CC BY
10
АССОЦИАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ОСНОВНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ РАЗВИТИЯ РАКА ЖЕЛУДКА С ЕГО
МЕТАСТАЗИРОВАНИЕМ
Ф.М. Кипкеева1, Т.А. Музаффарова1, М.П. Никулин2, П.В. Апанович1, С.Н. Неред2, М.Н. Нариманов2, О.А. Малихова2, Т.А. Богуш2, И.С. Стилиди2, А.В. Карпухин1
1ФГБНУ«Медико-генетический научный центр»; Россия, 115478 Москва, ул. Москворечье, 1; 2ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Фатима Магомедовна Кипкеева [email protected]
Цель исследования - выявление генов, экспрессия которых ассоциирована с метастазированием опухоли рака желудка (РЖ). Материалы и методы. Использовали метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени на парных образцах опухоль - норма.
Результаты. Показана ассоциация с метастазированием экспрессии генов VEGFR1, FGFR2 и NRP-1. Значение отношения шансов (ОШ) оказалось наибольшим для гена FGFR2: ОШ 175,00; 95 % доверительный интервал (ДИ) 8,972—3413,271; для гена VEGFR1 - ОШ 4,622; 95 % ДИ 1,240-17,227, для NRP1 - ОШ2,667; 95 % ДИ 0,597-11,915. При оценке совместно повышенной экспрессии генов VEGFR1 и NRP1 - ОШ 5,778; 95 % ДИ 1,393-23,909; р = 0,0147. Частота повышенной экспрессии FGFR2 составила 5 % при диссеминированном РЖ, в то время как при локализованном РЖ она достигает 53 %. Заключение. Разрабатываемый таргетный препарат против FGFR2, скорее всего, при диссеминированном РЖ будет иметь ограниченную 5-10 % частоту эффективного действия. Его применение на ранних стадиях РЖ может способствовать предотвращению перехода опухоли в метастатическую стадию. Возможное взаимодействие VEGFR1 и NRP1 будет приводить к небольшому вкладу в метастазирование РЖ по сравнению с влиянием экспрессии только VEGFR1.
Ключевые слова: рак желудка, метастазирование, экспрессия генов
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-4-106-110
ASSOCIATION OF GASTRIC CANCER MAIN SIGNALING PATHWAY GENE EXPRESSION WITH METASTASIS
F.M. Kipkeeva1, T.A. Muzaffarova1, M.P. Nikulin2, P.V. Apanovich1, S.N. Nered2, M.N. Narimanov2, O.A. Malikhova 2, T.A. Bogush2, I.S. Stilidi2, A. V. Karpukhin1
1Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorechie St., Moscow 115478, Russia;
2 N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe shosse,
Moscow 115478, Russia
Objective of the study. Identification of genes, the expression of which is associated with the metastasis of gastric cancer tumor. Materials and methods. Quantitative real-time PCR on paired tumor - normal samples.
Results. An association with the metastasis of the VEGFR1, FGFR2 and NRP-1 gene expression is shown. The odds ratio (OR) was the highest for the FGFR2gene: OR 175.00; 95% CI8.972-3413.271; for the VEGFR1 gene, OR 4.622, 95 % CI 1.240-17.227, for NRP1 - OR 2.667; 95 % CI 0.597-11.915. When assessing the jointly elevated expression of VEGFR1 and NRP1 genes, OR 5,778; 95 % CI 1.393-23.909; p = 0.0147. The frequency of increased expression of FGFR2 was 5 % in case of metastasis, while in the case of localized GC it reached 53 %.
Conclusion. The target drug against FGFR2, which is being developed, is likely to have a limited 5-10 % frequency of effective action in metastatic GC. Its use in the early stages of GC can help prevent the transition of the tumor to the metastatic stage. The possible interaction of VEGFR1 and NRP1 will result in a small contribution to the metastasis of GC as compared to the effect of VEGFR1-only expression.
Key words: gastric cancer, metastasis, gene expression
Введение
Рак желудка (РЖ) относится к наиболее распространенным типам онкологических заболеваний, занимает 4-е место в мире по частоте случаев и характеризуется плохой выживаемостью [1].
Одной из причин высокой смертности больных РЖ является частый переход болезни в метастатическую стадию. В связи с этим весьма актуальным является выявление генов, ассоциированных с метастазированием опухоли. Знание таких генов и особенностей
их функционирования при переходе к диссеминиро-ванному состоянию позволит персонифицировать терапию и, следовательно, повысить ее эффективность. При этом могут открываться перспективы терапии не только метастатического РЖ, но и более ранних его стадий для предотвращения образования метастазов. Кроме того, такие гены могут быть источником биомаркеров, сигнализирующих о повышенном риске метастазирования опухоли.
В терапии разных типов рака в настоящее время активно используются таргетные препараты, воздействующие на конкретные гены-мишени. При РЖ используют таргетные препараты трастузумаб — мо-ноклональное антитело против HER2 — и рамуци-румаб, ингибирующий тирозинкиназный рецептор VEGFR2. Кроме того, разрабатываются средства терапии, направленные на другие гены-мишени, относящиеся к основным путям развития РЖ — PI3K-AKT-mTOR и RAS-RAF-MEK. В качестве мишеней при этом чаще всего рассматриваются ростовые факторы и их рецепторы. К таковым относятся эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста (TGF-ß), нейропилин1 (NRP1) [2, 3]. Последний из указанных способен связываться с разными лигандами (TGF-ß, FGF) и рецепторами VEGF (VEGFR1 и VEGFR2), модулируя их активность [4].
Цель исследования — выявление генов, экспрессия которых ассоциирована с метастазированием опухоли при диссеминированном раке желудка (ДРЖ) и РЖ на более ранних стадиях.
Материалы и методы
От каждого больного, включенного в исследование, были взяты парные образцы нормальной и опухолевой тканей желудка. Забор материала проводился при биопсии (во время фиброгастроскопии) или во время операции пациентов, проходивших лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Были исследованы парные образцы (опухоль — норма) ткани желудка 30 больных ДРЖ в возрасте 29—87 лет и 25 больных с РЖ без отдаленных метастазов (I—III стадии) в возрасте 39—80 лет. Все образцы охарактеризованы гистологически. Основное их число представлено аденокарциномой.
Методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль — норма изучали уровни экспрессии мРНК генов VEGF, VEGFR1, VEGFR2, NRP1, bFGF, FGFR2, TGF-ß, HER2/neu.
Из каждой пары образцов выделяли суммарную фракцию РНК. Для выделения РНК использовали набор RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США). Обратную транскрипцию проводили, используя набор ImProm-П™
Reverse Transcriptase (Promega, США). ПЦР-РВ осуществляли на приборе Step One Plus фирмы Applied Biosystems (США). Каждое измерение проводили трехкратно. ПЦР-РВ проводили с использованием наборов TaqMan®Gene Expression Assays в соответствии с инструкцией изготовителя.
Использованные наборы:
HER 2 — TagMan Gene Expression Assay Hs 01001580_m1.
VEGFA — TagMan Gene Expression Assay Hs 00900055_m1.
NRP1 — TagMan Gene Expression Assay Hs00826128_m1.
bFGF / FGF2 — TagMan Gene Expression Assay Hs00266645_m1.
TGF b — TagMan Gene Expression Assay Hs00998133_m1.
FGFR2 — TagMan Gene Expression Assay Hs01552918_m1.
VEGFR1 / FLT1 — TagMan Gene Expression Assay Hs01052961_m1.
VEGFR2 / KDR — TagMan Gene Expression Assay Hs00911700_m1.
GAPDH — TagMan Gene Expression Assay Hs02786624_g1.
Для анализа полученных результатов использовали встроенную программу Applied Biosystems Step One Plus. В качестве контрольного использовали ген GAPDH. В результате обработки измерений получены значения уровней экспрессии генов в опухолевой ткани относительно нормальной. Пороговый уровень экспрессии гена в опухоли определяли с помощью ROC-анализа. Для гена VEGFR1 он составил >0,5, для генов FGFR2 и NRP1: 0 и >0,97 соответственно.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета стандартных программ Statis-tica 10 и программы MedCalc. Были применены методы — точный критерий Фишера и ROC-анализ. Уровень значимости для выявленных различий принимали приp <0,05.
Результаты и обсуждение
Были исследованы особенности экспрессии ряда генов — в образцах РЖ на ранних этапах развития (до диссеминированного состояния) и ДРЖ. На рисунке представлены результаты определения уровней экспрессии на ранних стадиях развития РЖ относительно нормальной ткани того же органа и при дис-семинированном состоянии.
Частота повышенной относительно нормы экспрессии исследованных генов при ДРЖ в ряде случаев имеет тенденцию к повышению (гены VEGFR1, VEGFR2 и NRP1) или снижению (ген FGFR2) по отношению к более ранним стадиям развития РЖ (см. рисунок).
80
80
б
а
70
HER2 bFGF FGFR2 NRP1 TGFbl VEGF VEGFR1 VEGFR2
70
^ 60
о*
го
о 50
и го
HER2 bFGF FGFR2 NRP1 TGFbl VEGF VEGFR1 VEGFR2
Частоты повышенных относительно нормы уровней экспрессии генов на ранних стадиях (до диссеминированного состояния) развития РЖ (а) и при ДРЖ (б)
Для этих генов (FGFR2, VEGFR1, VEGFR2 и NRP1) найдены статистически значимые различия в частотах повышенной экспрессии (р = 0,0001—0,04, точный критерий Фишера). Частота повышенной экспрессии генов VEGFR1, VEGFR2 при ДРЖ возросла примерно в 2 раза. Эти гены были выбраны для более детального изучения различий в экспрессии при ДРЖ и местно-распространенном РЖ.
Был применен ROC-анализ. Результаты определения связи уровней экспрессии изучаемых генов с диссеминацией опухоли РЖ приведены в таблице.
Результаты определения связи уровней экспрессии генов с метас-тазированием опухоли РЖ
Ген отдаленные метастазы, значения р при ДРЖ и РЖ без отдаленных метастазов (1-Ш стадии)
ROC-анализ Точный критерий Фишера
VEGFR1 0,0001 0,0009
FGFR2 0,0029 0,0074
NRP1 0,0159 0,0168
VEGFR2 0,405 -
Экспрессия 3 генов - VEGFR1, FGFR2 и NRP1 -связана с метастазированием опухоли РЖ (см. таблицу). Такая связь остается значимой и при применении поправки FDR на множественность сравнений. Экспрессия гена VEGFR2 не ассоциирована с ДРЖ.
Дополнительно ассоциация 3 указанных генов с ДРЖ была проверена с помощью точного критерия Фишера с использованием пороговых значений экспрессии, определенных при ROC-анализе.
Полученные данные свидетельствуют о схожести результатов, полученных двумя статистическими методами.
Значение отношения шансов (ОШ) оказалось наибольшим для гена FGFR2: ОШ 175,00; 95 % доверительный интервал (ДИ) 8,972—3413,271, что говорит о максимальном среди 3 изученных генов различии между ДРЖ и РЖ на более ранних стадиях. Для гена VEGFR1 ОШ 4,622; 95 % ДИ 1,240-17,227. Наихудший среди 3 генов результат получен для гена NRP1: ОШ 2,667; 95 % ДИ 0,597-11,915. Значение нижней границы 95 % ДИ <1 для значения ОШ ставит под сомнение пригодность использования экспрессии этого гена в качестве маркера метастазирования.
Ген FGFR2 (2-й рецептор фактора роста фиброб-ластов) связан с пролиферацией опухолевых клеток и неблагоприятным прогнозом развития РЖ [5]. Пациенты с повышенной экспрессией FGFR2 в аде-нокарциноме желудка имеют более низкую выживаемость. Этот ген рассматривается в качестве таргетной мишени. На модели ксенотрансплантата РЖ с амплификацией FGFR2 ингибирование этого рецептора дает существенный эффект [6]. Препараты, разработанные против FGFR2, в настоящее время проходят клинические испытания ^СТ02318329).
В нашей работе частота повышенной экспрессии FGFR2 составила 5 % при ДРЖ, в то время как при локализованном РЖ она достигает 53 %. Такое значение практически совпадает с определенной имму-ногистохимическим методом частотой повышенной экспрессии FGFR2 при РЖ — 51 % [7]. При этом полученная нами частота повышенной экспрессии FGFR2 при ДРЖ близка к частоте его амплификации среди больных ДРЖ, в том числе подвергавшихся системной терапии [8].
Как следует из полученных результатов, разрабатываемый таргетный препарат против FGFR2, скорее всего, при ДРЖ будет иметь ограниченную 5—10 % частоту эффективного действия. В то же время при локализованном РЖ такой препарат может быть
эффективным примерно в половине случаев. С учетом связи повышенной экспрессии FGFR2 с прогрессией опухоли [7] и найденной нами связи с метастазированием его применение на ранних стадиях РЖ может способствовать предотвращению перехода опухоли в метастатическую стадию.
Ген VEGFR1 является одним из ключевых факторов, регулирующих ангиогенез. Значение уровня его экспрессии для развития метастазов было продемонстрировано для некоторых типов рака. Так, повышенный уровень экспрессии гена VEGFR1 приводит к увеличению риска метастазирования рака шейки матки [9] и увеличению степени злокачественности клеток меланомы [10]. Повышенная экспрессия найдена при метастатической меланоме [11]. Активация VEGFR1 способна влиять на вероятность метастазирования при колоректальном раке [12].
Однако при РЖ значение уровня экспрессии гена VEGFR1 в опухоли для ее метастазирования ранее не было определено. Как найдено в нашей работе, экспрессия VEGFR1 с высокой значимостью (см. таблицу) ассоциирована с метастазированием РЖ. Возможно, такая связь обусловлена особенностями структуры белка этого гена, приводящими к запуску процессов миграции клеток [13].
NRP1 — трансмембранный гликопротеин, принимающий участие в VEGF-опосредованном ангио-генезе. Он выступает в качестве многофункционального корецептора, связываясь и модулируя активность различных лигандов и рецепторов, включая VEGFR1. Как корецептор, NRP1 способен принимать участие в метастазировании клеток рака [14].
В соответствии с полученными нами результатами экспрессия NRP1 ассоциирована с метастазиро-ванием РЖ, хотя и с пограничным уровнем значимости. Учитывая возможное взаимодействие VEGFR1 с NRP1, потенциально способное усилить действие VEGFR1, была проведена оценка ассоциации с ме-тастазированием случаев совместно повышенной экспрессии генов VEGFR1 и NRP1. При таком подходе - ОШ 5,778; 95 % ДИ 1,393-23,909, р = 0,0147, т. е. ОШ по отношению к таковому для экспрессии гена VEGFR1 возрастает примерно на 24 %. Увеличивается и нижняя граница ДИ. Если исходить из предположения взаимодействия VEGFR1 и NRP1, полученные результаты свидетельствуют о небольшом вкладе такого взаимодействия в развитие метастазирования РЖ по сравнению с влиянием экспрессии только VEGFR1.
Заключение
Таким образом, показана ассоциация с метастазированием экспрессии генов VEGFR1, FGFR2 и NRP1. Частота повышенной экспрессии FGFR2 составила 5 % при ДРЖ, в то время как при локализованном РЖ она достигает 53 %. Как следует из полученных результатов, разрабатываемый таргетный препарат против FGFR2, скорее всего, при ДРЖ будет иметь ограниченную 5-10 % частоту эффективного действия. Его применение на ранних стадиях РЖ может способствовать предотвращению перехода опухоли в метастатическую стадию. Возможное взаимодействие VEGFR1 и NRP1, в соответствии с полученными результатами, будет приводить к небольшому вкладу в метастазирование РЖ по сравнению с влиянием экспрессии только VEGFR1.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Sitarz R., Skierucha M., Mielko J. Gastric cancer: epidemiology, prevention, classification, and treatment. Cancer Manag Res 2018;10:239-48. PMID: 29445300.
DOI: 10.2147/CMAR.S149619.
2. Smyth E.C., Cunningham D. Targeted therapy for gastric cancer. Curr Treat Options Oncol 2012;13(3):377-89. DOI: 10.1007/s11864-012-0192-6.
3. Prud'homme G. J. and Glinka Y. Neuropilins are multifunctional coreceptors involved in tumor initiation, growth, metastasis and immunity. Oncotarget 2012;3(9):921-39.
4. Li L., Jiang X., Zhang Q. et al. Neuropilin-1 is associated with clinicopathology of gastric cancer and contributes to cell proliferation and migration as multifunctional co-receptors. J Experimental & Clinical
Cancer Research 2016;35:16.
PMID: 26795388.
DOI: 10.1186/s13046-016-0291-5.
5. Su X., Zhan P., Gavine P.R. et al. FGFR2 amplification has prognostic significance in gastric cancer: results from a large international multicentre study. Br J Cancer 2014;110(4):967-75. PMID: 24457912.
DOI: 10.1038/bjc.2013.802.
6. Liang Xie, Xinying Su, Lin Zhang et al. FGFR2 Gene Amplification
in Gastric Cancer Predicts Sensitivity to the Selective FGFR Inhibitor AZD4547 2572. Clin Cancer Res 2013;19:2572-83. PMID: 23493349. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-3898.
7. Murase H., Inokuchi M., Takagi Y. et al. Prognostic significance of the co-over-expression of fibroblast growth factor receptors 1, 2 and 4 in gastric cancer.
Mol Clin Oncol 2014;2(4):509-17.
PMID: 24940486.
DOI: 10.3892/mco.2014.293.
8. Shoji H., Yamada Y., Okita N. et al. Amplification of FGFR2 Gene
in Patients with Advanced Gastric Cancer Receiving Chemotherapy: Prevalence and Prognostic Significance. Anticancer Res 2015;35(9):5055-61. PMID: 26254407.
9. Dang Y-Z., Zhang Y., Li J-P. et al. High VEGFR1/2 expression levels are predictors of poor survival in patients with cervical cancer. Medicine (Baltimore) 2017;96(1):e5772. PMID: 28072723.
DOI: 10.1097/MD.0000000000005772. 10. Тырсина Е.Г., Никулицкий С.И., Иншаков А.Н., Рябая О.О. VEGF-R1 как потенциальная молекулярная мишень противоопухолевой терапии.
Доклады академии наук 2018;478(2):236-39. DOI: 10.7868/S086956521802024X. [Tyrsina E.G., Nikulickij S.I., Inshakov A.N., Ryabaya O. O. VEGFR1 as a potential molecular target of anticancer therapy. Dokladj akademii nauk = Reports of the Academy of Sciences 2018;478(2):236-39. (In Russ.)].
12. Jayasinghe C., Simiantonaki N., Kirkpatrick C.J. Cell type- and tumor zone-specific expression of pVEGFR-1 and its ligands influence colon cancer metastasis. BMC Cancer 2015;15:104. PMID: 25880726. DOI: 10.1186/s12885-015-1130-3.
Journal of Clinical Oncology
2007;25 (18, suppl):8520. DOI: 10.1200/
jco.2007.25.18_suppl.8520.
14. Tse B.W. C., Volpert M., Ratther E. et al. Neuropilin-1 is upregulated in the adaptive response of prostate tumors to androgen-targeted therapies and is prognostic of metastatic progression and patient mortality. Oncogene 2017;36(24):3417-27. PMID: 28092670. DOI: 10.1038/onc.2016.482.
pathways. NPJ Systems Biology and Applications 2018;4:1. PMID: 29263797. DOI: 10.1038/s41540-017-0037-9.
11. Mehnert J.M., McCarthy M. M., Aziz S.A. et al. VEGF, VEGFR1, and
13. Weddell J.C., Chen S., Imoukhuede P.I. VEGFR1 promotes cell migration and proliferation through PLCy and PI3K
VEGFR2 expression in melanoma.
ORCID авторов/ORCID of authors
Ф.М. Кипкеева/F.M. Kipkeeva https://orcid.org/0000-0003-4778-9726 Т.А. Музаффарова/Т.А. Muzaffarova https://orcid.org/0000-0002-2345-2056 М.П. Никулин/M.P. Nikulin https://orcid.org/0000-0002-9608-4696 П.В. Апанович/P.V. Apanovich https://orcid.org/0000-0001-6576-5512 Т.А. Богуш/Т.А. Bogush https://orcid.org/0000-0002-7673-4284 С.Н. Неред/S.N. Nered https://orcid.org/0000-0002-5403-2396 М.Н. Нариманов/M.N. Narimanov https://orcid.org/0000-0003-1806-8401 И.С. Стилиди/I.S. Stilidi https://orcid.org/0000-0002-5229-8203 А.В. Карпухин/A.V. Karpukhin https://orcid.org/0000-0002-7001-9116
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
