CC BY
22
УДК 616.981.455
А.А.Зайцев, О.А.Гнусарева, Н.С.Царева, В.В.Остапович, И.Ю.Борздова, А.Н.Куличенко
применение иммунохроматографических тест-систем для экспрЕсс-выявлЕния липополисАхАридА РГАПС&ЕНА TULARENSIS при мониторинге природных очагов
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт», Ставрополь
Показано, что иммунохроматографические тест-системы можно использовать для экспресс-выявления липо-полисахарида туляремийного микроба при проведении идентификации штаммов Еrancisella tularensis, выделенных из природных очагов, а при эпизоотологическом обследовании - для исследования суспензий иксодовых клещей и внутренних органов, павших биопробных животных.
Ключевые слова: возбудитель туляремии, иммунохроматографическая тест-система, экспресс-выявление, идентификация, природные очаги туляремии.
A.A.Zaitsev, O.A.Gnusareva, N.S.Tsareva, V.V.Ostapovich, LYu.Borzdova, A.N.Kulichenko
Immuno-Chromatographic Test System Application for Rapid Detection of Francisella tularensis Lipopolysaccharide in Monitoring of Natural Foci
Stavropol Research Anti-Plague Institute, Stavropol
Immuno-chromatographic test systems are shown to be applicable for rapid detection of tularemia microbe lipopolysaccharide for identification of Francisella tularensis strains isolated in natural foci, and in epizootiologic survey - for the analysis of suspensions of ixodic ticks and internal organs of dead animals.
Key words: tularemia agent, immuno-chromatographic test system, rapid detection, identification, natural foci of tularemia.
Имеются многочисленные сообщения о разработке иммунохроматографических тест-систем и использованию их для серологической диагностики различных инфекционных болезней, в том числе и туляремии [2, 5, 6, 7].
Принцип их действия заключается в том, что микробные клетки (липополисахарид) возбудителя туляремии, присутствующие в исследуемой пробе, взаимодействуют с меченными золотом антителами и в последующем накапливаются в виде окрашенного комплекса антиген-антитело в тестовой зоне.
Цель работы - изучение возможности применения иммунохроматографических (ИХ) тест-систем, разработанных и изготовленных в ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (п. Оболенск), для экспресс-выявления липополисахарида (ЛПС) туля-ремийного микроба при проведении мониторинга природных очагов Северного Кавказа.
Материалы и методы
Оценку диагностических свойств серологических тест-систем и диагностикумов проводили на штаммах Francisella tularensis^. Е tularensis subsp. Ио-1агеИеа - 63 штамма из природных очагов Северного Кавказа и 1 - вакцинный, Е tularensis ииЬир. шШгеп-sis - 2 штамма, Е tularensis ииЬир. mediasiatica - 3 штамма. Штаммы выращивали на Ft-агаре в течение 48-72 ч при температуре 37 °С [4].
Для оценки специфичности использовали коллекционные штаммы близкородственных микро-
организмов: 2 штамма Brucella abortus 19 ВА и 484, 2 штамма B. melitensis 16 М и 640, 1 штамм
B. suis 1330, 2 штамма Escherichia coli О-111 и СА-18, 1 штамм Salmonella typhimurium 9640, 1 штамм Yersinia enterocolitica 383 и 1 штамм Y. pestis EV. Штаммы выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) или эритрит-агаре (рН 7,2) в течение 24-48 ч при температуре 37 °С.
Взвесь с концентрацией 1-109 м.к./мл по отраслевому стандарту мутности (ОСО 42-28-85П) готовили с использованием 0,01 М натрий-фосфатного буфера (НБФ) при рН 7,2-7,4 и обеззараживали в соответствии с п. 2.8.16 [1]. Затем путем последовательных десятикратных разведений получали взвеси концентрацией Ы08, 1-07 и 1-106 м.к./мл.
Для приготовления суспензий внутренних органов павших биопробных животных использовали НФБ (рН 7,2-7,4), после чего часть нативного материала обеззараживали в соответствии с п. 2.8.16 [1].
Суспензии Dermacentor marginatus и D. reti-culatus готовили в НФБ (рН 7,2-7,4) из расчета 1,2-1,5 мл на один пул. Пробы обеззараживали добавлением проверенного на бактерицидное действие формалина до 2 % конечной концентрации при 56 °С в течение 30 мин с последующей экспозицией не менее 12 ч при комнатной температуре.
Для постановки иммунохроматографических реакций использовали экспериментально-производственные и коммерческие серии образцов иммунох-роматографических тест-систем. Это, соответственно, - «ИХ тест F. tularensis», представляющий собой пластиковую диагностическую панель (футляр)
с лункой для добавления образца и окошком для считывания результатов, и «Тест-полоска F. tularen-sis», представляющая собой мембранную полоску белого цвета с отметкой, которая указывает направление и предельную глубину погружения теста. Обе диагностические тест-системы были разработаны в ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (п. Оболенск) и предназначены для экспресс-выявления и идентификации возбудителя туляремии F. tularensis. Специфической мишенью для данных тестов является ЛПС F. tularensis.
Для постановки иммуносуспензионных реакций (РНГА и РНАт) и твердофазного иммуноферментно-го анализа (ТИФА) использовали диагностикумы и тест-системы производства Ставропольского научноисследовательского противочумного института.
Результаты и обсуждение
Лабораторные испытания иммунохроматогра-фических тест-систем проводили в четыре этапа. На первом этапе при оценке специфической активности «ИХ тест F. tularensis» использовали чистые культуры туляремийного микроба 1-109,1-108, 1-107 и 1-106 м.к./мл. У всех 69 штаммов F. tularensis наблюдали формирование полосы в тестовой зоне «Т» и контрольной в зоне «С». Отмечено, что интенсивность окраски тестовой полосы «Т» варьировала от насыщенного красного цвета (+++), до розового (++) или слабо-розового (+). У взвесей концентрацией 1-107 м.к./мл обычно наблюдали слабо прокрашенные полосы (+), а у взвесей 1-108 и Ы09 м.к./мл выявляли преимущественно четкие полосы (++ и +++). У взвесей концентраций 1-106 м.к./мл F. tularensis отсутствовало формирование полосы в тестовой зоне.
Все использованные в работе штаммы возбудителя туляремии трех подвидов дали положительные результаты реакций в иммунохроматографической тест-системе для экспресс-выявления и идентификации F. tularensis. Учет положительных результатов регистрировали в течение 15-20 мин, что соответствовало требованиям нормативной документации, но отмечено влияние на результат реакции концентрации взвеси микробных клеток туляремийного микроба. Стабильно четкие положительные результаты были получены при выборе концентрации 1-108 м.к./мл. Поэтому нами рекомендуется начинать исследование с этой концентрации взвеси. Только в случае получения сомнительного результата следует ставить иммунохроматографическую реакцию с взвесями концентрацией Ь109 м.к./мл.
Для оценки специфичности использовали взвеси коллекционных штаммов близкородственных микроорганизмов концентрацией Ы09 м.к./мл. Получены отрицательные результаты с взвесями: B. abortus - 2 штамма, B. melitensis - 2, B. suis - 1, E. coli - 2, S. ty-phimurium - 1, Y. pestis - 1, Y. enterocolitica - 1, что указывает на достаточно высокую специфичность
ИХ тест-системы - «ИХ тест Е tularensis».
На втором этапе проведен сравнительный анализ чувствительности ИХ тест-системы - «ИХ тест Е Ш-larensis» с РНГА, РНАт и ТИФА на взвесях штаммов туляремийного микроба, выращенных на Ft-агаре. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, наиболее чувствительным методом является ТИФА. «ИХ тест Е tularensis» и РНГА уступают по чувствительности ТИФА, но имеют более высокую чувствительность, чем РНАт.
На третьем этапе испытаний иммунохромато-графических тестов и полосок ретроспективно исследовано 36 пулов иксодовых клещей из природного очага туляремии степного типа на территории Ставропольского края. Положительные результаты получены в 9 случаях и только в тех пробах, где через биопробу или методом прямого посева был выделен возбудитель туляремии (табл. 2).
Положительные иммунохроматографические реакции зарегистрированы с суспензией иксодовых клещей из Грачевского района во время эпизоотологиче-ского обследования весной 2010 г., а также при ретроспективном анализе замороженных суспензий иксодо-вых клещей, оставшихся после эпизоотологического обследования Изобильненского и Красногвардейского районов в 2008 г. Положительные результаты в имму-нохроматографических реакциях с «ИХ тест Е шШг-ensis» и «Тест-полосокой Е tularensis» соответствовали положительным результатам в РНГА и ТИФА. По данным РНГА, концентрация возбудителя туляремии в этих суспензиях колебалась от 107 до 10 8 м.к. и выше. Полученные нами данные подтверждают сделанное ранее заключение о том, что от личинки до упитанной половозрелой самки количество туляремийных бактерий может увеличиться в клеще в 1000-10000 раз и достигнуть 10 млрд м.к. [3].
Учитывая корреляцию положительных результатов «ИХ тестов Е tularensis» и «Тест-полосок Е tularensis» для экспресс-выявления и идентификации возбудителя туляремии с наличием живого возбудителя туляремии в пулах суспензий иксодовых клещей, можно рекомендовать их использовать для
Таблица 1
Сравнительный анализ чувствительности «ИХ тест К Ш1агет1в» (ИХТ), РНГА, РНАт и ТИФА при исследовании взвесей штаммов К Ш1агвт1$
Наименование штамма Результаты серологических реакций при различных концентрациях взвесей, м.к./мл
1108 1107 1106
Е tularensis Иolarctica 3254 РНАт, ИХТ, ТИФА
ИХТ, ТИФА, РНГА ТИФА, РНГА
Е tularensis Иolarctica 310 РНАт, ИХТ, ТИФА
ИХТ, ТИФА, РНГА ТИФА, РНГА
Е tularensis Иolarctica 13/1 РНАт, ИХТ, ТИФА
ИХТ, ТИФА, РНГА ТИФА, РНГА
Е tularensis Иolarctica 7 (с-52) РНАт, ИХТ, ТИФА
ИХТ, ТИФА, РНГА ТИФА, РНГА
Таблица 2
Результаты иммунохроматографических реакций с пулами иксодовых клещей, от которых выделены культуры возбудителя туляремии
Дата сбора эктопаразитов Адрес Вид эктопаразита Состав пула № штамма Francisella tularensis Дата выделения культуры и метод ИХТ ИХП
23.03.08 Изобильненский р-н, около ст. Новотроицкая D. reticulatus 12$ С-89 14.04.08 через биопробу + +
23.03.08 Изобильненский р-н, около г. Солнечнодольск D. reticulatus 3? С-87 11.04.08 через биопробу + +
23.03.08 Изобильненский р-н, около г. Солнечнодольск D. reticulatus 23? С-90 14.04.08 через биопробу + +
24.03.08 Красногвардейский р-н, при въезде в с. Покровское D. reticulatus 17?. С-91 14.04.08 через биопробу + +
24.03.08 Красногвардейский р-н, при въезде в с. Покровское D. reticulatus 10$ С-92 14.04.08 через биопробу + +
24.03.08 Красногвардейский р-н, при въезде в с. Покровское D.marginatus 11? С-88 11.04.08 через биопробу + +
24.03.08 Красногвардейский р-н, около с. Покровское D. reticulatus 9$ С-93 14.04.08 через биопробу + +
24.03.08 Красногвардейский р-н, около с. Покровское D. reticulatus 22? С-9б 16.04.08 через биопробу + +
26.03.10 Грачевский р-н, около ст. Старомарьевка D. marginatus 3? 34 16.04.10 прямой посев + +
Примечание. ИХТ - реакция с «ИХ тестом F. tularensis» ; ИХП - реакция с «Тест- полоской F tularensis»; (+) - положительный результат реакции.
предварительного отбора проб, перспективных для последующего изучения бактериологическим и биологическим методами, а также подтверждения наличия туляремийного антигена в пулах.
На четвертом этапе были исследованы с использованием «ИХ тестов F. tularensis» и «Тест-полосок F. tularensis» суспензии внутренних органов белых мышей, павших после введения им подкожно по 0,2-0,5 мл суспензий пулов иксодовых клещей. Положительные результаты в 100 % случаев соответствовали пробам, в которых был обнаружен возбудитель туляремии.
Таким образом, учитывая методическую простоту постановки реакций с «ИХ тестом F. tularensis» и «Тест-полосками F. tularensis» для экспресс-выявления ЛПС - антигена возбудителя туляремии, возможность получения результата в течение 1520 мин, можно рекомендовать их использовать для изучения проб, в которых возможно присутствие антигена в заведомо большой концентрации. К таким пробам относятся взвеси из штаммов возбудителя туляремии, выделяемых на территории природных очагов, суспензии внутренних органов павших био-пробных животных и суспензии пулов иксодовых клещей. Пулы следует предварительно исследовать методом ТИФА, т.к. эта реакция имеет более высокую чувствительность.
Целесообразно использовать иммунохромато-графические реакции для предварительного отбора проб, перспективных для последующего изучения бактериологическим и биологическим методами, а также подтверждения наличия туляремийного антигена в исследуемом материале. Вышеуказанные тест-системы обеспечивают воспроизводимость результатов анализа и их специфичность.
СПИСОК ЛИТЕ?АТУ?Ы
-II групп па-
1. Безопасность работы с микроорганизмами I-II тогенности (опасности): СП 1.3.1285-03. М.; 2003. 30с.
2. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. М.: Медицина: 2009. 472 с.
3. Олсуфьев Н.Г., Дунаева Т.Н. Эпизоотология (природная очаговость) туляремии. В кн.: Туляремия. М.; 1960. С. 136-206.
4. Эпидемиологическийнадзор затуляремией. МУ 3.1.200705. М.; 2005. 24 с.
Источники 5-7 см. в References.
References
1. [Safety of work with microorganisms of I-II pathogenicity groups]. Sanitary Rules.SR. 1.3.1285-03]. M.,2003; 30p.
2. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Particularly Dangerous Infectious Diseases. Practical Guidelines]. M.; 2009. 472p.
3. Olsuf’ev N.G., Dunaeva T.N. [Epizootiology (natural focality) of Tularemia] in [Tularemia]. M., i960. 459p.
4. [Epidemiological surveillance of tularemia]. MU 3.1.2007-05. M., 2005. 24p.
5. Berdal B.P., Mehl R., Haaheim H., L0ksa M., Grunow R., Burans J., Morgan C., Meyer H. Field Detection of Francisella tularensis. Scand. J. Infect. Dis. 2000; 32:287-91.
6. Brandonisio O., Fumarola L., Maggi P., Cavalliere R., Spinelli R., Pastore G. Evaluation of a rapid immunochromatographic test for serodiag-nosis of visceral Leishmaniasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2002; 21:461-4.
7. Grunow R., Splettstoesser W., McDonald S., Otterbein C., O’Brien T., Morgan C., Aldrich J., Hofer E., Finke E.J., Meyer H. Detection of Francisella tularensis in biological specimens using a capture enzyme-linked immunosorbent assay, an immnochromatographic handheld assay, and a PCR. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000; 7(1):8б-90.
Authors:
Zaitsev A.A., Gnusareva O.A., Tsareva N.S., Ostapovich V.V., Borzdova I.Yu., Kulichenko A.N. Stavropol Research Anti-Plague Institute. 13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russia. E-mail: snipchi@mail.stv.ru
Об авторах:
ЗайцевА.А., Гнусарева О.А., ЦареваН.С., ОстаповичВ.В., Борздова И.Ю., Куличенко А.Н. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15. E-mail: snipchi@mail.stv.ru
Поступила 02.04.12.
