CC BY
13
https://doi.org/10.17116/molgen201937041192
Аппликационный лазерный перенос наночастиц металлов на бактериальные биопленки
© Э.Р. ТОЛОРДАВА12, С.И. КУДРЯШОВ2, А.А. НАСТУЛЯВИЧУС2, А.А. ИОНИН2, Ю.М. РОМАНОВА13
'Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф. Гамалеи, Москва, Россия, 123098;
2Физический институт им. П.Н. Лебедева РАН, Москва, Россия, 119991;
3 ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия, 119991 Резюме
Впервые показано эффективное использование метода аппликационного лазерного переноса наночастиц серебра и меди в борьбе с биопленками, формированными на твердой подложке. При этом экспериментально подтверждено, что этот эффект не связан с воздействием самого лазера. Предложенный нами метод позволяет повысить локальность, доступность и эффективность разрушения биопленки за счет бактерицидного эффекта металлических наночастиц при незначительном прямом лазерном воздействии на биопленку.
Ключевые слова: бактериальные биопленки, наночастицы металлов, лазерная абляция. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Толордава Э.Р. — e-mail: tolordava@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-9920-2432 Кудряшов С.И. — e-mail: genes 2007@yandex.ru Настулявичус А.А. — e-mail: genes 2007@yandex.ru Ионин А.А. — e-mail: genes 2007@yandex.ru
Романова Ю.М. — e-mail: genes 2007@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-8547-1711
АВТОР, ОТВЕТСТВЕННЫЙ ЗА ПЕРЕПИСКУ: Толордава Э.Р. — e-mail: tolordava@yandex.ru
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Толордава Э.Р., Кудряшов С.И., Настулявичус А.А., Ионин А.А., Романова Ю.М. Аппликационный лазерный перенос наночастиц металлов на бактериальные биопленки. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):192-195. https://doi.org/10.17116/ molgen201937041192
Application laser transfer of metal nanoparticles to bacterial biofilms
E.R. TOLORDAVA12, S.I. KUDRYASHOV2, A.A. NASTULYAVICHUS2, A.A. IONIN2, YU.M. ROMANOVA13
4N.F. Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, 123098 Moscow, Russia; 2Lebedev Physical Institute, 119991, Moscow, Russia;
3I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, 119991, Moscow, Russia Abstract
The effective use of the method of application laser transfer of silver and copper nanoparticles in the fight against biofilms formed on a solid substrate was shown for the first time. At the same time, it is experimentally confirmed that this effect is not associated with the influence of the laser itself. The proposed method allows us to increase the locality, availability and efficiency of biofilm destruction due to the bactericidal effect of metal nanoparticles with a slight direct laser effect on the biofilm.
Keywords: bacterial biofilms, metal nanoparticles, laser ablation. INFORMATION ABOUT AUTHORS:
Tolordava E.R. — e-mail: tolordava.eteri@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-9920-2432 Kudryashov S.I. — e-mail: sikudr@lebedev.ru; https://orcid.org/0000-0001-6657-2739 Nastulyavichus А.А. — e-mail: ganuary_moon@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-2063-4874 Ionin А.А. — e-mail: aion@lebedev.ru; https://orcid.org/0000-0003-3119-4592 Romanova Yu.M. — e-mail: genes2007@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-3119-4592
CORRESPONDING AUTHOR:
Tolordava E.R.- e-mail: tolordava.eteri@yandex.ru
TO CITE THIS ARTICLE:
Tolordava ER, Kudryashov SI, Nastulyavichus AA, Ionin AA, Romanova YuM. Application laser transfer of metal nanoparticles to bacterial biofilms. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2019;37(4):192-195 (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen201937041192
Введение
Бактериальная биопленка — сложноорганизован-ная форма существования бактерий, продуцирующих внеклеточный матрикс [1, 2]. Способность к образованию биопленок доказана у большинства микроорганизмов, различия заключаются лишь в степени выраженности процесса. Поиск современных средств борьбы с биопленками ведется в разных направлениях. За последние годы получены многочисленные экспериментальные данные, имеющие фундаментальное и практическое значение [3—6]. Наряду с традиционными и инновационными агентами появились нанотехнологические разработки, проявляющие бактерицидное действие, основанные на новых принципах, отчасти заимствованных из живой природы [7, 8]. Было показано, что благодаря плотной текстуре из нанопичков, крылья цикад обладают не только гидрофобными свойствами, но и механическим бактерицидным эффектом, повреждая мембраны бактерий остриями нанопичков («наномеханиче-ский эффект шипа»). Искусственные нанопичковые структуры, сформированные под действием лазерного излучения на поверхностях самых разных материалов — металлов, полупроводников, полимеров, в последние годы также показали высокую эффективность предупреждения образования биопленки на нанотекстурированных поверхностях [9, 10]. В основе бактерицидных свойств наночастиц лежат разные механизмы в зависимости от того, из каких материалов их получают. Химический состав, размер и дзета-потенциал больше всего влияют на антибактериальный эффект частиц. К сожалению, при длительной инокуляции (сутки и более) бактерии способны формировать биопленки практически на любой структурированной поверхности.
Большинство разрабатываемых традиционных и инновационных методов борьбы с бактериальными биопленками направлено на предупреждение (профилактику) формирования биопленок. На самом деле, особо актуальной задачей современной медицинской микробиологии является поиск средств борьбы против уже сформировавшихся бактериальных пленок.
Материал и методы
Бактериальные штаммы. Клинические изоляты бактерий Staphylococcus aureus и Pseudomonas aerugi-
nosa из коллекции лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов ФГБУ НИЦЭМ им. Гамалеи.
Питательные среды: питательный LB-бульон («Difco», США).
Для приготовления питательного агара LB добавляли 1% агар.
Для получения бактериальных биопленок, ночную бульонную культуру бактерий разводили 1:100 в LB. Разведенную культуру вносили в пробирки с кусочками стекла размером 10x10 мм толщиной 1 мм. Инкубировали в термостате при 37 °С в течение 24 ч при покачивании 10 раз в 1 минуту, с углом наклона 4°.
Для разрушения биопленок использовали раствор ДНКазы в физиологическом растворе.
Металлические пленки (серебра, золота и меди) напылялись на пластиковую подложку методом магнетронного напыления в атмосфере аргона.
Перенос металлических пленок в виде наночастиц на бактериальные биопленки осуществляли с помощью волоконного наносекундного лазера HTF MARK (Булат) на ионах Yb3+ (длина волны: 1064 нм, длительность импульса на полувысоте: 120 нс, максимальная энергия в импульсе: 1 мДж, частота повторения импульсов до 80 кГц). Излучение фокусировалось гальвано-сканнером с фокусным расстоянием объектива 160 мм.
Результаты
Образцы стекол с прикрепленными на их поверхности суточными бактериальными биопленками переносили на лазерное устройство и напыляли нано-частицами серебра, меди и золота (см. рисунок).
Пластик с напыленной на него тонкой (~120 нм) металлической (Au, Ag, Cu) пленкой подвергали воздействию лазерного излучения с энергией в импульсе: 0,2 мДж, частотой следования импульса: 20 кГц и скоростью сканирования: 1500 мм/с. Минимальный размер пятна фокусировки при этом составлял ~80 мкм. Расстояние между мишенью и стеклом с биопленкой 2 мм. Излучение фокусировалось на пленке. Возникающий в результате абляции расплав из нано-частиц отлетал от мишени и попадал на стеклянную подложку с бактериальной биопленкой, где в итоге образовывались скопления наночастиц. Прозрачная пластиковая подложка позволяет использовать для пере-
Влияние аппликационного лазерного переноса наночастиц золота, меди и серебра (с контролем по аналогичному лазерному воздействию через пластиковую подложку без металлической пленки) на значения КОЕ/мл сформированных за 24 ч биопленок
КОЕ/мл бактерий
Бактерии наночастицы наночастицы наночастицы лазер через пластик (без нативная
серебра меди золота металлической пленки) биопленка
"STaureWs о о 210 410 410
P. aeruginosa_0_0_3-107_МО7_3-1Ö7
Схема/принцип аппликационного лазерного переноса наночастиц с прозрачной подложки на биопленки патогенных микроорганизмов.
носа наночастиц из металлической пленки относительно низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение, слабо нагревающее эти наночастицы.
После переноса частиц стекла с бактериальными биопленками переносили в пробирки с физиологическим раствором ДНК-азы и интенсивно встряхивали на шейкере в течение 1 ч. Под воздействием ДНК-азы матрикс биопленки разрушается, но при этом клетки бактерий остаются невредимыми. Затем полученную суспензию титровали стандартным микробиологическим методом и для определения КОЕ (колония образующая единица) высевали на твердую питательную среду (см. таблицу).
При аппликационном лазерном переносе наночастиц серебра и меди на поверхность бактериальных биопленок патогенных микроорганизмов S. aureus и P. aeruginosa выявлена полная гибель живой суточной биопленки. При переносе золотых на-ночастиц и при воздействии лазера через пластиковую подложку без металлической пленки бактерицидного воздействия не выявлено. Эти результаты
показывают, что бактерицидность не связана с воздействием лазера и температурой наночастиц металлов. По нашему предположению эффективность метода обусловлена свойствами наночастиц серебра и меди.
На данном этапе проводятся исследования по изучению бактерицидных свойств наночастиц Se, Si и Zn, перенесенных аппликационно лазерным методом на биопленки. Также ведутся работы по изучению цитотоксичности вышеперечисленных металлов и метода. Менее токсичные наночастицы металлов будут исследованы в экспериментах in vivo.
Предложенный нами способ позволяет повысить локальность, доступность и эффективность разрушения биопленки за счет бактерицидного эффекта металлических наночастиц при незначительном прямом лазерном воздействии на биопленку.
Работа поддержана грантом РНФ №18-15-00220.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
AMTEPATYPA/REFERENCES
1. O'Toole G, Kaplan HB, Kolter R. Biofilm formation as microbial
development. Annl Rev Microbiol. 2000;54:49-79.
2. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999;284:1318-1322.
3. Water JJ, Smart S, Franzyk H, Foged C, Nielsen HM. Nanoparticle-medi-ated delivery of the antimicrobial peptide plectasin against Staphylococcus aureus in infected epithelial cells. Eur J Pharm Biopharm. 2015;92:65-73.
4. Ivanova EP, Hasan J, Webb HK, Gervinskas G, Juodkazis S, Truong VK, Wu AHF, Lamb RN, Baulin VA, Watson GS, Watson JA, Mainwaring DE,
Crawford RJ. Bactericidal Activity of Black Silicon. Nat Commun.
2013;4:2838.
5. Meerovich GA, Akhlyustina EV, Tiganova IG, Lukyanets EA, Makarova EA, Tolordava ER, et al. Novel polycationic photosensitizers for antibacterial pho-todynamic therapy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2019:1-19.
6. Kudryashov SI, Nguyen LV, Kirilenko DA, Brunkov PN, Rudenko A, Bu-sleev N, et al. Large-scale laser fabrication of anti-fouling si surface nanosheet arrays via nanoplasmonic ablative self-organization in liquid CS2 tracked by sulfur dopant. ACS Appl Nano Mater. 2018;1(6):2461-2468.
7. Duy HK Nguyen, Loebbe C, Linklater DP, Xiu Mei Xu, Vrancken N, Kat-kus T, et al. The idiosyncratic self-cleaning cycle of bacteria on regularly arrayed mechano-bactericidal nanostructures. The Royal .Society of Chemistry. 2019;1:1-8.
8. Linklater DP, Juodkazis S, Ivanova EP. Nanofabrication of mechano-bac-tericidal surfaces. Nanoscale. 2017;9:16564-16585.
9. Shalom Y, Perelshtein I, Perkas N, Gedanken A and Banin E. Catheters coated with Zn-doped CuO nanoparticles delay the onset of catheter-associated urinary tract infections. Nano Res. 2017;10:520-533.
10. Epperlein N, Menzel F, Schwibbert K, Koter R, Bonse J, Sameith J, Krüger J, Toepel J. Influence of femtosecond laser produced nanostructures on biofilm growth on steel. Applied Surface Science. 2017;418:420-424.
Поступила в редакцию 15.09.19 Received 15.09.19 После доработки 13.10.19 Revised 13.10.19 Принята к публикации 13.10.19 Accepted 13.10.19
С прискорбием сообщаем, что после долгой болезни скончался постоянный член редколлегии журнала «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» д.биол.н., проф., член-корреспондент РАЕН Владимир Наумович Гершанович. С 1969 по 2004 г. он заведовал лабораторией генетической регуляции биохимических процессов в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, был автором более 200 научных публикаций и 3 монографий.
Выражаем соболезнования семье покойного, его многочисленным ученикам и коллегам.
