CC BY
118
УДК 61:575:616.517
М.В. Смольникова, С.В. Смирнова
ассоциация полиморфных маркеров генов IL4 (с-590т) и IL10 (с-597А) с псориатическим артритом
НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск)
Псориатический артрит — хроническое прогрессирующее заболевание суставов, протекающее на фоне псориаза. Как и. артрит, с псориазом, в отдельности, он представляет, собой системное мультифакториальное заболевание, причины, которого доподлинно неизвестны, в связи с чем профилактика данного заболевания неэффективна. Предполагается, что существует, генетически обусловленная предрасположенность к развитию псориатического артрита, в которой существенное значение имеют, гены цитокинов, основных медиаторов иммунного ответа. Проведено исследование распределения, полиморфизма генов противовоспалительных цитокинов IL4 (C-590T) и. IL10 (C-597A) у больных псориазом, псориатическим. артритом, и. здоровых доноров. Получено распределение генов IL4 и. IL10 в европейской популяции г. Красноярска. Установлена ассоциация полиморфного маркера С-590Т гена IL4, расположенного в промоторной области, с псориатическим. артритом.. Полученные данные позволяют, предположить, что аллельный вариант. С-590 является, предрасполагающим, фактором, к более тяжелому течению псориаза и. развитию патологии костно-суставной системы..
Ключевые слова: полиморфизм генов, псориатический артрит, интерлейкин
AssociATioN between poLYMoRpHic markers of THE IL4 (с-590т) AND IL10 (с-597А) GENEs AND psoRiATic ARTHRITIs
M.V. Smolnikova, S.V. Smirnova Institute of Medical Problems of the North SB RAMS (Krasnoyarsk)
Psoriatic arthritis is a chronic progressive disease of joints developing along with psoriasis. Likewise arthritis and psoriasis alone, it represents the systemic multifactorial disease of unknown etiology; therefore prevention of the disease is inefficient. Genetic predisposition, to psoriatic arthritis development is proposed, with essential role of genes coding for cytokines, the main mediators of immune response. A study of the prevalence of polymorphisms of the genes of anti-inflammatory cytokines IL4 (C-590T) and. IL10 (C-597A) in patients with psoriasis, psoriatic arthritis and. healthy donors was carried out. The prevalence of the polymorphisms in the European population, of Krasnoyarsk was obtained. An. association, of the C-590T polymorphic marker of the promoter region of the IL4 gene with psoriatic arthritis was established. The obtained results suggest that the C-590 allele is a contributing factor to heavier course of psoriasis and the development of bone system, pathology. Key words: genes polymorphism, psoriatic arthritis, interleukin
Псориатический артрит (ПА) представляет собой хронический прогрессирующий системный воспалительный процесс костно-суставной системы и развивается, по данным разных авторов, у 30 — 70 % пациентов с псориазом [1, 6, 7]. У одних больных псориаз предшествует развитию артрита, у других артрит и псориаз развиваются одновременно. Какое из этих двух слагаемых является следствием, а какое — причиной, пока однозначно не определено. Патогенетические механизмы псориаза окончательно не выяснены, что делает прогноз и профилактику данного заболевания затруднительной. Важную роль в патогенезе псориаза, как одного из мультифакториальных заболеваний, играет генетическая предрасположенность. Считается, что генетические факторы составляют около 60 — 70 % среди других причин возникновения псориаза, клинического течения заболевания и темпа прогрессирования костнохрящевой деструкции [2, 3].
Основанием для признания роли генетических факторов при ПА послужили статистически достоверное учащение случаев ПА в семьях больных этим заболеванием, а также результаты, полученные близнецовым методом [15]. Однако подавля-
ющее большинство случаев ПА не укладывается в законы менделевской генетики. Вероятно, развитие заболевания вызвано не каким-либо генетическим дефектом, а неблагоприятным сочетанием нормальных полиморфных аллелей различных генов — полиморфизмом. В отличие от мутаций генные полиморфизмы встречаются в популяции исключительно часто и сами по себе не имеют патологической значимости [4]. Нежелательный эффект проявляется лишь при достижении избыточного сочетания «неудачных» аллелей генов и/или действии провоцирующих внешних факторов [8].
Учитывая иммунопатологические изменения при ПА, наиболее перспективным направлением является исследование полиморфных вариантов генов, вовлеченных в формирование иммунного ответа. При псориазе и псориатическом артрите наблюдается дисбаланс продуцируемых ТЫ/^2 клетками интерлейкинов (Щ, которые обеспечивают межклеточные медиаторные контакты, участвуя в запуске иммунопатологических реакций [5]. Установленное гиперактивное состояние Т-хелперной системы иммунитета при псориазе сегодня рассматривается как ключевой момент в каскаде взаимодействий между клетками воспалительного
инфильтрата, кровеносными сосудами и керати-ноцитами, приводящий к развитию клинических проявлений [6]. На современном этапе поиска и изучения генов-маркеров предрасположенности (резистентности), характера течения псориаза, развития псориатического артрита важное место занимает полиморфизм генов цитокинов.
В связи с чем, цель настоящей работы состояла в оценке ассоциации полиморфных маркеров некоторых генов иммунной системы — противовоспалительных цитокинов IL4 (C-590T) и IL10 (C-597A) с развитием псориатического артрита.
материалы и методы
Материалом для исследований послужили образцы ДНК от 79 больных псориазом в среднем возрасте 43 года (42 женщины, 37 мужчин), у 51 больного из общей группы был диагностирован ПА. Все больные обследованы в прогрессирующую стадию течения заболевания. При постановке диагноза «псориаз» использованы классические клинические критерии: наличие феноменов псо-риатической триады («стеаринового пятна», «терминальной пленки», «точечного кровотечения»), возникновение изоморфной реакции Кебнера, периферический рост элементов (яркий венчик эритемы). Контрольную группу составили относительно здоровые доноры (n = 52), сопоставимые по полу и возрасту с больными. Все обследованные являлись европеоидами в трех поколениях, жителями г. Красноярск.
Геномная ДНК выделялась из периферической венозной крови с помощью набора «Silica» (ООО «Лаборатория Медиген», Россия). Участки промоторных регионов генов амплифицировали с использованием пары специфичных праймеров, используя ПЦР. Реакционная смесь, объемом 20 мкл, содержала 0,25 нг ДНК, 0,5 мкМ каждого из праймеров, 0,25 мМ каждого из dNTP, 1—2 е.а. Taq-полимеразы («Сибэнзим», Россия), в стандартном буфере, поставляемом производителем фермента. Затем продукты амплификации подвергались гидролизу специфичной эндонуклеазой рестрикции (табл. 1). Затем фрагменты ДНК визуализировали в ультрафиолетовом свете после электрофоретического разделения в 2% агарозных гелях, окрашенных этидий бромидом.
Обработку результатов генетических исследований осуществляли с использованием критерия
отношения шансов OR с расчетом 95% доверительного интервала (CI). Распределение генотипов по полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди — Вайнберга (РХВ) с помощью критерия х2 и точного теста Фишера.
результаты и обсуждение
Частота распределения генотипов и аллелей исследованных полиморфных локусов IL4 (С-590Т) и IL10 (С-597А), полученная нами у здоровых доноров и больных псориазом жителей г. Красноярск, в целом характерна для европеоидных популяций [4]. Анализ полиморфизма С-590Т промоторного участка гена IL4 показал преобладание частоты гомозиготного варианта СС, частота мутантного варианта ТТ была минимальной в группе здоровых (1,9 %) и более распространена у больных псориазом (7,6 % в общей группе, 10,7 % в группе ПС) (табл. 2). При анализе распределения частот генотипов гена IL10 показано преобладание генотипа СС, генотип АА не встречался у здоровых доноров, тогда как его частота в группе ПС составила 7,2 % (3,8 % в общей группе больных). Тем не менее, различия частот генотипов исследуемых генов цитокинов между группой больных псориазом и здоровыми донорами, жителями г. Красноярск, были статистически недостоверны.
В результате анализа частот генотипов и отдельных аллельных вариантов, нами обнаружена ассоциация полиморфного маркера С-590Т гена IL4, расположенного в промоторной области, с псориатическим артритом (ПА) (р = 0,03) (табл. 2). В группе с артритом частоты генотипов отличались от группы больных без изменений в костно-суставной системе (ПС) в сторону увеличения частоты гомозиготного варианта СС за счет уменьшения частоты генотипов СТ и ТТ. Частота генотипа СС у больных ПА почти вдвое превышает частоту этого варианта у больных ПС за счет того, что частоты СТ и ТТ в группе больных без артропатологии значительно выше, чем в группе ПА. Сравнение частот аллелей показало положительную взаимосвязь аллельного варианта С-590 IL4 с псориатическим артритом — его частота у больных ПА 0,83, у больных без артрита 0,66 (р = 0,01; OR 2,57; CI (1,13-5,88).
Исследование распределения генотипов полиморфного маркера С-597А гена IL10, также расположенного в промоторной зоне, среди больных псориазом и псориатическим артритом, не показа-
Таблица 1
Характеристики исследованных полиморфизмов
Ген Полиморфизм1 Структура праймеров Температура отжига праймеров, °С Фермент рестрикции Продукты гидролиза, п. н. Литература
Аллель «дикого» типа Мутантный аллель
IL4 C-590T 5'cacctaaacttgggagaacatggt3' 5'gttgtaatgcagtcctcctg3' 60 Bme 18I2 194;23 217 10, 11
IL10 3 C-597A 5'atccaagacaacactactaa -3' 5'taaatatcctcaaagttcc -3' 58 Rsa I 42 306; 232; 42 240;232; 66; 42 13
примечание: 1 - первым указан аллель «дикого» типа; 2 - производство «Сибэнзим», Новосибирск; 3 - продукт амплификации состоит из 587 Ьр.
Таблица 2
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов у больных псориазом, псориатическим артритом и здоровых доноров
Ген Полиморфизм Генотип Группы Р
Доноры (1) Псориаз (2) ПА (3) ПС (4)
n % n % n % n %
IL4 C-590T CC 31 59,6 49 62,0 37 72,6 12 42,9 р12 = 0,28 Рз,4 = 0,03 Р1,3 = 0,12 Р1,4 = 0,13
CT 20 38,5 24 30,4 11 21,6 13 46,4
TT 1 1,9 6 7,6 3 5,8 3 10,7
T 22 0,21 36 0,23 17 0,17 19 0,34
IL10 C-597A CC 38 73,1 46 58,2 30 58,8 16 57,1 Р1,2 = 0,12 Р3,4 = 0,51 Р1,3 = 0,22 р14 = 0,08
CA 14 29,9 30 38,0 20 39,2 10 35,7
AA 0 0 3 3,8 1 2,0 2 7,2
A 14 0,13 36 0,23 22 0,22 14 0,25
примечание: п - абсолютное число наблюдаемых генотипов и аллелей; р - уровень значимости, полученный с помощью критерия х2 и точного теста Фишера.
ло статистически достоверной ассоциации с заболеванием. Тем не менее, тенденция к взаимосвязи аллельного варианта существует — частота варианта А-597 IL10 у больных псориазом значительно выше, чем у здоровых доноров (р = 0,06; OR 1,9; CI (0,93-4,03).
При анализе распределения полиморфизмов IL4 (С-590Т) и IL10 (С-597А) в исследуемых группах ПА и ПС раздельно среди мужчин и женщин показаны статистически недостоверные отличия в частотах генотипов и аллельных вариантов указанных генов противовоспалительных цитокинов.
заключение
Полученные нами данные по распределению двух полиморфных маркеров генов противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 среди европеоидного населения г. Красноярск отражают закономерности, характерные для европеоидного населения в целом. Аллели «дикого» типа С-590 IL4 и С-597 IL10 превалируют в группах здоровых доноров и больных псориазом, независимо от тяжести заболевания и проявления косто-суставной патологии. Мутантные генотипы ТТ-590 и АА-597 практически не встречаются в группе здоровых доноров в отличие от группы больных ПА. Популяционный анализ полиморфизма генов лежит в основе исследований генетических факторов предрасположенности к развитию заболеваний, в том числе аутоиммунных, связанных с дисфункцией иммунной системы [4, 8].
Анализ ассоциаций полиморфизма генов-кандидатов с изучаемой болезнью или патологическими признаками позволяет установить их патогенетическую роль и, таким образом, «картировать» заболевание. В настоящее время изучение полиморфных вариантов протеинов цитокиновой сети применяется главным образом для исследования их ассоциаций с патологией. Важность такого изучения может быть обоснована поиском потенциальных маркеров восприимчивости, тяжести
течения, и особенностей клиники заболеваний. Также это зачастую приводит к более глубокому пониманию этиологии и патогенеза заболеваний человека и разработке более эффективной терапии или улучшения существующих методов профилактики заболевания [12].
Полученные в данной работе результаты говорят об ассоциации полиморфизма промоторного региона Д.4 (С-590Т) с псориатическим артритом. Интерлейкин 4 (^-4), цитокин ^2, является главным фактором регуляции пролиферативного ответа В-лимфоцитов и регулирует переключение изотипов иммуноглобулинов в них, индуцируя экспрессию IgG и 1дЕ, его часто называют критическим цитокином воспаления. ^-4 выступает также как фактор роста Т-лимфоцитов и тучных клеток и является ключевым сигналом дифференцировки CD4+ Т-клеток в хелперы типа 2. Известно, что изучаемая нами точечная замена ассоциирована с уровнем продукции ^-4, одного из основных цитокинов, участвующих в развитии иммунного ответа при аутоиммунных заболеваниях. Точечная замена в положении —590 обусловливает повышенную по сравнению с аллельным вариантом С-590 активность промотора, и, как результат этого, увеличенную экспрессию 1Ь-4 и продукцию интерлейкина [9]. Полученные нами данные показывают, что аллельный вариант С-590 Д.4 достоверно чаще встречается среди больных псориатическим артритом по сравнению с больными псориазом без артропатологии. Это предполагает, что носители аллеля С-590 могут иметь повышенный риск развития более тяжелой формы псориаза по сравнению с носителями другого аллеля.
Изучение полиморфизма гена интерлейкина 10 (1Ь-10), располагающегося на первой хромосоме, представляет особенный интерес в связи с тем, этот цитокин играет основную роль в регуляции воспалительного и иммунного ответов, являясь продуктом ^2 клеток. ^-10 ингибирует синтез ряда цитокинов, продуцируемых ТЫ, таких как
IFNg, IL-2, TNFb, а также IL-1, IL-6 и TNFa. Установлено, что присутствие аллельного варианта-592А ассоциировано с уменьшением продукции IL-10 [14]. Результаты проведенной работы показали, что генотип АА-597 не распространен у здоровых доноров, тогда как среди больных псориазом встречается с частотой 3,8 %. Таким образом, существует тенденция к взаимосвязи аллельного варианта А-597 IL10 с ПС. И, при увеличении выборок исследуемых, возможно, ассоциация будет сильнее.
Резюмируя полученные результаты, можно заключить, что полиморфные гены цитокинов являются важными генами-кандидатами такого мультифакториального заболевания, как псориа-тический артрит. Определение генотипа больного, наряду с исследованием уровня экспрессии соответствующего гена, может сформировать суммарный прогностический критерий развития более тяжелой формы заболевания, в результате чего профилактические меры и выбор лечения будут наиболее эффективными для предотвращения инвалидизации населения.
литература
1. Беляев Г.М., Рыжко П.П. Псориаз. Псо-риатическая артропатия: этиология, патогенез, диагностика, лечение, профилактика. — М.: МЕД-пресс-информ, 2005. — 272 с.
2. Галимова Э.С. Молекулярно-генетические основы предрасположенности к псориазу // Г ене-тика. - 2008. - Т. 44, № 5. - С. 594-605.
3. Довжанский С.И. Генетические и иммунные факторы в патогенезе псориаза // Рос. журн. кожных и венерических болезней. - 2006. - № 1. -С. 14-19.
4. Коненков В.И., Смольникова М.В.. Структурные основы и функциональная значимость аллельного полиморфизма генов цитокинов человека и их рецепторов // Мед. иммунология. - 2003. -Т. 5, № 1-2. - С. 11-28.
5. Кундер Е.В. Роль цитокинов в развитии системного и локального воспаления при псори-атическом артрите // Цитокины и воспаление. — 2010. - Т. 9, № 1. - С. 25-28.
6. Лига А.Б., Ухина Т.В., Владимирова Е.В. Некоторые аспекты этиологии и патогенеза псориаза и поиск новых лекарственных соединений для его терапии // Клинич. дерматология и венерология. -2008. - № 6. - С. 15-19.
7. Молочков В.А., Бадокин В.В., Альбанова В.И., Волнухин В.А. Псориаз и псориатический артрит. — М., 2007. — 304 с.
8. Пирузян А.Л. Молекулярная генетика псориаза // Вестн. РАМН. - 2006. - № 3. - С. 33-43.
9. Borish L., Mascali J.J., Klinnert M. SSC polymorphisms in interleukin genes // Hum. Mol. Genet. - 1994. - Vol. 3. - P. 1710.
10. Cantagrel A., Navaux F., Loubet-Lessonlie P. IL-1beta, IL-1 receptor antagonist, IL-4, and IL-10 gene polymorphisms // Arthr Rheum. - 1999. - Vol. 42, N 6. - P. 1093-1100.
11. Choi E., Lee H.J., Yoo T., Chanock S. A common haplotype of interleukin-4 gene IL4 is associated with severe respiratory syncytial virus disease in Korean children // The Journal of Infectious Diseases. -2002. - Vol. 186. - P. 1207-1211.
12. Fresno M., Kopf M., Rivas L. Cytokines and infectious disease // Imm Today. - 1997. - Vol. 18, N 2. - P. 56-58.
13. Mok C.C., Lanchbury J.S., Chan D.W., Lau C.S. IL-10 promoter polymorphism in Southern Chinese patients with SLE // Arthrit Rheumatism. -1998. - Vol. 41, N 6. - P. 1090-1095.
14. Turner D.M., Williams D.M., Sankaran D. An investigation of polymorphism in the IL-10 gene promoter // Eur. J. Immunogenet. - 1997. - Vol. 24, N 1. - P. 1-8.
15. Valdimarsson H. The genetic basis of psoriasis // Clin. Dermatol. - 2007. - Vol. 25, N 6. -P. 563-567.
сведения об авторах
Смольникова Марина Викторовна - ведущий научный сотрудник ФГБУ «НИИ медицинских проблем Севера» СО РАМН, кандидат биологических наук (660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3г; тел. раб.: 89831520137; e-mail: smarinv@ mail.ru)
Смирнова Светлана Витальевна - заместитель директора по научной работе ФГБУ «НИИ медицинских проблем Севера» СО РАМН, доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясе-нецкого (660100, г. Красноярск, ул. Чкалова, д. 41, кв. 117; тел. раб.: 83912280681; e-mail: svetvita@mail.ru)
