CC BY
112УДК 575.117.5 575.113.2
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ TP53, ATM, NBS1, CHEK2 ПРИ РАННИХ ФОРМАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ПАЦИЕНТОК
ИЗ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
В.Н. КИПЕНЬ1, С.Б. МЕЛЬНОВ1, Р.М. СМОЛЯКОВА2
1 Международный государственный экологический университет им. А.Д. Сахарова,
г. Минск, Республика Беларусь 2ГУ «Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова», г. Минск, Республика Беларусь
Введение. На данный момент общепризнанным является факт, что наследственные мутации являются причиной не более 10% случаев рака молочной железы (РМЖ) [1]. В настоящий момент принято разделять гены по отношению частоты встречаемости (T,%) предрасполагающего к возникновению данной онкопатологии аллеля и величины относительно риска (relative risk - RR) ее возникновения и развития на следующие группы [2]:
• высокопенетрантные гены (RR>8, T<0,1%) - BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN;
• среднепенентрантные гены (RR>3, T=0,1-10%) - CHEK2, ATM, BRIP, PABL2, BARD1, XRCC1;
• низкопенентрантные гены (RR<2, T>20%) - NBS1, LSP1, CASP8, TNRC9, MAPK3K1, FGFR2 и др.
В последнее время все большее внимание уделяется наследственным синдромам и частоте возникновения на их фоне РМЖ.
Наследственные опухолевые синдромы составляют незначительную пропорцию от общего числа новообразований, хотя для отдельных локализаций (молочная железа, яичник, толстый кишечник) их удельный вклад достигает значительно более высоких показателей [3,4]. Причиной подобных заболеваний является носительство наследуемой «раковой» мутации. Лица, имеющие такое генетическое повреждение, до определенного момента остаются практически здоровыми, однако они обладают фатально увеличенным риском возникновения неоплазм - пенетрантность соответствующих мутаций обычно составляет 85-100%.
К числу таких заболеваний относятся рак молочной железы и/или яичников (РМЖ/РЯ), прогрессирующие при синдроме Ли-Фраумени. Предметом исследования в этих случаях являются онкогены и гены-супрессоры злокачественной трансформации клеток, такие как BRCA1 и BRCA2, а также, ТР53, СНЕК2, ATM, NBS1 и др., консервативно наследуемые дефекты в которых приводят к парадоксально высокому риску развития рака, достигающему нередко 60-95% [5]. Несмотря на тот факт, что суммарный вклад средне- и низкопенентрантных генов может превышать роль вы-сокопенентрантных генов в возникновении онкопатологии, их значение в генезе РМЖ изучено крайне недостаточно.
Терминальные мутации в гене TP53 приводят к развитию синдрома Ли-Фраумени (ЛФС), который сопровождается возникновением мультиорганных неоплазий (OMIM 151623): сарком мягких тканей, остеосарком, рака молочной железы, опухолей головного мозга, рака коры надпочечников, лейкемий или рака легких - в пременопаузальном возрасте [6]. Также в настоящее время общепризнанно, что ген СНЕК2 является молекулярным базисом формирования ЛФС второго типа (OMIM 609265) или, как его еще иначе называют, ЛФС-подобного синдрома (ЛФПС) [7-9]. Его отличительной чертой от ЛФС является ранняя прогрессия онкологического заболевания (до 30 лет) и более тяжелая клиническая картина. Ассоциация гена NBS1 (мутации в данном гене приводят к развитию тяжелой формы иммунодефицита - синдрома Ниймегена (OMIM 251260), - с развитием РМЖ показана только для мутации 657del5, а вовлеченность ряда полиморфизмов и мутаций в гене ATM (мутации в данном гене приводят к развитию наследственного заболевания с мозжечковой атаксией, телеангиэктазиями, нарушением иммунитета и склонностью к злокачественным новообразованиям - атаксии-телеангиэктазии, OMIM 208900) в молекулярный патогенез наследственных форм РМЖ до сих пор остается до конца невыясненной [10,11].
Таким образом, нами была предпринята попытка определить частоту встречаемости основных патогенетически значимых мутаций в основных генах (кроме BRCA1 и BRCA2), вовлеченных в генез РМЖ - TP53, CHEK2, ATM, NBS1.
Методика и объекты исследования.
Клинический материал. В исследование были включены 165 пациентов с монолатеральным РМЖ. Группа билатерального РМЖ составила: 2 случая синхронного билатерального РМЖ (временной критерий синхронности билатерального рака молочной железы составил не более 12 месяцев [12]) и 7 случаев метахронного билатерального РМЖ. Средний возраст пациентов с монолатеральным РМЖ на момент возникновения опухоли составил 41,7±5,8 лет (возрастной интервал -
24-49 лет), пациентов с билатеральными формами РМЖ - 39,8±5,0 лет (возрастной интервал - 3348 лет).
В группу сравнения вошли 123 условно здоровых пациента без онкологической патологии в анамнезе на момент забора крови, средний возраст составил 39,6±5,1 лет (возрастной интервал -
25-52 года). Группа сравнения соответствует по возрасту и этническому составу выборке больных РМЖ.
Все участники исследования дали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований.
Выделение ДНК. Все образцы ДНК были выделены из лейкоцитов периферической крови с помощью наборов «ДНК-экспресс кровь» НПФ Литех (РФ), а также с помощью метода водно-карбинольной экстракции по протоколу Helene C. Johanson с модицикаями [13].
Детекция мутаций. Анализ мутаций p.R273C, p.R175H в гене TP53, а также мутаций g.1100delC и g.IVS2+1G>A в гене CHEK2 проводили с помощью аллель-специфической полиме-разной цепной реакции (ПЦР) на приборе PeqLab Primus 96 Advanced (Германия). С помощью метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) были определены мутации p.R282W, p.R337H, p.R248W в гене TP53 и мутации p.C49S в гене ATM. Анализ мутации g.657del5 в гене NBS1 выполнен с помощью стандартной двухпраймерной ПЦР. Последовательности олиго-нуклеотидов и характеристики ПЦР-продуктов и рестриктов (с указанием температуры отжига и используемых рестриктаз фирмы NEB) представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Последовательности олигонуклеотидов, используемых в ПЦР
Ген/ мутация Последовательность олигонуклеотидов, 5'>3' Ta, оС Метод Размер ампликона/ рестриктов (п.о.)
TP53 p.R273C (rs121913343) R-com.1 5'-CTCGCTTAGTGCTCCCTG-3' F-mut.2 5'-CGGAACAGCTTTGAGGTGT- 3' F-wt3 5'-CGGAACAGCTTTGAGGTGC-3' 56 АС-ПЦР4 121
TP53 p.R248W (rs121912651) R-com. 5'-TGTGCAGGGTGGCAAGTG-3' F-mut. 5'-GCATGGGCGGCATGAACT-3' F-wt 5'-GCATGGGCGGCATGAACC-3' 59 АС-ПЦР 85
TP53 p.R175H (rs28934578) R-com. 5'-CCTGTGCAGCTGTGGGTT-3' F-mut. 5'- GCTCATGGTGGGGGCAGT -3' F-wt 5'-GCTCATGGTGGGGGCAGC-3' 59 АС-ПЦР 118
TP53 p.R282W (rs28934574) F 5-TGCTGCCGTCAACTAGAACA-3' R 5-GGGTGGTTGGGAGTAGATGG-3' 56 ПДРФ5 (HpaI) CС (127,159) CT (127,159,286) TT (286)
TP53 p.R337H (rs121912664) F 5-CCCAATGAGATGGGGTCAGC-3' R 5'-GCATGTTGCTTTTGTACCGTC-3' 56 ПДРФ (HhaI) GG (123,209) AG (123,209,332) AA (332)
ATM p.C49S (rs1800054) F 5-TGCTGCCGTCAACTAGAACA-3' R 5-ATGCCAAATTCATATGCAAGGC-3' 56 ПДРФ (Hinfl) CC (43,149,182) CG (43,149,182,225) GG (149,225)
Окончание таблицы 1
В.657ае15 Б 5'-TGATCTGTCAGGACGGCA-3' Я 5 '-CATAATTACCTGTTTGGCATTCA-3' 55 ПЦР 82/77 (для делеции)
СНЕК2 g.1100de1C Я-сот. 5'-CTGATCTAGCCTACGTGTCT-3' Б-ти! 5'-CTTGGAGTGCCCAAAATCAT-3' 5 '-TTGGAGTGCCCAAA ATCAGT- 3' 55 АС-ПЦР 120
СНЕК2 g.IVS2+1G>A Я-сот. 5'-CAGACTTTGAATAGCAGAGA-3' Б-т^. 5'-ACACTTTCGGATTTTCAGGA- 3' 5'-ACACTTTCGGATTTTCAGGG-3' 52 АС-ПЦР 114
1 - общий реверс-праймер
2 - форвард-праймер для мутантного типа аллеля
3 - форвард-праймер для дикого типа аллеля
4 - АС-ПЦР - метод аллель-специфической ПЦР
5 - ПДРФ - метод полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (приведена эндонуклеаза рестрикции)
Разделение аллелей осуществляли в 10% неденатурирующем полиакриалмидном геле (ПААГ) с последующей окраской бромистым этидием (рисунок 1).
м
400 п о. 300 гго,
150 (1,о, 100 плг
ТР53 К273С: лунки 1 (\\ч+сот,)н 2 (тис.+сош.)-ооразец Кй1 (мугацня), 3 С^+сош.) и 4 (шш.^сош.) -оораэец №2 (мутацня)т М — молекулярный маркер {50 п. о.)
СНЕК2 ПООсЫС: 1 (ти+сош.)н 2 (тш -сош.)-ооразец ЭД] (нег мутации); 3 <то1+сот.) и 4 (шш.+сот.) — образец № 2 (деления); М — молекулярный маркер (50 п о.)
М 1 2 3 4
200 пл. ' тт>
ииии
ТР53 \У: 1 - СТ; 2 - СС; 3 - СС; 4 - СС; М - молекулярный маркер (50 п о.)
ТР53 К337Н: 1 - СО; 2 - ОО; 3 - АО;
4 - СС: 5 - СО
М 1
150 и.о.
100 ц.о.
N1151 657сЫ5: 1г2 н 3 — нет мутацнн; 4 — делецня 5 п.о.; М - молекулярный маркер {50 п а,)
Рисунок 1 - Результаты ПААГ-электрофореза для исследуемых мутаций (в случае их обнаружения)
Результаты и их обсуждение. Результаты проведенного молекулярно-генетического тестирования суммированы в таблице 2.
Таблица 2 - Результаты генотипирования по девяти исследуемым мутациям
Ген/ мутация Гаплотип/ аллель Кол-во пациентов, абс. частота (относительная частота)
Основная группа Группа сравнения
TP53 p.R273C (rs121913343) СС 171/174 (98,28%) 123/123 (100%)
CT 3/174 (1,72%) -
TT - -
Allele C 99,14% 100%
Allele T 0,86% -
TP53 p.R248W (rs121912651) СС 174/174 (100%) 123/123 (100%)
CT - -
TT - -
Allele C 100% 100%
Allele T - -
TP53 p.R175H (rs28934578) AA - -
AG - -
GG 174/174 (100%) 123/123 (100%)
Allele A - -
Allele G 100% 100%
TP53 p.R282W (rs28934574) CC 173/174 (99,43%) 123/123 (100%)
CT 1/174 (0,57%) -
TT - -
Allele C 99,71% 100%
Allele T 0,29% -
TP53 p.R337H (rs121912664) GG 173/174 (99,43%) 123/123 (100%)
AG 1/174 (0,57%) -
AA - -
Allele A 0,29% -
Allele G 99,71% 100%
ATM p.C49S (rs1800054) CC 174/174 (100%) 123/123 (100%)
CG - -
GG - -
Allele C 100% 100%
Allele G - -
NBS1 g.657del5 del+/del+ - -
del+/del- - 1/123 (0,81%)
del-/del- 174/174 (100%) 122/123 (99,19%)
del+ - 0,41%
del- 100% 99,59%
CHEK2 g.1100delC del+/del+ - -
del+/del- 1/174 (0,57%) -
del-/del- 173/174 (99,43%) 123/123 (100%)
del+ 0,29% -
del- 99,71% 100%
CHEK2 g.IVS2+1G>A AA - -
AG - -
GG 174/174 (100%) 123/123 (100%)
Allele A - -
Allele G 100% 100%
ТР53 - ген белка р53. В выборке пациентов с РМЖ мутация R273C была обнаружена с частотой 1,72% (3/174), мутации R282W и R337H - в 0,57% случаев каждая (1/174 и 1/174 соответственно), мутации R248W и R175H обнаружены не были. В группе сравнения не было найдено ни одной мутации в гене ТР53.
Возраст манифестации заболевания у пациенток с мутацией R273C — 48, 49 и 37 лет. Все три женщины белорусской этнической принадлежности. В семейном анамнезе одной из носительниц отмечается случай заболевания раком желудка (первая степень родства). Возраст манифестации РМЖ у пациентки с мутацией R282W — 35 лет, с мутацией R337H — 37 лет. В нашем исследовании был выявлен случай двойного носительства терминальных мутаций в гене ТР53 — мутации R337H и R273C были обнаружены у пациентки с фибросаркомой правой молочной железы (возраст манифестации — 37 лет, эстрогеновый и прогестероновый статус опухоли отрицательный, HER— 2/new 0).
ATM - ген атаксии телеангиэктазии. В нашей выборке больных РМЖ, а также среди пациентов из группы сравнения, мутация C49S в гене ATM выявлена не была.
NBS1 - ген нибрина. В выборке больных раком молочной железы мутация 657del5 в гене NBS1 обнаружена не была, в группе сравнения был выявлен один случай мутации — 0,81% (1/123). Возраст пациентки из группы сравнения с делецией 657del5 в гене NBS1 составляет 39 лет (в этом же возрасте проведена операция по удалению кисты в правой молочной железе). У носительницы данной мутации случаев заболевания РМЖ/РЯ в семье не отмечается.
CHEK2 - ген киназы сверочных точек 2. Скрининг мутаций 1100delC, IVS2+1G>A в гене CHEK2 у больных раком молочной железы выявил одну (0,57% - 1/174) носительницу герминаль-ной мутации - 1100delC (возраст манифестации РМЖ — 37 лет, в семейном анамнезе случаев заболевания РМЖ/РЯ не отмечается). Мутация IVS2+1G>A в основной группе (пациенты с РМЖ) выявлена не была. В группе сравнения мутаций 1100delC и IVS2+1G>A в гене CHEK2 обнаружено не было.
В нашей выборке больных РМЖ была выделена группа из 59 женщин (включая пациентов с билатеральными формами РМЖ) с отягощенным семейным анамнезом (наличие онкопатологии, относящейся к спектру опухолей при синдромах ЛФС и ЛФПС, у родственников первой и второй степеней родства) и/или возрастом манифестации до 40 лет. Спектр и доля выявленных мутаций у пациенток с отягощенным семейным анамнезом и у женщин со спорадическими случаями заболевания представлены на рис.2.
Рисунок 2 - Спектр и доля мутаций генов TP53 и CHEK2 у больных A) со спорадическими случаями заболевания (n=115); B) у больных с отягощенным семейным анамнезом и/или ранним
сроком манифестации (n=59)
Выводы. Таким образом, среди пациентов с РМЖ нами были выявлены мутации в 2,87% случаев (5/174), из них на мутации в гене TP53 приходится более 80%. Вклад других генов (ATM,
А
В
___ 3,39%
NBS1 и CHEK2) представляется менее существенным. Однако при дифференциальном подходе к анализу частоты встречаемости мутаций в исследуемых генах, а именно при выделении группы пациентов с отягощенным семейным анамнезом (наличие онкопатологии, относящейся к спектру опухолей при синдромах ЛФС и ЛФПС, у родственников первой и второй степеней родства) и/или возрастом манифестации до 40 лет, частота встречаемости мутаций возрастает до 8,5% (основной вклад — мутаций в гене ТР53 (около 80%), на CHEK2 приходятся остальные случаи).
ЛИТЕРАТУРА
1. Имятников, Е.Н. Наследственный рак молочной железы / Е.Н. Имятников // Практическая онкология — Т.11 — №4 — 2010 — C.258—266;
2. Garcia—Closas, M. Genetic susceptibility loci for breast cancer by estrogen receptor status / M. Garcia—Closas, S. Chanock // Clin Cancer Res. — 2008 — Vol. 14 — №2 — P.8000—8009;
3. Phuong, L. Mai Li—Fraumeni syndrome: report of a clinical research workshop and creation of a research consortium // L. Mai Phuong [et al.] // Cancer Genet. — 2012 — 205(10):479—487;
4. Kory, W. Jasperson Hereditary and Familial Colon Cancer / Kory W. Jasperson [et al.] // Gastroenterology — 2010 — 138(6):2044—2058;
5. Petra van der Groep Pathology of hereditary breast cancer / Petra van der Groep, Elsken van der Wall, Paul J. van Diest // Cell Oncol (Dordr) — 2011 — 34(2):71—88;
6. Chompret, A. The Li—Fraumeni syndrome. / A. Chompret // Biochimie — 2002 — P.75—82;
7. Bell, D.W. Heterozygous germ line hCHK2 mutations in Li—Fraumeni syndrome / D.W. Bell [et al.] // Science — 1999 — P.2528—2531;
8. Sodha, N. Increasing evidence that germline mutations in CHEK2 do not cause Li—Fraumeni syndrome / N. Sodha [et al.] // Hum. Mutat. — 2002 — P.460—462;
9. Meijers—Heijboer, H. Low— penetrance susceptibility to breast cancer due to CHEK2(*)1100delC in noncarriers of BRCA1 or BRCA2 mutations / H. Meijers—Heijboer [et al.] // Nat. Genet. — 2002. — P.55—59;
10. Zhang, Z.H. Current evidence on the relationship between two polymorphisms in the NBS1 gene and breast cancer risk: a meta—analysis / Z.H. Zhang [et al.] // Asian Pac J Cancer Prev. — 2012 — 13(11):5375—9;
11. Ahmed, M. ATM and breast cancer susceptibility / M. Ahmed, N. Rahman // Oncogene — 2006 — 25,5906— 5911;
12. Kheirelseid, E.A. Bilateral breast cancer: analysis of incidence, outcome, survival and disease characteristics / E.A. Kheirelseid [et al.] // Breast Cancer Res. Treat. — 2010 — 126(1):131—40;
13. Johanson, H.C. DNA elution from buccal cells stored on Whatman FTA Classic Cards using a modifed methanol fxation method / Helene C. Johanson [et al.] // BioTechniques — 2009 — 46:309—311.
FREQUENCY OF MUTATIONS IN TP53, ATM,, NBS1, CHEK2 GENES IN EARLY BREAST CANCER PATIENTS FROM BELARUS
V.N. KIPEN, S.B. MELNOV, R.M. SMOLYAKOVA Summary
The study presents the results of molecular genetic testing for mutations in TP53, ATM, NBS1, CHEK2 genes among patients with breast cancer from Belarus. The frequencies of mutations p.R273C, p.R248W, p.R175H, p.R282W, p.R337H in TP53 gene; p.C49S in ATM gene; g.657del5 in NBS1 gene; g.1100delC and g.IVS +1G>A in CHEK2 gene in the main group and the comparison group. Among patients with breast cancer have been identified mutations in 2.87% of cases (5/174), of which mutations in the TP53 gene accounts for more than 80%. The contribution of other genes (ATM, NBS1 and CHEK2) seems less important. However, the differential approach to the analysis of the incidence of mutations in the genes studied, namely the allocation of the group of patients with a family history, frequency of mutations is increased to 8.5% (the main contribution - mutations in the TP53 gene (about 80%) fall in the CHEK2 the remaining cases).
© Кипень В.Н., Мельнов С.Б., Смолякова Р.М.
Поступила в редакцию 22 сентября 2015г.
