CC BY-ND
26
ИЮНЬ №6 (267)
43
г-Ь
10. Лучинина С.В. и др. Эффективность вакцино-профилактики у медицинских работников г. Челябинска / С.В. Лучинина, Н.П. Уральшина, Г.И. Кузьмина //Мир вирусных гепатитов. 2004. № 5. С. 6.
11. Пенкина Т.В. и др. Широта распространенности маркеров гепатита В среди медицинского персонала многопрофильного стационара и определение напряженности поствакцинального иммунитета / Т.В. Пенкина, Т.М. Чупыра, Т.Ю. Гурбатова
[и др.] //Мир вирусных гепатитов. 2006. № 6. С. 11—17._
Контактная информация:
Шулакова Надежда Ивановна, тел.: 8 (915) 085-44-64, e-mail: [email protected]
Contact information:
Shulakova Nadezhda, phone: 8 (915) 085-44-64, e-mail: [email protected]
-V-
УДК 616.98.579.841.95 (470)
АПРОБАЦИЯ НОВЫХ ГЕНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ ТЕРРИТОРИЙ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НА НАЛИЧИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ
А.М. Сеничкина1, Н.А. Осина1, А.А. Зайцев2, Н.М. Усольцева3, С.М. Усманова3
:ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»» Роспотребнадзора, г. Саратов, Россия 2ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ставрополь, Россия 3ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области»,
г. Челябинск, Россия
Проведена апробация двух генодиагностических препаратов для обнаружения ДНК F.tularensis в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР. Показана их высокая эффективность для индикации возбудителя туляремии в полевом материале и перспективность использования при эпизоотологическом мониторинге территорий Российской Федерации.
Ключевые слова: ДНК, Francisella tularensis, туляремия, набор реагентов, полиме-разная цепная реакция.
A.M. Senichkina, N.A. Osina, A.A. Zaitsev, N.M. Usol'tseva, S.M. Usmanova □ VERIFICATION OF NEW GENE-DIAGNOSTIC PREPARATIONS IN THE CONTEXT OF EPIZOOTIOLOGICAL MONITORING OVER TULAREMIA AGENT IN THE TERRITORY OF THE RUSSIAN FEDERATION □ FSHE «Russian Scientific Research Anti-Plague Institute «Microbe»», Saratov, Russia; FSHE «Stavropol Anti-Plague Institute» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Stavropol, Russia; FBHE «Center of Hygiene and Epidemiology in the Chelyabinsk Region», Chelyabinsk, Russia.
Verified have been two gene-diagnostic preparations for F.tularensis DNA detection in biological material and environmental samples using PCR assay. Demonstrated is their high performance in case of tularemia agent indication in field samples, as well as the prospects of application for epizootiological monitoring over the Russian Federation territory. Key words: DNA, Francisella tularensis, tularemia, reagent panel, polymerase chain reaction.
Единичные случаи и вспышки туляремии среди населения во всем мире регистрируются ежегодно. За последние пять лет больные этим заболеванием выявлены в Турции, Италии, Германии, Нидерландах, Финляндии, Франции, Испании, Швеции,
Швейцарии [1]. В Российской Федерации заболеваемость туляремией отмечена на территориях практически всех краев, областей, республик. В 2012 г. в Приволжском федеральном округе было диагностировано 43 случая заражения людей туляремией; в
44
ЗНиСО ИЮНЬ №С (267)
2013 г. возникла крупная вспышка данного антропоноза в Ханты-Мансийском автономном округе; выявлены случаи заболевания в Ставропольском крае, Архангельской, Вологодской, Кировской и Нижегородской областях [1]. С целью снижения риска возникновения заболевания среди населения, проживающего на территориях природных очагов туляремии, необходимо проведение их ежегодного эпизоотологического мониторинга.
В действующих МУ 3.1.2007—05 одним из методов лабораторной диагностики туляремии, в том числе при эпизоотологическом обследовании, является метод ПЦР [4]. Однако сертифицированные препараты для выявления ДНК Francisella tularensis длительное время отсутствовали. В настоящее время для этих целей разработаны и зарегистрированы два набора реагентов: «Набор реагентов для выявления ДНК Francisella tularensis методом полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Francisella tularensis — РЭФ)» (№ ФСР 2011/12108) и «Набор реагентов для выявления ДНК Francisella tularensis методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Ген Francisella tularensis — РГФ)» (№ ФСР 2011/12107), производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». В процессе регистрации данных препаратов была изучена их чувствительность и специфичность при исследовании бактериальных суспензий культур F. tularensis, а также проб биологического материала и объектов окружающей среды, искусственно контаминированных патогеном. Однако данные о применении этих наборов для анализа полевого материала на момент начала исследования отсутствовали. В тоже время такие показатели были получены для тест-системы для выявления РНК вируса Западного Нила методом ОТ-ПЦР «ГенНил» [2].
Цель работы — оценка диагностической эффективности наборов реагентов «Ген Francisella tularensis — РЭФ» и «Ген Francisella tularensis — РГФ» при исследовании проб биологического материала и объектов окружающей среды в ходе эпизоотологического мониторинга территорий Российской Федерации.
Материалы и методы. Исследована 2 461 проба биологического материала и объектов окружающей среды, из них: 1 166 проб суспензий органов (печень, селезенка) мелких млекопитающих (домовой, полевой, малой лесной, желтогорлой и белой мышей; обще-
ственной, рыжей и обыкновенной полевок; ^z большого тушканчика; бурозубки малой и ^ обыкновенной; белозубки малой; большого ^ суслика; барсука обыкновенного; ондатры; хомячка Эверсманна; пеструшки степной), ^ 25 проб суспензий органов зайца, 561 проба суспензий клещей (D. marginatus, D. reticulatus, с=
B. annulatus, H. scupense, H. marginatum, Rh. rossicus, Ix. laguri, R. schulzei), 150 проб суспензий блох (A. rossica, N. mokrzeckyi, Ct. secundus, Ct. wagneri, M. hebes, P. irritans, L. taschenbergi, N. consimilis, C. trichosa,
C. canis, C. tesquorum, F. semura, Or. ilovaiskii, Ct. Breviatus), 548 проб суспензий комаров родов Culex, Aedes, Anopheles, Culiseta, Coquillettidia, 7 проб суспензий слепней, 3 пробы гнезд сусликов, 1 проба погадок хищных птиц. Материал для апробации наборов реагентов получен в 2009—2014 гг. при эпизоотологическом обследовании территорий Саратовской, Астраханской, Челябинской областей, Ставропольского края и Карачаево-Черкесской республики.
Сбор материала для лабораторного анализа, его первичную подготовку и обеззараживание проводили в соответствии с МУ 3.1.2007—05 и МУ 1.3.2569—09 [4, 5]. Выделение ДНК осуществляли методом нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата с помощью наборов «Рибо-Преп», «Рибо-Сорб» или «ДНК-Сорб В» («ИнтерЛабСервис», Россия), постановку ПЦР — при помощи наборов реагентов «Ген Francisella tularensis — РЭФ» и «Ген Francisella tularensis - РГФ» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»). Исследования выполняли согласно инструкциям по применению к наборам реагентов. Амплификацию проводили на приборах «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия), «RotoGene 6000» («Corbett Research», Австралия). Дополнительно использовали бактериологический метод исследования в соответствии с МУ 3.1.2007—05 [5].
Результаты и обсуждение. Материал для исследования был собран на территориях, где отмечена циркуляция возбудителя туляремии, где ежегодно обнаруживают туляремийный антиген серологическими методами в пробах биологического материала (органы мелких млекопитающих, эктопаразиты) и объектов окружающей среды (погадки птиц, солома), а также где ранее были выделены культуры туляремий-ного микроба. Обследовано 12 районов Саратовской области, 3 населенных пункта Астраханской области, 18 населенных пунктов Карачаево-Черкесской республики, 3 района Ставропольского края и 1 район
ИЮНЬ №6 (267)
45
Челябинской области. Полученные в ходе ^ анализа данные представлены в таблице. ^ Установлено, что из 1 166 исследованных суспензий органов мелких млекопитающих ДНК возбудителя туляремии выявлена в двух пробах (0,17 %) суспензий органов мелких с= млекопитающих: в одной — от белозубки малой, в другой — от двух домовых мышей, добытых на территории Александрово-Гайского района Саратовской области. При анализе 561 пробы суспензий клещей методом ПЦР маркер туляремийного микроба обнаружен в 10 пробах (1,78 %), из которых: 7 — D. marginatus, 1 — H. scupense, 1 — Rh. rossicus, 1 — H. marginatum. Первые два вида клещей собраны на территории Александрово-Гайского района Саратовской области, третий — на территории с. Красногвардейское Красногвардейского района Ставропольского края, четвертый — в с. Кучерла Туркменского района Ставропольского края. Заслуживает внимание тот факт, что клещи D. marginatus, инфицированные туляремийным микробом, отобраны на участках, где в последнее время антигены возбудителя туляремии не обнаруживали. Секвенирование ампликонов, полученных при исследовании этих проб с использованием генодиагностических препаратов, показало их гомологию (99,9 %) с нуклеотидной последовательностью iglBC генов F. tularensis, представленных в базе данных GenBank, NCBI. Полученные данные подтверждают результаты ПЦР и могут свидетельствовать о расширении ареала циркуляции возбудителя туляремии. При
исследовании бактериологическим методом положительных в ПЦР проб суспензий клещей Rh. rossicus и H. marginatum была выделена культура туляремийного микроба, что также подтверждает эффективность используемых наборов реагентов.
При исследовании 709 проб суспензий слепней, блох, комаров, погадок птиц, гнезд сусликов, отобранных на территории Саратовской области, во всех случаях вне зависимости от используемого генодиагностического препарата в ПЦР получен отрицательный ответ, что указывает на отсутствие в данном материале ДНК туляремийного микроба.
Положительный опыт применения ПЦР для исследования полевого материала с целью выявления ДНК возбудителя туляремии показан зарубежными исследователями. По данным литературных источников, в Швейцарии во время эпизоотии туляремии с мая 2012 г. по июнь 2013 г. в 42 % проб от домовых мышей методом ПЦР обнаружена ДНК туляремийного микроба [7]. Авторы исследования показали, что у большинства животных, у которых был выявлен патоген с помощью молекулярно-генетических методов, имелись патологоанатомические изменения, характерные для туляремийной инфекции.
Особый интерес представляет случай выявления в 2014 г. ДНК туляремийного микроба в суспензиях органов зайца (0,04 %), добытого в Октябрьском районе д. Горелое Челябинской области при исследовании биологического материала. С помощью
Таблица 1. Результаты исследования проб полевого материала с помощью наборов реагентов «Ген Fгancisella 1и1ягеи818 — РЭФ» и «Ген Fгancisella 1и1ягеи818 — РГФ»
Исследуемый материал Территория* Общее количество проб «Ген F.t. - РЭФ» «Ген F.t. - РГФ»
Кол-во проб /Число положительных
Органы мелких млекопитающих С 1056 1 09/0 947/2
А 110 н/и 110/0
Заяц С 24 н/и 24/0
Ч 1 н/и 1/1
Клещи С 394 н/и 394/8
К-Ч 91 91/0 91/0
СК 76 76/2 76/2
Блохи С 150 25/0 125/0
Комары 548 11/0 537/0
Слепни 7 н/и 7/0
Погадки птиц 1 н/и 1/0
Гнезда сусликов 3 н/и 3/0
Примечание: * С — Саратовская область, А — Астраханская область, Ч — Челябинская область, К-Ч — Карачаево-Черкесской республики, СК — Ставропольский край, н/и — не исследовали
46
ЗНиСО ИЮНЬ №6 (267)
бактериологического метода из этих же проб выделена культура возбудителя туляремии. Полученные результаты являются следствием событий 2014 г., когда на территории Челябинской области была отмечена активизация природных очагов туляремии, выявлено и подтверждено восемь случаев заболевания инфекцией, зарегистрирован высокий процент проб, содержащих туляремийный антиген: в 12 (41,3 %) из 29 исследованных проб погадок птиц (по сравнению с 2013 г. процент положительных проб увеличился в 3 раза), в 17 (12,4 %) из 137 проб сена, соломы, собранных в лесостепной и степной природных зонах [3]. Случаев обнаружения ДНК патогена при исследовании проб органов зайца (25 образцов), добытых на территории Саратовской области, отмечено не было.
За рубежом все чаще появляются сведения о положительных находках ДНК возбудителя туляремии в суспензиях органов зайцев и кроликов [6, 8]. В Нидерландах в 2013 г. впервые за последние 60 лет в 1 из 49 (2 %) исследованных проб органов зайцев выявлена ДНК F. tularensis, в Германии в период 2005—2010 гг. данный показатель также составил 2 % — 52 положительных случая из 2500 изученных образцов [6, 8]. В 60 % случаев из проб, в которых был обнаружен туляремийный микроб с помощью ПЦР, выделена культура патогена, идентифицированная как F. tularensis подвид holarctica.
Таким образом, положительные результаты, полученные с использованием наборов реагентов «Ген Francisella tularensis — РЭФ» и «Ген Francisella tularensis — РГФ», свидетельствуют о высокой эффективности разработанных препаратов при исследовании полевого материала на наличие ДНК туляремийного микроба и их информативности при проведении эпизоотологического мониторинга.
ЛИТЕРАТУРA
1. Государственный доклад о санитарно-
эпидемиологической обстановке в Российской
Федерации в 2013 году: [Электронный ресурс]: Режим доступа: http:// 64.rospotrebnadzor.ru (дата обращения: 19.11.2014).
2. Красовская Т.Ю. и др. Разработка и внедрение тест-систем для лабораторной диагностики лихорадки Западного Нила методом ПЦР / Т.Ю. Красовская, И.Н. Шарова, С.А. Щербакова, Ю.И. Яшечкин [и др.] //Здоровье населения и среда обитания. 2007. № 6 (171). С. 42—46.
3. Обзор численности мелких млекопитающих и членистоногих переносчиков, эпизоотической обстановки на территории Челябинской области с ноября 2013 г. по октябрь 2014 г. и краткосрочный прогноз на первое полугодие 2015 года. Челябинск, 2014, 21 с.
4. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности: МУ 1.3.2569—09. М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009 г.
5. Эпидемиологический надзор за туляремией: МУ 3.1.2007—05. М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2005 г.
6. Müller W. et al. German Francisella tularensis isolates from European brown hares (Lepus europaeus) reveal genetic and phenotypic diversity / W. Müller, H. Hotzel, P. Otto, A. Karger [et al] //BMC Microbiology. 2013. Vol. 13. Iss. 61.
7. Origgi F.C. et al. Tularemia among Free-Ranging Mice without Infection of Exposed Humans, Swizerland, 2012 / F.C. Origgi, B. König, A.K. Lindholm, D. Mayor [et al] //Emerging Infectious Diseases. Jan. 2015. Vol. 21. N. 1. P. 133—135.
8. Rijks J.M. et al. Tularemia in a brown hare (Lepus europaeus) in 2013: first case in the Netherlands in 60 years / J.M. Rijks, M. Kik, M.G. Koene, M.Y. Engelsma // Eurosurveillance. 2013. Vol. 18. Iss. 49.
Контактная информация:
Сеничкина Айслу Мухамятовна, тел.: 8 (964) 849-36-07, e-mail: [email protected]
Contact information: Senichkina Aislu, phone: 8 (964) 849-36-07, e-mail: [email protected]
r-b
