таковому для южной и восточной Европы.
Таблица 2
Частоты генотипов по мутантным аллелям Factor V Leiden
Группы Генотип Аллели
GG GA AA G A
Контрольная группа N=100 N=200
97 (97,0%) 3 (3,0%) 0 (0%) 197 (98,5%) 3 (1,5%)
Пациенты с инфарктом миокарда N=100 N=200
93 (93,0%) 7 (7,0%) 0 (0%) 193 (96,5%) 7 (3,5%)
х2 5,8 2,83
P 0,01 0,09
Рис.2. Частоты мутации Factor V Leiden в разных странах мира [21-33]
заключение
Определены частоты генотипов по полиморфным аллелям 4G/5G гена PAI-1 у пациентов с инфарктом миокарда и в контрольной группе. Полученные результаты позволяют заключить, что генотип 4G/4G является предрасполагающим к возникновению инфаркта миокарда, а 5G/5G - протекторным.
При определении частоты мутации Factor V Leiden установлено, что частота её встречаемости у пациентов с инфарктом миокарда в 2,3 раза превышает эти показатели в контрольной группе. Эти результаты свидетельствует о том, что мутация Factor V Leiden вносит существенный вклад в предрасположенность к данному заболеванию.
Проведено сравнение выявленных нами в контрольной группе частот генотипов гена PAI-1 и мутации Factor V Leiden с литературными данными. Определенная нами частота
встречаемости лейденской мутации полностью совпадает с популяционной частотой для Беларуси, установленной ранее [22]. Дополнительный общепопуляционный риск ИМ, определяемый мутацией Factor V Leiden, для Беларуси ниже чем в станах северной и центральной Европы и соответствует таковому для южной и восточной Европы.
Распределение полиморфных аллелей гена PAI-1 достаточно хорошо согласуются с таковым, полученным в США, Швеции и Чехии, однако существенно отличаются от России и Польше, стран наиболее близких к Беларуси территориально и этнически. Возможно, что причиной этого являются не только популяци-онные различия, но и использовавшиеся ранее в исследованиях методики определения аллелей полиморфизма 4G/5G, не всегда обеспечивающие получение достоверных данных.
Список использованных источников
1. Saksela O, Cell-associated plasminogen activation:regulation and physiologic functions/ O. Saksela, D.B. Rifkin // Annu Rev Cell Biol. -1988. - Vol. 4. - P. 93-126.
2. Plasminogen activator inhibitor-1 expression in human liver and healthy or
atherosclerotic vessel walls/ N. Chomiki [et al.] // Thromb Haemost. - 1994. - Vol. 72. -P. 44 -53.
3. Increased type 1 plasminogen activator inhibitor gene expression in atherosclerotic human arteries / J. Schneiderman [et al.] //
Proc Natl Acad Sci USA. - 1992. - Vol. 89. -P. 6998 -7002.
6. Rapid genotyping of hemostatic gene polymorphisms using the 5" nuclease assay / A. Tjarnlund [et al.] // Thromb Haemost. - 2003. -Vol. 89. - P. 936 -942.
7. An alternative method for PAI-1 promoter polymorphism (4G/5G) typing / M. Margaglione [et al.] // Thromb Haemost. - 1997. - Vol. 77. -P. 605-606.
8. Allele specific PCR for detection of a sequence polymorphism in the promoter region of the plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) gene / G. Falk [et al.] // Fibrinolysis. - 1995. -Vol. 9. - P. 170-174.
9. Allelespecificincreaseinbasaltranscription of the plasminogen activator inhibitor-1 gene is associated with myocardial infarction / P. Eriksson [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. -1995. - Vol. 92. - P. 1851-1855.
10. Genetic variation in coagulation and fibrinolytic proteins and their relation with acute myocardial infarction: a systematic review / S.M. Boekholdt [et al.]// Circulation. - 2001. -Vol. 104. - P. 3063-3068.
11. The 4G/5G polymorphism in the plasminogen activator inhibitor-1 gene is not associated with myocardial infarction / C.J. Doggen [et al.] // Thromb Haemost. - 1999. - Vol. 82. -P. 115-120.
12. 4G/4G genotype of PAI-1 gene is associated with reduced risk of stroke in elderly / T. Hoekstra [et al.] // Stroke. - 2003. - Vol. 34. -P. 2822-2828.
13. Громов, А.Ю. Резистентность к Активированному протеину С - ведущая причина венозных тромбрзов / Ю.А. Громов // Ведомости Апрель. Информационный бюллетень Института терапии СО РАМН. - 1997. - №3.
14. Spek, C. A. Genetic Risk Factors for Venous Thrombosis / C.A. Spek, P. H. Reitsma // Molecular Genetics and Metabolism. - 2000. - Vol.71. -P. 51-61.
15. Development of a rapid DNA screening procedure for the Factor V Leiden mutation / G.A. Scobie [et al.] // J. Clin. Pathol.: Mol. Pathol. - 1996. - Vol.49. - P. 361-363
16. Капустин, С.И. Молекулярно-ге-нетические аспекты патогенеза венозного тромбоэмболизма: Автореф. дис. док. биол. наук. - СПб. - 2007.
17. Insulin Resistance Atherosclerosis Study The Activator Inhibitor-1 Levels in Blacks, Hispanics, and Non-Hispanic Whites: Promoter (4G/5G) Plasminogen Activator Inhibitor-1 Genotype and Plasminogen/ R. Festa [et al.] // Circulation. - 2003. - Vol. 107. - P. 2422-2427.
18. Fibrinolytic Gene Polymorphism and Ischemic Stroke / K. Jood [et al.] //Stroke. -2005. - Vol. 36. - P. 2077-2081.
19. Cohorts Replicated Findings in Two Nested Case-Control Studies Based on Independent Plasminogen Activator Inhibitor-1 4G/5G Polymorphism and Risk of Stroke / P.G. Wiklund [et al.] // Stroke. - 2005. - Vol. 36. -P. 1661-1665.
20. The PAI-1 Gene Locus 4G/5G Polymorphism Is Associated With a Family History of Coronary Artery Disease/ M. Margaglione [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1998. -Vol. 18. - P. 152-156.
21. Plasminogen-activator-inhibitor-1 promoter polymorphism as a risk factor for adult periodontitis in non-smokers / L. Izakovicova-Holla [et al.] // Genes and Immunity. - 2002. -Vol. 3. - P. 292-294.
22. Blasiak,J.Plasminogenactivatorinhibitor-1 (PAI-1) gene 4G/5G promoter polymorphism is not associated with breast cancer / J. Blasiak, B. Smolarz // Acta Biochimica Polonica. - 2000. -Vol. 47. - P. 191-199.
23. Hong S.H. Genotype Distribution of the Mutations in the Coagulation Factor V Gene in the Korean Population: Absence of Its Association with Coronary Artery Disease // Korean J Biol Sci. - 2003. - Vol. 7. - P. 255-259.
24. Роль мутаций фактора II и фактора V свертывания крови в развитии венозных тромбозов у жителей Республики Беларусь / А.А. Гусина [и др.] // Медицинские новости. - 2007. - № 5. -С. 85-88.
25. The frequencies of mutations in Factor V (FV Leiden), Prothrombin (G20210A) and 5,10-methylentetrahydrofolate reductase (C677T) genes in Russian [In Russian]/ E.A. Kalashnikova [et al.]// Medicinskaya Genetika. - 2006. - Vol. 7. - P. 68-72.
26. Factor V Leiden (G1691A) and prothrom-bin-G20210A alleles among patients with deep venous thrombosis and in the general population from Spain / F. Frances [et al.] // Rev. med. Chile. - 2006. - Vol. 134(1). - P. 13-20.
27. Rodeghiero, F. Activated protein C resistance and factor V Leiden mutation are independent risk factors for venous thromboembolism / F. Rodeghiero, A. Tosetto. // Ann Intern Med. - 1999. -Vol. 130. - P. 643-650.
28. The Arg506Gln mutation (FV Leiden) among a cohort of 4188 unselected Danish newborns / T.B. Larsen [et al.] // Thromb Res. -1998. - Vol. 89(5). - P. 211-215.
29. Prevalence of molecular risk factors FV Leiden, FV HR2, FII 20210G>A and MTHFR 677C>T in different populations and ethnic groups of Germany, Costa Rica and India / F.H. Herrmann [et al.] // Int J Hum Genet. - 2001. -Vol. 1(1). - P. 33-39.
30. Prevalence of factor VQ506 and prothrombin 20210 A mutations in an apparently healthy Icelandic population and patients suffering from venous thrombosis / I. Olafsson [et al.] // Thromb
Haemost. - 1998. - Vol. 79. - P. 684-685.
31. Prevalence of factor V gene mutation amongst myocardial infarction patients and healthy controls is higher in Sweden than in other countries / J. Holm [et al.] // J Intern Med. - 1996. - Vol. 239 (3). - P. 221-226.
32. Prevalence and association of the factor V Leiden and prothrombin G20210A in healthy subjects and patients with venous thromboembolism / D. Coen [et al.] // Croat Med J. - 2001. -Vol. 42(4). - P. 488-492.
33. Prevalence of Factor V Leiden, Prothrombin G20210A and MTHFR C677T mutations in a Greek population of blood donors / T. Antonia-di [et al.] // Am J Hematol. - 1999. - Vol. 61. -P. 265-267.
34. Lee D.H. Prevalence of factor V Leiden in a Canadian blood donor population / D.H. Lee, P A. Henderson, M.A. Blajchman // CMAJ. -1996. - Vol. 155. - P. 285-289.
Дата поступления статьи 3 марта 2009 г.
