CC BY
38
АССОЦИАЦИЯ МЕЖДУ ПОЛИМОРФИЗМОМ I157T ГЕНА СНЕК2 И РИСКОМ ПОГРАНИЧНЫХ СЕРОЗНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЯИЧНИКА У ЖИТЕЛЬНИЦ РОССИИ
А.П. Соколенко1, О.С. Лобейко1, Н.Ю. Крылова1, С.Я. Максимов1, А.Ф. Урманчеева1, Д.Е Мацко1, А.А. Никонов2, Е.Н. Суспицын1,
Е.Ш. Кулигина1, А.Г Иевлева1, Ю.М. Улыбина1, Н.В. Митюшкина1, М.Е. Розанов1, Н.В. Порханова3, Й. Шиманска-Пастернак4, Я. Любински4,
А.В. Того1, Е.Н. Имянитов1
НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, г. С.-Петербург1,
Областной онкологический диспансер, г. С.-Петербург2,
Краевой клинический онкологический диспансер, г. Краснодар3,
Медицинский университет Померании, г. Щецин, Польша4
В исследованиях, выполненных в Польше, было выявлено, что носительство полиморфного аллеля, кодирующего треонин в позиции 157 гена CHEK2, ассоциировано примерно с 3-кратным увеличением риска пограничных опухолей яичника. Настоящая работа предполагала верифицировать данное наблюдение на генетически сходной популяции - жительницах России. Частота вариантного аллеля СНЕК2 составила 9/77 (11,7 %) у пациенток и 35/671 (5,2 %) в контроле (р=0,022; OR = 2,41 (1,03-5,48), что подтвердило выводы польских исследователей об определённой генетической детерминированности этой исключительно редкой патологии яичников.
ASSOCIATION OF CHEK2 I157T POLYMORPHISM WITH THE RISK OF OVARIAN BORDER-LINE CARCINOMAS
IN RUSSIA
A.P. Sokolenko1, O.S. Lobeiko1, N.Yu. Krylova1, S.Ya. Maximov1,
A.F. Urmancheyeva1, D.E. Matsko1, A.A. Nikonov2, E.N. Suspitsin1,
E.Sh. Kuligina1, A.G. Iyevleva1, Yu.M. Ulibina1, N.V Mitiushkina1, M.E. Rozanov1, N.V Porhanova3, J. Szymanska-Pasternak4, J. Lubinski4, A.V. Togo1, E.N. Imyanitov1 N.N. Petrov Institute of Oncology, St.-Petersburg, Russia1,
Oncological Regional Hospital, St.-Petersburg, Russia2,
Oncological Clinical Regional Hospital, Krasnodar, Russia3,
Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland4
A Polish study has recently revealed an association between CHEK2 I157T polymorphism and an approximately 3-fold elevation of the risk of ovarian border-line carcinoma. The present study was aimed to validate this observation in the genetically similar population, i.e. Russian females. The frequency of the variant CHEK2 allele approached to 9/77 (11,7 %) in patients, but only 35/671 (5,2 %) in controls (р=0,022; OR=2,41 (1,03-5,48), that confirmed the role of genetic predisposition in the etiology of this rare ovarian disease.
Ген СНЕК2 (СНК2) кодирует белок, участвующий в поддержании целостности генома. Активация СНЕК2 является одним из центральных компонентов клеточного ответа на двунитевое повреждение ДНК. СНЕК2, обладая киназной активностью, фосфорилирует множество белков-мишеней, в частности р53 и BRCA1. В результате СНЕК2-опосредованных сигнальных каскадов осуществляются такие защитные реакции, как остановка клеточного
цикла, репарация ДНК и апоптоз [1]. Вполне закономерно, что ген CHEK2 попал в поле зрения онкологов практически сразу после его идентификации. Первоначально CHEK2 рассматривался в качестве альтернативного гена-кандидата для наследственного ракового синдрома Ли-Фраумени [2]. В 1999 г. D.W. Bell et al. [2] проанализировали несколько случаев синдрома Ли-Фраумени, характеризовавшихся парадоксальным отсутствием мутаций в гене
р53, и выявили у подобных пациентов инактивированные аллели гена СНЕК2. Однако последующие работы [13], посвящённые изучению р53-негативных вариантов синдрома Ли-Фраумени, не подтвердили результаты D.W. Bell et al. [2].
Тем не менее исследования онкологической значимости СНЕК2 получили активное продолжение в несколько другом контексте. Оказалось, что одна из обнаруженных в 1999 г. мутаций, 1100delC, встречается в некоторых популяциях с весьма заметной частотой - примерно 1 на 100 человек. В 2002 г. P. Vahteristo et al. [15] и H. Meijers-Heijboer et al. [11] представили данные, указывающие на выраженную ассоциацию между носительством инактивированного аллеля 1100delC гена СНЕК2 и повышенным риском рака молочной железы (РМЖ). Примечательно, что аналогичные результаты были получены и у нас в стране: установлено, что у жительниц России около 2 % РМЖ вызвано носительством мутации СНЕК2 1100delC, причём этот показатель увеличивается примерно вдвое при анализе случаев билатерального заболевания, молодых пациенток с РМЖ, а также больных с семейными формами онкологической патологии.
Несколько менее воспроизводимыми являются ассоциации, полученные в отношении другого полиморфизма гена СНЕК2, а именно Т -> C замены нуклеотида 470. Данная вариация приводит к замещению изолейцина треонином в позиции 157, что, по-видимому, может иметь определённые функциональные последствия. Миссенс-полиморфизм I157T встречается в несколько раз чаще, чем инактивирующая мутация 1100delC. Некоторые молекулярно-эпидемиологические исследования показывают, что замена I157T сопряжена с предрасположенностью к целому спектру онкологических заболеваний, однако подобные наблюдения не отличаются полной воспроизводимостью [3, 5, 6, 10].
Наиболее интересные результаты в отношении полиморфизма I157T гена СНЕК2 были получены в отношении пограничных цистаде-ном яичника серозного типа. В исследованиях, выполненных в Польше, было выявлено, что носительство Т-аллеля ассоциировано примерно с 3-кратным увеличением риска данного типа неоплазий [14]. Однако лимитирующим
фактором для верификации подобного феномена является чрезвычайно редкая встречаемость серозных пограничных новообразований яичника: в частности, набор клинического материала по всей Польше позволил привлечь к исследованию лишь 87 пациенток. Учитывая высокую потенциальную значимость результатов, полученных польскими учёными, было принято решение провести аналогичное исследование на жительницах С.-Петербурга. Целесообразность подобного исследования была обоснована следующими соображениями:
1) сходством генетического фона у жителей Польши и России, подтверждённым целым рядом соответствующих исследований [3, 6];
2) возможностью быстрого и эффективного набора критического количества пациенток в клиниках города с 5-миллионным населением;
3) доступностью методов ДНК-анализа архивного биологического материала, позволяющей провести исследование в ретроспективном формате.
Материал и методы
Анализ историй болезни НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова и Областного онкологического диспансера г. С.-Петербурга позволил выявить около 90 случаев пограничных серозных опухолей яичника. Пригодными для ДНК-анализа оказались 77 образцов нормальных тканей, удалённых в процессе операции и хранящихся в патоморфологическом архиве. В качестве контроля к исследованию были привлечены 287 женщин-доноров, 50 здоровых представительниц промежуточной возрастной группы, а также 334 пожилые онкологически здоровые женщины. Возрастные характеристики обследуемых показаны в таблице.
ДНК лейкоцитов периферической крови, полученных от представительниц контрольной группы, выделяли стандартным соль-хлоро-формным методом [12]. ДНК из архивного патоморфологического материала получали посредством методики, изложенной в работе [8].
Анализ полиморфизма I157T проводили методом аллель-специфической ПЦР, используя аллель-специфические олигонуклеотиды 5’- TGT GAT CTT CTA TGT ATG CAA - 3’ и 5’- TGT GAT CTT CTA TGT ATG CAG - 3’ и
Таблица
"а о § S ч о Е Е- 1^ шзм гена СНЕК2 у пациенток и в контрольных группах
Группы Возрастной интервал (годы) Частота вариантного аллеля, n (%)
Больные с пограничными серозными опухолями яичников 22-81 9/77 (11,7)
Женщины-доноры 18-54 18/287 (6,3)
Женщины среднего возраста 55-74 3/50 (6,0)
Пожилые онкологически здоровые женщины 75-94 14/334 (4,2)
Все контрольные группы 18-94 35/671 (5,2 )
общий праймер 5’-ATC TCT GCT ATT CAA AGT CT - 3’.
Результаты и обсуждение
Пример анализа аллельного полиморфизма гена СНЕК2 представлен на рис. 1. Аллель-специфическая ПЦР позволяла надёжно дискриминировать замену одного нуклеотида как в случае применения ПЦР в режиме реального времени, так и при помощи традиционной детекции продукта в геле. Анализ полиморфизма I157T гена СНЕК2 у больных с пограничными серозными опухолями яичников и контрольных женщин выявил достоверное преобладание частот вариантного аллеля в группе пациенток.
При суммарном анализе данных (больные: 9/77 (11,7 %); контроль: 35/671 (5,2 %)) критерий достоверности р=0,022, показатель OR (odds ratio) достиг уровня 2,41 (95 % доверительные интервалы: 1,03-5,48). Частота полиморфного аллеля у пожилых онкологически здоровых женщин была несколько ниже, чем в более молодых контрольных группах, однако это отличие не достигало уровня статистической достоверности.
Изучение онкоассоциированных полиморфизмов является привлекательной областью современной онкологии, однако исследования подобного рода страдают от чрезвычайно плохой воспроизводимости и в определённой мере
Primers: wt mut wt mut
Рис. 1. Детекция полиморфизма 1157Т гена СНЕК2 посредством аллель-специфической ПЦР. Вверху представлены результаты мониторинга процесса накопления ПЦР-продукта в режиме реального времени; снизу - пример традиционного выявления аллель-специфических амплификатов в полиакриламидном геле; слева - гомозигота по «частому» аллелю; справа - гетерозигота, содержащая
вариантный аллель
дискредитировали саму концепцию полигенной онкологической предрасположенности [9]. Научное сообщество активно обсуждает подходы, направленные на увеличение эффективности и достоверности молекулярно-эпидемиологических исследований. Настоящая работа планировалась с учётом проблемы ложно-положительных ассоциаций, поэтому первоначальное наблюдение J. Szymanska-Pastemak et а1. [14] было сознательно подвергнуто верификации на независимой группе пациенток и контролей.
Результаты представленного исследования позволяют с высокой степенью надёжности утверждать о существовании взаимосвязи между носительством вариантного аллеля 1157Т гена СНЕК2 и повышенным риском возникновения пограничных серозных новообразований яичника. Данное наблюдение является первым свидетельством определённой генетической детерминированности этой исключительно редкой патологии. Другой интересной тенденцией является относительный дефицит полиморфного аллеля гена СНЕК2 в группе «онкологической толерантности», т.е. среди тех женщин, которые смогли дожить до преклонного возраста без какого-либо опухолевого заболевания. Хотя различия между пожилыми и средневозрастными женщинами не достигли уровня статистической достоверности, они хорошо согласуются с муль-тиорганной ролью гена СНЕК2 в формировании онкологической предрасположенности [5].
Остаётся открытым вопрос, обладает ли тестирование гена СНЕК2 клинической значимостью? Ответ, безусловно, является утвердительным, если речь идёт об инактивирующей мутации 1100de1C, которая ассоциирована с самым частым онкологическим заболеванием у женщин - раком молочной железы [7]. Напротив, анализ полиморфизма 1157Т пока не может быть рекомендован к рутинному применению в медицинской практике, так как необходимо достоверно изучить его причастность к формированию риска тех разновидностей новооб-
разований, которые занимают ведущие места в структуре онкологической заболеваемости и смертности, в частности карцином молочной железы, лёгкого, желудка, толстой кишки и т.д.
Литература
1. Bartek J., Lukas J. Chkl and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer // Cancer Cell. 2003. Vol. 3. P. 421-429.
2. Bell D.W., Varley JM., Szydlo T.E. et al. Heterozygous germ line hCHK2 mutations in Li-Fraumeni syndrome // Science. 1999. Vol. 286. P. 2528-2531.
3. Bogdanova N., Enssen-Dubrowinskaja N., Feshchenko S. et al. Association of two mutations in the CHEK2 gene with breast cancer // Int. J. Cancer. 2005. Vol. 116. P. 263-266.
4. Buslov K.G., Iyevleva A.G., Chekmariova E.V et al. NBS1 657del5 mutation may contribute only to a limited fraction of breast cancer cases in Russia // Int. J. Cancer. 2005. Vol. 114. P. 585-589.
5. Cybulski C., Gorski B., Huzarski T. et al. CHEK2 is a multiorgan cancer susceptibility gene // Am. J. Hum. Genet. 2004. Vol. 75. P. 1131-1135.
6. Gorski B., Cybulski C., Huzarski T. et al. Breast cancer predisposing alleles in Poland // Breast Cancer Res. Treat. 2005. Vol. 92. P. 19-24.
7. Imyanitov E.N., Hanson K.P. Mechanisms of breast cancer // Drug Discov. Today: Dis. Mech. 2004. Vol. 1. P. 235-245.
8. Imyanitov E.N., Suspitsin E.N., Buslov K.G. et al. Isolation of nucleic acids from paraffin-embedded archival tissues and other difficult sources // Kieleczawa J (Ed.). The DNABook: Protocols and Procedures for the Modern Molecular Biology Laboratory. Jones and Bartlett Publishers. 2006. P. 85-97.
9. Imyanitov E.N., Togo A.V., Hanson K.P. Searching for cancer-associated gene polymorphisms: promises and obstacles // Cancer Lett. 2004. Vol. 204. P. 3-14.
10. Kilpivaara O., Vahteristo P., Falck J. et al. CHEK2 variant I157T may be associated with increased breast cancer risk // Int. J. Cancer. 2004. Vol. 111. P. 543-547.
11. Meijers-HeijboerH., van den OuwelandA., Klij'n J. et al. Low-penetrance susceptibility to breast cancer due to CHEK2(*)1100delC in noncarriers of BRCA1 or BRCA2 mutations // Nat. Genet. 2002. Vol. 31. P. 55-59.
12. Mullenbach R., Lagoda P.J., Welter C. An efficient salt-chlo-roform extraction of DNA from blood and tissues // Trends Genet. 1989. Vol. 5. P. 391.
13. Sodha N., Houlston R.S., Bullock S. et al. Increasing evidence that germline mutations in CHEK2 do not cause Li-Fraumeni syndrome // Hum. Mutat. 2002. Vol. 20. P. 460-462.
14. Szymanska-Pasternak J., Szymanska A., Cybulski C. et al. Mutations of the CHEK2 gene in patients with borderline cystadenomas of the ovary // Proc. of the Conference «Hereditary cancers - prophylactics, diagnosis, treatment», Szczecin, December 8-9, 2005. P. 38.
15. Vahteristo P., Bartkova J., Eerola H. et al. A CHEK2 genetic variant contributing to a substantial fraction of familial breast cancer // Am. J. Hum. Genet. 2002. Vol. 71. P. 432-488.
Поступила 24.03.06
