CC BY
43
УДК 548.33:575.113:616-053.031:618.33
Н.Г. Горовенко , С.П. Кир’яченко З. І. Россоха
АСОЦІАЦІЯ ПОЛІМОРФНИХ ВАРІАНТІВ ГЕНІВ ACE ТА AT2R1 З РОЗВИТКОМ ПЕРИНАТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ У НОВОНАРОДЖЕНИХ
Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика Референс-центр з молекулярної діагностики МОЗ України
Ключові слова: поліморфізм, перинатальна патологія, новонароджені
Key words: polymorphism, perinatal pathology, newborns
Резюме. В работе представленны данные по ассоциации полиморфных генов АСЕ и AT2R1 с развитием перинатальной патологии и неонатальных синдромов. Определены генотипы, ассоциированные с неблагоприятным течением неонатального периода, а также генотипы, снижающие риск развития перинатальной патологии. Необходимы дальнейшие исследования для оценки целесообразности использования этих маркеров в клинической практике.
Summary. The paper presents data of the associations of polymorphic ACE and AT2R1 genes variants with the development of perinatal pathology and neonatal syndromes. Genotypes associated with adverse neonatal outcome as well as genotypes which reduce risk of perinatal pathology were identified. Further studies are needed to evaluate the neccesity of these markers use in clinical practice.
На сьогодні не викликає сумнівів, що у розвитку хронічних соціально значущих мульти-факторних захворювань важливу роль відіграє генетична компонента. Генетична зумовленість у розвитку мультифакторних захворювань та патологічних станів простежується вже у ранніх періодах онтогенезу. Вивчення генетичних маркерів, асоційованих з розвитком перинатальної патології у новонароджених, має велике практичне значення для розробки превентивних заходів та збереження здоров’я малюка у майбутньому. У попередніх роботах нами було встановлено роль поліморфних маркерів генів ТШЕ-а, МТНЕЯ, ОБТТІ, ОБТМІ, ОБТРІ глутатіон-8-трансфераз у розвитку тяжкої перинатальної патології та неонатальних синдромів [1,3,4,6,7,11], що дозволило охарактеризувати певні патогенетичні ланки у виникненні та перебігу цих мультифак-торних патологічних станів.
Останнім часом увага дослідників спрямовується на аналіз можливого впливу ренін-ангіотензинової системи (РАС) на виникнення неонатальної патології. Від функціональної активності генів РАС залежать складні механізми регуляції кров’яного тиску, підтримання судинного та клітинного гомеостазу, функціональний стан ендотелію та баланс вазоактивних сполук в організмі. В той же час вивченню поліморфних варіантів генів РАС у новонароджених присвячено лише поодинокі роботи [2,10], хоча такий аналіз був би корисним для оцінки порушень цієї гомеостатичної ланки у патогенезі розвитку патологічних станів на ранніх етапах онтогенезу.
Враховуючи синергічну дію генів ACE та AT2R1 та їх вплив на підтримання гомеостатичних процесів [5], метою нашої роботи стало вивчення впливу поліморфних варіантів цих генів на перебіг раннього неонатального періоду та виникнення перинатальної патології новонароджених.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Нами було обстежено 235 новонароджених з тяжкою перинатальною патологією (128 хлопчиків та 107 дівчаток), з них 119 (65 хлопчиків та 54 дівчинки) мали гестаційний вік 28-37 тижнів, а i 16 (63 хлопчики та 53 дівчинки) - 38-40 тижнів. Хворі новонароджені перебували на лікуванні у спеціалізованих неонатологічних відділеннях, у яких їм було проведено клініко-лабораторне, інструментальне обстеження та встановлено діагноз. Критерієм виключення була наявність у новонароджених уроджених вад та аномалій розвитку.
Серед 235 новонароджених з тяжкою перинатальною патологією у 201 (85,53%) дитини перебіг раннього неонатального періоду був ускладнений клінічними проявами перинатальної асфіксії та перинатального гіпоксично-ішеміч-ного ушкодження мозку, 151 (64,26%) новонароджений мав респіраторний дистрес-синдром (РДС), 69 (29,36%) - некротичний ентероколіт (НЕК), 84 (35,74%) - неонатальну жовтяницю.
110 клінічно здорових доношених новонароджених (48 хлопчиків та 62 дівчинки) склали групу контролю. Кількість хлопчиків та дівчат у
групах обстежених новонароджених вірогідно не розрізнялася (р>0,05).
Для молекулярно-генетичного дослідження використовували зразки пуповинної та периферійної крові новонароджених, яку забирали у пробірки з ЕДТА в кількості 2,7 мл. Виділення ДНК проводили з використанням комерційного набору «ДНК-сорб-В». Ампліфікація фрагментів гену ACE здійснювалась з використанням алель-
специфічної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням праймерів ЬееЬіи М. [9] та їх подальшою детекцією в 2 % агарозному гелі. При наявності продукту ампліфікації розміром 490 пар нуклеотидів (інсерційний поліморфізм) генотип новонародженого позначався як II, продукту ампліфікації розміром 190 пар нуклеотидів (делеційний поліморфізм) - ВВ, а обох продуктів ампліфікації - ІВ (рис.1).
Зразки: ACE (II)- 11, 13 ; ACE (ID) - 1, 3, 4, 5, 7-10,12,15-17 ACE (DD) - 2, 6, 14; М - маркер молекулярної ваги
Рис. 1. Електрофореграма продуктів ампліфікації при аналізі поліморфізму гену АСЕ
Визначення поліморфного варіанту А1І66С гену АТ2Я1 проводилось також із використанням рестрикційного аналізу продуктів ПЛР. Продукти ампліфікації фрагментів ДНК гену АТ2Я1 підлягали гідролітичному розщепленню за допомогою ендонуклеази рестрикції ВзґВєІ при наявності сайту рестрикції. Генотип новонарод-
женого визначали в залежності від молекулярної ваги продуктів рестрикційного аналізу: при
виявленні нерозщепленого фрагменту 352 пар нуклеотидів (алель А1166) генотип новонародженого позначали АА, фрагментів 238 і 114 пар нуклеотидів (алель С1166) - СС, а фрагментів 352, 238 і 114 пар нуклеотидів - АС (рис.2)
Л/Т 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
М
'• і Т"" 352 п.н. 114 п.н 238 п.н.
Зразки: AT2R1 (AA)-AT2R1 (CC) - 9 :
1, 4, 6-8, 10, 11; AT2R1 (AC) - 5, 12 М - маркер молекулярної ваги
Рис. 2. Електрофореграма продуктів ампліфікації при аналізі поліморфізму гену АТ2Я1
Результати дослідження оброблялися за допомогою програми Statistika 6.0. Для визначення вірогідності різниці частот генотипів у порівнюваних групах застосовували критерій %2 та відношення шансів Odds Ratio (OR). Статистично значущими вважали відмінності при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Узагальнені результати нашого дослідження у всіх новонароджених (235 хворих та 110 здорових новонароджених) виявили наступний розподіл поліморфних варіантів досліджуваних генів: по гену ACE генотип DD становив 24,06%, ID -50,14%, II - 25,80%, а по гену AT2R1 генотип AA мав місце у 61,45% дітей, AC - у 31,04% , CC - у
7,54%. Таким чином, розподіл поліморфних варіантів досліджуваних генів у новонароджених вірогідно не відрізнявся від результатів, отриманих при популяційних дослідженнях серед дорослих представників української популяції [8], а по гену ACE повністю відповідав менде-лівському співвідношенню генотипів.
Дизайном нашого дослідження передбачалося проведення порівняння частот генотипів у хворих та здорових новонароджених за принципом випадок - контроль. Як видно з рисунка 1, при поділі новонароджених на дві групи - хворих з тяжкою перинатальною патологією та клінічно здорових, розподіл поліморфних варіантів досліджуваних генів уже вірогідно відрізнявся.
Отримані результати та їх статистичний аналіз вказують на асоціацію генотипів ВВ (%2= 9,60, ОЯ= 2,58 95% СІ: 1,40-4,76), ІВ (2= 6,65, ОЯ= 1,83 95% СІ: 1,15-2,89) гену АСЕ та генотипу СС (2=7,58, ОЯ= 6,14 95% СІ: 1,4226,47), АС (%2=6,38, ОЯ=1,96 95% СІ: 1,16-3,31) гену АТ2Я1 з розвитком тяжкої перинатальної
патології у новонароджених (рис.3). У той же час для генотипу II гену ACE (%2=35,68, OR=0,22 95% CI: 0,13- 0,37) та генотипу AA гену AT2R1 (Х2=15,16, OR= 0,37 95% CI: 0,22-0,62) було виявлено протективний ефект до розвитку цієї патології.
76,36%
54,89%
46,36%
16,1
40,00%
28,94%
54,47%
13,64%
35,32%
□21,82%
lj
10,21% 1,82%
II ID DD AA AC CC
ACE AT2R1
□ новонароджені з важкою перинатальною патологією
□ контрольна група
Рис.3. Розподіл частот поліморфних варіантів генів ACE та AT2Rl у новонароджених з тяжкою перинатальною патологією у порівнянні з групою контролю
При аналізі результатів дослідження обстежених нами хворих новонароджених у залежності від терміну гестації не було виявлено вірогідної різниці у розподілі поліморфних варіантів генів АСЕ та AT2R1 серед доношених та недоношених новонароджених (рис. 4), що дало можливість зробити висновок про відсутність
впливу досліджуваних поліморфних варіантів цих генів на скорочення терміну гестації, тобто недоношеність. Тому при подальшій обробці отриманих результатів нами проводився аналіз ризику розвитку неонатальної патології у новонароджених незалежно від гестаційного віку.
57,98% 51,72%
56,30%
І доношені новонароджені
□ недоношені новонароджені
Рис. 4. Розподіл частот поліморфних варіантів генів ACE та AT2Rl серед доношених та недоношених новонароджених з тяжкою перинатальною патологією
На відміну від нашого дослідження, R. Uma зі співавт. (2008) виявили асоціацію генотипу DD гену ACE з недоношеністю новонароджених, що може бути наслідком того, що переважна більшість обстежених були недоношеними, для яких характерна висока частота перинатальної патології, а також того, що серед доношених не проводився аналіз перебігу раннього неонатального періоду [10]. Отримані нами результати узгоджуються з результатами Богданової та
співавт. щодо асоціації алелю D поліморфного локусу гену ACE з розвитком РДС та визначенням генотипу II цього гену як маркеру стійкості до ураження легень [2].
У таблицях 1 та 2 наведено результати аналізу поліморфних варіантів генів ACE та AT2R1 в обстежених нами хворих новонароджених з НЕК, неонатальною жовтяницею, РДС та у новонароджених групи контролю.
Таблиця 1
Розподіл I/D поліморфізму гену ACE у хворих з неонатальними синдромами та у
клінічно здорових новонароджених
Патологічний стан Хворі з тяжкою перинатальною патологією Клінічно здорові новонароджені Статистичний аналіз
n % n % X2 OR 95% p
Некротичний II 8 11,59 51 46,36 23,2 0,15 0,07-0,35 <0,001
ентероколіт ID 36 52,17 44 40,00 2,54 1,64 0,89-3,00 >0,05
DD 25 36,23 15 13,64 12,48 3,6 1,73-7,49 <0,01
Неонатальна II 6 7,14 51 46,36 20,57 0,09 0,04-0,22 <0,001
жовтяниця
ID 50 59,52 44 40,00 7,27 2,21 1,24-3,94 <0,05
DD 28 33,33 15 13,64 10,71 3,17 1,56-6,43 <0,01
Респіраторний II 20 13,25 51 46,36 35,25 0,18 0,10-0,32 <0,001
дистрес-синдром ID 80 52,98 44 40,00 4,3 1,69 1,03-2,78 >0,05
DD 51 33,77 15 13,64 13,66 3,23 1,70-6,13 <0,01
Як видно з таблиці 1, в обстежених нами хво- ниці, генотипу ВВ з розвитком НЕК, РДС. Для
рих новонароджених виявлено асоціацію гено- генотипу II показано протективний ефект до
типу DD та ID з розвитком неонатальної жовтя- виникнення цих неонатальних синдромів.
Таблиця 2
Розподіл All66C поліморфізму гепу AT2Rl у хворих з пеопатальпими синдромами та у
кліпічпо здорових повопароджепих
Патологічний стан Хворі з тяжкою перинатальною патологією Клінічно здорові новонароджені Статистичний аналіз
n % n % X2 OR 95% p
Некротичний AA 41 59,42 84 76,36 5,78 0,45 0,24-0,87 <0,05
ентероколіт AC 21 30,43 24 21,82 1,67 1,57 0,79-3,11 >0,05
CC 7 10,14 2 1,82 6,16 6,10 1,23-30,26 <0,05
Неонатальна жовтяниця AA 48 57,14 84 76,36 8,09 0,41 0,22-0,76 <0,05
AC 28 33,33 24 21,82 3,22 1,99 1,05-3,76 >0,05
CC 8 9,52 2 1,82 5,78 5,68 1,17-27,51 <0,05
Респіраторний дистрес- AA 90 59,60 84 76,36 8,05 0,46 0,26-0,79 <0,01
синдром AC 42 27,81 24 21,82 1,21 1,38 0,78-2,46 >0,05
CC 19 12,58 2 1,82 9,97 7,77 1,77-34,11 <0,01
Результати статистичної обробки одержаних результатів (табл.2) переконливо свідчать про асоціацію генотипу СС гену AT2R1 у новонароджених з розвитком НЕК, неонатальної жовтяниці, РДС, у той час як генотип AA вірогідно знижував ризик їх розвитку.
Раніше у новонароджених з тяжкою перинатальною патологією нами досліджувався вплив зазначених поліморфних варіантів генів на розвиток та перебіг перинатального гіпоксичного ушкодження [7] і було встановлено, що ступінь тяжкості перинатального гіпоксичного ушкодження вірогідно залежить від наявності генотипу DD або ID: у хворих новонароджених з тяжким гіпоксичним ушкодженням була вірогідно підвищена частота генотипу DD, а у хворих з помірним - генотипу ID. Для поліморфних варіантів гену AT2R1 було показано, що наявність генотипу СС також вірогідно асоційована та збільшує ризик розвитку перинатального гіпок-сичного ушкодження, але не впливає на його ступінь. Для генотипу II по гену ACE та генотипу АА по гену AT2R1 було показано протективний ефект, суттєве зниження ризику розвитку гіпок-сичного ушкодження в перинатальному періоді [7], як і для іншої перинатально! патології, що вивчалась у даному дослідженні. Таким чином, очевидною є однонаправленість виявленої нами асоціації генотипу DD та/або ID по гену ACE і генотипу АА по гену AT2R1 з підвищеним ризиком розвитку тяжкої перинатальної патології в цілому та окремих синдромів (РДС, НЕК, неона-тальної жовтяниці та перинатального гіпок-сичного ушкодження). Для генотипу II по гену ACE та генотипу АА по гену AT2R1 було показано протективний ефект і суттєве зниження ризику розвитку гіпоксичного ушкодження в перинатальному періоді [7], як і для іншої перинатальної патології, що вивчалась у даному дослідженні.
При проведенні аналізу комбінацій варіантів по генах ACE та AT2R1 нами виявлено лише високовірогідну різницю частоти генотипу II/AA (%2=56,74, OR= 0,07 95% CI: 0,04-0,14). Цей генотип зустрічався значно частіше у клінічно здорових новонароджених (у 50 із 110, або 45,45%) і лише у 13 з 235 дітей (5,52%) з перинатальною патологією. Величина OR свідчить, що шанс мати тяжку перинатальну патологію у 14
разів нижчий у дітей з генотипом II/AA, що у порівнянні з результатами аналізу частот цих поліморфних варіантів нарізно вказує на взаєм-нопідсилюючу роль виявленої нами їх протек-тивної дії.
Таким чином, певні поліморфні варіанти генів РАС є важливими патогенетичними чинниками розвитку тяжкої перинатальної патології та неонатальних синдромів та мають прогностичне значення. Впровадження у клінічну практику дослідження I/D поліморфізму гену ACE та поліморфізму A1166C гену AT2R1 у новонароджених виглядає перспективним, оскільки проведення діагностики на доклінічній стадії сприятиме розробці ефективних заходів запобігання виникненню перинатальної патології і зниження смертності та інвалідизації від цієї тяжкої патології.
ВИСНОВКИ
1. Визначено асоціацію генотипів DD та ID гену ACE та генотипу СС гену AT2R1 з підвищеним ризиком розвитку перинатальної патології та неонатальних синдромів.
2. Доведено вірогідне підвищення резистентності до виникнення захворювань у перинатальному періоді для новонароджених з генотипом II гену ACE та AA генотипом гену AT2R1, особливо при їх поєднанні.
3. Не виявлено зв’язку між наявністю певних поліморфних варіантів генів ACE та AT2R1 і скороченням терміну гестації.
4. Необхідні подальші комплексні дослідження для оцінки доцільності використання виявлених маркерів у доклінічній діагностиці неонатальних синдромів та розробці нових методів лікування.
Автори висловлюють щиру подяку генеральному директору Гладушу Ю. І. та співробітникам неонатологічних відділень НДСЛ «Охматдит», завідувачу кафедри неонатології НМАПО імені П.Л.Шупика професору Шунько Є.Є. та співробітникам цієї кафедри, співробітникам кафедри педіатрії ВДНЗ «Українська медична стоматологічна академія» (м. Полтава) доцентам Похилько В.І., Ковальовій О.М. за надану можливість і сприяння у проведенні досліджень.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Аналіз внеску поліморфних варіантів генів в8ТТ1, в8ТМ1, в8ТР1 у розвиток критичних станів та органних дисфункцій у недоношених новонароджених новонароджених з низькою масою тіла /
Н.Г. Горовенко, £.£. Шунько, З.1. Россоха [та ш.] // Здоровье женщины. - 2010. - №5 (51). - С.180-184.
2. Богданова Р.З. Генетические маркеры дыхательных расстройств у новорождённых / Р.З. Богда-
нова, А.И. Фатыхова, К.В. Данилко // Вопросы практической педиатрии .-2008.-Т.3, №6. - С.12-16.
3. Горовенко Н.Г. Роль поліморфізму в308Л гена ТОТ-а у розвитку перинатальної патології в новонароджених / Н.Г. Горовенко, С.П. Кир’яченко,
3.1. Россоха // Здоровье женщины.-2010.-№5(51).-С.180-184.
4. Горовенко Н.Г. Роль спадкових факторів у розвитку перинатальної патології новонороджених / Н.Г. Горовенко, З.І. Россоха, С.В. Подольська // Сучасна педіатрія. - 2007. - Т.14, №1. - С.162-168.
5. Дисфункция эндотелия: связь с полиморфизмом гена рецептора (тип 1) ангиотензина II у больных ишемической болезнью сердца / Л.О. Мину-шкина, Д. А. Затейщиков, О. Ю. Кудряшова [и др.] // Журнал кардиология .-2000.-Т.12, №1. - С. 101-106.
6. Кир’яченко С.П. Молекулярно-генетичні маркери ризику розвитку респіраторного дистрес -синдрому у новонароджених / С.П. Кир’яченко,
3.1. Россоха, Н.Г. Горовенко // Збірник наук. праць. -К., Луганськ, 2010.- Вип. 19. - С.220-232.
7. Пат. 47651 Україна, МПК Л61В10/00. Спосіб прогнозування ризику розвитку перинатального гіпо-ксичного ушкодження у новонароджених / Горовен-ко Н.Г., Кир’яченко С.П., Россоха З.І., Подольсь-ка С.В. (Україна). -№200912914; заявл. 14.12.2009; опубл.10.02.2010, Бюл. № 3.
8. Частота поліморфізму генів ангіотензин-пере-творювального ферменту (I/D), рецептора ангіотен-зину II першого типу (а1166с), ендотеліальної NO-синтази (T894G), рецептора PPAR-y2 (Pro12Ala), рі-адренорецептора (Arg389Gly) у хворих на артеріальну гіпертензію у західно-українській популяції (Буковина) / Л.П. Сидорчук, К.М. Амосова, Р.А. Волков [та ін.] // Збірник наукових праць НМАПО імені П.Л. Шупика.- 2009. - Вип.16. - С. 346 - 361.
9. Angiotensin-I converting enzyme genotypes and left ventricular hypertrophy in patients with hypertrophic cardiomyopatthy / M. Lechin, M. Quinones, A. Omran [et al.] // Circulation. - 1995. - Vol. 92, N 7. - P. 18081812.
10. Correlation of angiotensin converting enzyme activity and the genotypes of the I/D polymorphism in the ACE gene with preterm birth and birth weight / R. Uma, J.S. Forsyth, D.A. Struthers, G.F. Callum // Eur. J. Obstetirics & Gynecology.-2008.-Vol.141, N 1. - P.27-30.
11. The role of RAS genes polymorhism in the development risk of RDS in newborns / N.G. Gorovenko,
S.P. Kyryachenko, Z.I. Rossokha [et al.] // Annual congress European Respiratory Society. - Barselona. Spain, 2010.
♦
УДК 616.12-008.331.1:616.831:502.175
Г. С. Кусткова ,
Н.К. Мурашко
ДІАГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ЦИРКАДНИХ РИТМІВ ПРИ ГІПЕРТЕНЗИВНІЙ ЕНЦЕФАЛОПАТІЇ У ХВОРИХ З КРИЗОВИМИ СТАНАМИ ГІПЕРТОНІЧНОЇ ХВОРОБИ
Київська міська клінічна лікарня №8
Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика кафедри неврології та рефлексотерапії
Ключові слова: артеріальна гіпертензія, гіпертензивна енцефалопатія, гіпертензивні кризи, порушення циркадного ритму, діагностика Key words: hypertensive encephalopathy, arterial hypertension, hypertensic crisis, circadian rhythm disorders, diagnosis
Резюме. Учитывая важность ранней диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, проведена оценка диагностической значимости циркадного ритма при гипертензивной енцефалопатии у пациентов с кризовым течением гипертоничекой болезни. Проведенный анализ суточного профиля артериального давления (АД) показал, что при развитии гипертензивного криза (ГК) нарушения циркадного ритма наблю-даюся у 85,7% больных: у 47,6% больных - недостаточное снижение АД ночью (non-dipper), у 28, 5% - преимущественно ночная гипертензия (nigth-peaker), у 19,1% больных - чрезмерное ночное падение АД (overdipper). Было доказано, что продолжительность повышенного значения артериального давления в течение первого часа ГК зависит от длительности и степени АГ в анамнезе, а предиктором длительного сохранения повышенного АД является наличие гипертрофии левого желудочка (р<0,05), что, по данным литературы, служит маркерами истощения цереброваскулярного резерва и отражает компенсаторный характер.
