32APPLICATION EFFICIENCY OF BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM 1 AND LACTOBACILLUS REUTERI DSM 17938 CELL-FREE EXTRACTS IN VIVO
Knysh Oksana,
Senior researcher, Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine, laboratory of respiratory infections prevention, Ukraine, Kharkiv, ORCIDID: https://orcid.org/0000-0002-4105-1299 Pogorila Marina,
Senior researcher, Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine, laboratory and clinical department of molecular immunopharmacology, Ukraine, Kharkiv, ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-1783-9772 Polianska Valentina,
Assistant Professor, Ukrainian Medical Stomatological Academy, microbiology, virology and immunology department, Ukraine, Poltava, ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-8727-9029 Zachepylo Svitlana,
Assistant Professor, Ukrainian Medical Stomatological Academy, otorhinolaryngology with ophthalmology department, Ukraine, Poltava, ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-2194-0611
DOI: https://doi.org/10.31435/rsglobal_sr/30062020/7137
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received 21 April 2020 Accepted 08 June 2020 Published 30 June 2020
KEYWORDS
probiotic cell-free extracts, Bifidobacterium bifidum 1, Lactobacillus reuteri DSM 17938,
antibiotic-induced dysbiosis, murine model of intestinal staphylococcal infection.
Insufficient efficiency and safety of cellular probiotics encourages the search for new effective means of correction of microecological disorders. Most of the beneficial effects of probiotics are due to the biological activity of their structural components and metabolites. Recently, great hope is pinned on postbiotic products as a means of restoring the balance of intestinal microbial populations. The data obtained in this experimental study demonstrate the ability of cell-free extracts from Bifidobacterium bifidum 1 and Lactobacillus reuteri DSM 17938 cultures, cultivated in their own disintegrates supplemented with ascorbic acid, to provide anti-infection protection and correct microecological disturbances at modeling an infectious process against a background of antibiotic-induced dysbiosis in mice. The beneficial effects of cell-free extracts showed up in the acceleration of the pathogen elimination and an increase in the number of representatives of the positive intestinal microbiota. The results of the study justify the need for further clinical trials to determine the therapeutic efficacy of cell-free extracts when included in the protocols of dysbiosis treatment.
Citation: Knysh Oksana, Pogorila Marina, Polianska Valentina, Zachepylo Svitlana. (2020) Application Efficiency of Bifidobacterium Bifidum 1 and Lactobacillus Reuteri DSM 17938 Cell-Free Extracts in Vivo. Science Review. 5(32). doi: 10.31435/rsglobal_sr/30062020/7137
Copyright: © 2020 Knysh Oksana, Pogorila Marina, Polianska Valentina, Zachepylo Svitlana. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) or licensor are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.
Робота е фрагментом НДР «Мшробюлопчна характеристика нових структурно-метаболггаих комплекав лакто- та бiфiдо-пробютикiв» 0119Ш00686.
Вступ. Поширешсть дисбактерiозiв серед населення Схщно! Свропи сягае 90% [1]. До найбшьш частих причин розвитку кишкового дисбюзу належать шфекцп, вживання лшв та незбалансована дiета [2, 3]. Особливе значення мае неращональне застосування антибютиюв, яке сприяе не лише поширенню антибютик-асоцшованих дисбактерiозiв серед населення, але й
формуванню у MiKpoopraHi3MiB стшкосп до антибiотикiв [4]. Збшьшення кiлькостi резистентних до антишкробних 3aco6iB штамiв призводить до зростання захворюваностi та смертност вiд шфекцшних захворювань [5].
Основнi мiкробiологiчнi ознаки дисбюзу: зменшення кiлькостi корисних бактерш (Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus та ш), експансiя патобiонтiв (Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Staphylococcus та ш), зменшення мiкробного рiзноманiття та порушення мiкробного метаболiзму [3, 6]. Мшроеколопчний дисбаланс супроводжуеться порушеннями механiзмiв вродженого та адаптивного iмунного захисту, розвитком запалення в слизовш оболонцi кишечника з активацiею процешв оксидацп, ослабленням i пiдвищеною проникшстю кишкового бар'еру для продуктiв запалення, мшробних токсинiв, пiдвищенням ризику мшробно! транслокацп та метаболiчними змiнами запального характеру [6]. Зазначеш поди е важливою патогенетичною ланкою розвитку не лише запальних захворювань кишечника, а й метаболiчних (дiабету та ожирiння), алерпчних, автоiмунних, серцево-судинних, нейродегенеративних, ракових та шших захворювань [7]. Недостатня ефектившсть, безпечнiсть та складнiсть юнуючих методiв корекцп мiкроекологiчних порушень робить необхщним продовження пошуку нових ефективних засобiв. Бiльшiсть сприятливих ефектiв пробютиюв обумовленi бiологiчною активнiстю 1х структурних компонентiв та продуктiв обмiну [8, 9]. Тому в останш роки велик сподiвання покладаються на постбютичш продукти як засоби вiдновлення балансу мшробних популяцiй кишечника, запобiгання i лiкування iнфекцiй шляхом збiльшення колошзацп слизових оболонок корисними для здоров'я коменсальними видами бактерш та посилення захисних властивостей iмунноl системи. А пробютичш бактерп розглядають як щнне джерело бiологiчно активних дериватiв [10, 11].
Для налагодження промислового виробництва постбютичних засобiв необхiдними е науково i економiчно обгрунтований спосiб отримання пробiотичних похiдних та достатня доказова база !х бюлопчно1 активностi, лшувально! ефективностi та безпеки. Нами були розроблеш оригiнальнi способи одержання деривата пробiотичних штамiв Bifidobacterium bifidum 1 i Lactobacillus reuteri DSM 17938 та в експериментах in vitro отримаш даш, що демонструють високу шпб^орну щодо патобiонтiв, стимуляторну щодо пробiотичних бактерiй та iмуномодуляторну активнють дериват-вмiсних безклiтинних екстрактiв (БКЕ) [12, 13, 14, 15]. Зважаючи на те, що активнють in vitro не можна ототожнювати з актившстю in vivo, перед нами постало завдання дослiдити ефективнiсть застосування БКЕ при шфекцшному процесi та дисбiозi у лабораторних тварин.
Мета дослщження. Встановити здатнiсть БКЕ з культур B. bifidum 1 та L. reuteri DSM 17938 з високою шпб^орною актившстю щодо патобюнта здшснювати протиiнфекцiйний захист та корегувати мшроеколопчш порушення in vivo при експериментальному моделюванш кишково! шфекцп у мишей на rai антибiотик-асоцiйованого дисбiозу.
Матерiали i методи. Дослiдження з використанням лабораторних тварин були проведет на базi вiварiю ДУ «IMI НАМН» у вiдповiдностi до положень втизняних i мiжнародних бiоетичних документiв: IV «Свропейсько1 конвенцп про захист хребетних тварин, як використовуються в експериментальних та iнших наукових цiлях» (Страсбург, ETS 123, 1986), законодавчих документа Украши з проведення експериментiв на тваринах: «Загальш етичнi принципи експеримента на тваринах», ухваленi Першим нащональним конгресом з бiоетики (20.09.2001), методичш рекомендацп [16] та були ухвалеш Комiтетом з бiоетики 1нституту. Тварини утримувалися у стандартних умовах вiварiю. В дослiдженнi були задiянi 44 мишi обох статей, вiком 2 мюящ, вагою 22,0 ± 2,0 г, розподшеш на 4 групи: 2 дослщш i 2 контрольш (позитивна i негативна), по 11 тварин у кожнш У тварин позитивное' контрольно1 та дослiдних груп було вщтворено дисбактерiоз.
Для вщтворення антибiотик-асоцiйованого дисбактерiозу кишечника у мишей в експерименп було обрано споаб, описаний i запатентований Дармовим I. В. зi спiвавторами [17]. Споаб моделювання дисбактерiозу передбачав щоденне пероральне одноразове введення тваринам впродовж 5 дiб 0,1 мл розчину антибютика з групи амiноглiкозидiв - гентамщину у дозi, що перевищувала добову терапевтичну дозу амiноглiкозидiв для мишей при парентеральному введены бiльш тж у 4,8 рази i становила 2,9 мг (29 мг гешашцину на 1 мл iзотонiчного розчину натрда хлориду). Гентамiцин при пероральному введеннi практично не всмоктуеться в шлунково-кишковому трактi i викликае мiкроекологiчнi порушення в кишечнику. Зпдно з лiтературними
даними, тсля попередньо! in^^i! антибiотиками дисбюзу пероральне введення мишам будь-якого штаму Staphylococcus aureus у дозi 107 КУО викликае iнфекцiйний процес з пщгострим перебiгом [18]. Дизайн нашого експерименту передбачав iнфiкування мишей двох дослщних та позитивно! контрольно! групи пероральним введениям 0,5 мл суспензп S. aureus АТСС 25 9 23 (3х108 КУО/мл) через двi доби тсля закiичеиня введення аитибiотика.
Мишi двох дослщних груп щоденно отримували перорально БКЕ МВА та MLA у дозi 100 мкг. БКЕ МВА був отриманий з культури B. bifidum 1, а БКЕ MLA з культури L. reuteri DSM 17938, що культивувалися у власних дезштегратах з додаванням аскорбшово! кислоти (20 мг/мл) методом, описаним рашше [12].
У дослщних та позитивнш контрольнш групах тварин реестрували клшчний перебт захворювання. Критерiями оцiнки перебту iнфекцiйного процесу були: змiни поведшки та втрата маси тiла тварин, зменшення об'ему спожито! !жi, ознаки дисфункци кишечника (дiарея або пом'якшення фекалiй). Неiнфiкованих та iнфiкованих мишей зважували перед iнфiкуваниям та кожш 24 години впродовж 7 дшв пiсля iнфiкування. Розраховували показник маси тша за формулою: М/Мп х 100 %, де М - маса тварин в день зважування, Мп - маса тварин в день шфшування.
Змши складу кишково! мшрофлори у мишей, спричинених дисбюзом та iнфекцiйним процесом, зокрема, за умови введення БКЕ, дослщжували за допомогою бактерiологiчного методу. Бактерiологiчне дослщження фекалiй здiйснювали перед вiдтворениям антибютик-асоцiйованого дисбактерiозу, через 2 доби тсля заюнчення введення антибiотика, на 2-у, 3-ю, 5-у, 7-у добу перебту змодельованого шфекцшного процесу на rai антибiотик-асоцiйованого дисбактерiозу. Визначали загальну кiлькiсть бактерiй та кiлькiсть окремих представникiв кишково! мiкрофлори: бiфiдо-, лактобактерш i стафiлококiв у фекалiях. Вщбраш вiд кожно! тварини фекали зважували та суспендували у стерильному iзотонiчному розчинi натрiю хлориду (1г : 10 мл). Готували ряд десятикратних розведень суспензп фекалш та здшснювали висiв у поживнi середовища: тюглшолеве середовище, середовище Манна-Рогоза-Шарпа (Biolife; Ггатя); бiфiдум-середовище («Фармактив», Укра!на) i жовтково-сольовий агар. Поави iнкубували впродовж 24-48 годин за температури 37°С, тсля чого проводили тдрахунок колонiй, що виросли. З урахуванням маси фекалш вщ кожно! тварини та числа колонш, що виросли, розраховували кшьюсть бактерш на 1 г фекалш (КУО/г).
Отримаш показники в таблицях i на рисунках представленi як середне значення зi стандартним вщхиленням (x ± SD), n - вщповщае кiлькостi дослiдних тварин. Результати анатзували за допомогою однофакторного дисперсшного аналiзу ANOVA з подальшим застосуванням t-критерiю Стьюдента з корекцiею Бонферрош. Значення р < 0,05 вважали статистично значущим.
Результати дослiджень.
Отримаш на 2-у добу тсля закшчення введення гентамщину результати бактерiологiчного дослщження фекалш свщчили про розвиток дисбактерюзу кишечника у мишей (табл. 1). В середньому на 4 порядки зменшилася загальна кшьюсть бактерш (до ~ 105 КУО/г фекалiй), кшьюсть бiфiдобактерiй (до ~ 102 КУО/г фекалш), лактобактерш (до ~ 104 КУО/г фекалiй) та спостерiгалася поява стафшокоюв (до ~ 102 КУО/г фекалш).
Таблиця 1. Кiлькiсть життездатних бактерш у фекалiях здорових мишей та у мишей з дисбюзом на 2-у добу тсля закшчення введення антибютика, (x ± SD), n=11_
Кишкова мшрофлора Групи тварин
здоровi з дисбюзом
Заг. кшьюсть бактерш, КУО/г фекалш 5,82 ± 0,51 х 109 2,3 ± 0,21 х 105*
Бiфiдобактерi!, КУО/г фекалш 6,19 ± 0,54 х 106 2,2 ± 0,17 х 102*
Лактобактерн, КУО/г фекалiй 2,30 ± 0,18 х 108 1,62 ± 0,09 х 104*
Стафiлококи, КУО/г фекалш - 1,0±0,12 х 102
Примiтка. * - вщмшносп статистично значущi порiвияно з показниками у груш здорових тварин.
Як вщомо, кштчт прояви дисбiозу можуть значно варiювати. В нашому експеримент ознаки дисфункци кишечка або змши поведшки тварин не спостер^алися. Негативним наслщком дисбактерiозу е формування сприятливого пiдrрунтя для розвитку iнфекцiйного процесу в
кишечнику. Наступним етапом експерименту було моделювання у мишей шфекцшного процесу в кишечнику на rai антибiотик-асоцiйованого дисбiозу. Пюля iнфiкування S. aureus у мишей групи позитивного контролю спостерiгалося значне збшьшення видiлення стафiлококiв з фекатями (рис. 1). На 2-у добу бактерювидшення становило ~ 108 КУО/г фекалш. Iнтенсивнiсть видiлення стафiлококiв з часом зменшувалася, досягаючи на 7-у добу ~ 103 КУО/г фекалiй. За умови застосування БКЕ MBA та MLA показники бактерiовидiлення були на 2-3 порядки нижними порiвняно з вщповщними показниками у груш позитивного контролю протягом усього перюду спостереження. На вiдмiну вiд групи позитивного контролю, в обох дослщних групах тварин на 7-у добу видшення стафiлококiв з фекалiями було вщсутшм.
Рис. 1. Вплив БКЕ на динам1ку видшення стафтокоюв з фекал1ями у тварин, ШфЫованих культурою S. aureus на rnni антиб1отик-асоцтованого дисб1озу, (x ± SD), n=11.
Примтка. ПК - група тварин позитивного контролю; MBA, MLA - до^дт групи тварин, яким вводили БКЕ; вiдмiнносmi статистично значущi порiвняно з: * - показниками у грут ПК; # - показниками у до^днт груш тварин, яким вводили БКЕ МВА.
Загальна кшькють бактерш у фекалiях мишей позитивно! контрольно! групи впродовж всього перюду вщ шфшування до 7-! доби зменшувалася з ~ 108 КУО/г фекалш до ~ 105 КУО/г. Кшькють бiфiдо- та лактобактерш у фекалiях мишей групи позитивного контролю впродовж всього перюду спостереження була стабшьною i не перевищувала ~ 102 та ~ 104 КУО/г фекалш, вщповщно.
Введення дослiдних екстракпв iнфiкованим S. aureus мишам iз антибютик-асоцiйованим дисбiозом сприяло пщвищенню загально! кiлькостi бактерiй: до ~ 107 КУО/г фекалiй за умови застосування БКЕ MBA та до ~ 108 КУО/г фекалiй за умови застосування БКЕ MLA. У разi введення БКЕ МВА кшькють бiфiдобактерiй зросла з ~ 102 до ~ 104 КУО/г фекалш, а кшькють лактобактерш з ~ 104 до ~ 106 КУО/г фекалш За умови застосування БКЕ MLA кшькють бiфiдо- i лактобактерш до 7-! доби збшьшилася на 3 порядки, досягаючи кшькост ~ 105 та ~ 107 КУО/г фекалiй, але не досягаючи !х кiлькостi у здорових тварин. Очевидно, для повного вщновлення кiлькостi бiфiдо- i лактобактерiй у мишей необхщним було бiльш тривале введення БКЕ в експеримешг Але тенденцiя до вщновлення нормального мшроеколопчного балансу у кишковому бiотопi дослiдних тварин була достатньо вираженою.
При порiвняннi ефективносп застосування БКЕ з B. bifidum та i L. reuteri за кшькюними показниками бактерiовидiлення та вщновлення вмюту позитивно! мiкрофлори виявленi очевидш переваги БКЕ MLA перед БКЕ МВА. За умови застосування БКЕ MLA спостершалися: на порядок нижчий стушнь бактерювидшення, вищий ступiнь вщновлення загально! кшькосп бактерiй, зокрема, лакто- i бiфiдобактерiй (табл. 2). Данний ефект можна пояснити бшьш високим шпб^орним потенцiалом БКЕ MLA по вщношенню до S. aureus та бшьш потужною здатнiстю стимулювати рют пробiотично! мiкрофлори.
Таблиця 2. Кшьюсть життездатних бактерiй у фекалiях рiзних груп мишей на 7-у добу стафшококово! iнфекцi! на rai антибiотик-асоцiйованого дисбiозу (x ± SD), n=11_
Групи тварин Кiлькiсть бактерiй, КУО/г- фекалiй
загальна бiфiдобактерiй лактобактерiй
1нтактш (НК) 4,77 ± 0,38 х 109 6,54 ± 0,67 х 106 3,40 ± 0,2 х 108
Дисбюз + iнфекцiя (ПК) 1,33 ± 0,11 х 105# 2,9 ± 0,22 х 102# 2,17 ± 0,16 х 104#
Дисбюз + iнфекцiя + БКЕ МВА 3,9 ± 0,17 х 107#* 3,4 ± 0,25 х 104#* 5,71 ± 0,43 х 106#*
Дисбюз + шфекщя + БКЕ МLА 6,8 ± 0,38 х 108#* 2,2 ± 0,17 х 105#* 4,62 ± 0,09 х 107#*
Примiтка. Вщмшносп статистично значущi порiвняно з: # - показниками у груш тварин НК, * - показниками у груш тварин ПК.
В ходi дослщження у тварин позитивно! контрольно! групи спостерталося статистично значуще зниження ваги з 1-! по 5-у добу шсля iнфiкування, i3 нормалiзацiею даного показника тяжкостi перебiгу шфекцшного процесу на 7-у добу спостереження (рис. 2). В 1-у та 2-гу добу у тварин ще! групи спостерiгали рiдкi випорожнення, на 5-у добу - пом'якшення фекалш В 1-у добу пiсля шфшування рееструвалося деяке зниження об'ему споживання !ж1. Порiвняно з групою позитивного контролю у тварин дослщних груп, яю перорально отримували БКЕ МВА та MLA, спостерталося достовiрно менше зниження маси тiла в критичш першi днi iнфекцiйного процесу, не спостерталося змiн поведiнки та консистенцп фекальних мас.
106
104 ^-X-
IS ^
96 \ ■ MLA
94 ^— ■ ПК
92
90
88
0 доба I доба 2 доба 3 доба 5 доба 7 доба
Рис. 2. Вплив БКЕ МВА та MLA на динам1ку маси тыа мишей, тфтованих S. aureus на тл1 антиб1отик-асоцтованого дисб1озу, (x ± SD), n=11.
Обговорення результа^в. Таким чином, результати експериментального дослщження дозволяють стверджувати, що БКЕ з культур B. bifidum та L. reuteri, отриманих при культивуванш у власних дезштегратах з додаванням аскорбшово! кислоти, е перспективними засобами нормалiзацi! складу кишково! мшрофлори. Про це свщчить виявлена здатшсть БКЕ прискорювати елiмiнацiю збудника шфекцшного процесу, сприяти вiдновленню кiлькiсного вмюту представникiв позитивно! мiкрофлори кишечника та полегшувати перебiг iнфекцiйного процесу. Одержат в даному дослiдженнi ефекти добре узгоджуються з отриманими нами рашше результатами вивчення бактерiотропних та iмунотропних властивостей БКЕ i, очевидно, обумовлеш здатнiстю БКЕ стимулювати пролiферацiю та бiоплiвкоутворення власно! «корисно!» iндигенно! мшрофлори, сприяти !! приживленню у бiоплiвках, пригнiчувати пролiферацiю умовно-патогенних бактерiй та !х здатнiсть до колонiзацi!, а також справляти антиоксидантний вплив та чинити iмуномолуляторну дда на кл^ини вродженого iмунiтету. Результати нашого дослщження пщтверджують той факт, що для отримання пробютичних ефектiв не обов'язковим е збереження цшсносп i життездатносп пробiотичних бактерiй. Така
думка вже висловлювалася шшими авторами i була не безтдставною [19, 20]. Низка дослiдникiв при застосуванш термiчно iнактивованих пробiотичних бактерш, супернатаппв та бактерiальних екстрактiв отримали пробiотичнi ефекти на рiвнi кишечника [21, 22]. Очевидно, що щ ефекти були обумовленi бiологiчною актившстю (iмуномодуляторною, протизапальною та iнгiбiторною щодо патогенiв) структурних компонентiв та метаболтв, що вивiльнялися зi зруйнованих кл^ин пiд час дезштеграцп або продукувалися бактерiями пiд час культивування.
Висновки. Безклгтинш екстракти з культур B. bifidum 1 та L. reuteri DSM 17938, одержат з додаванням аскорбшово! кислоти на еташ культивування, яю в попереднiх експериментах in vitro виявили високу iнгiбiторну актившсть щодо патобiонтiв, в даному дослщженш продемонстрували здатнiсть здiйснювати протиiнфекцiйний захист та корегувати мшроеколопчш порушення in vivo при експериментальному моделюваннi кишково! шфекцп на тлi антибiотик-асоцiйованого дисбюзу у мишей. Кориснi ефекти безклгтинних екстрактiв полягали в прискореннi елiмiнацi! збудника шфекцп та збiльшеннi чисельност представникiв позитивно! мiкробiоти кишкового бютопу. Результати дослiдження обгрунтовують необхiднiсть проведення подальших клiнiчних випробувань для визначення ефективностi безклiтинних екстрактiв при включенш !х у протоколи лiкування дисбактерюзу.
Конфлiкт штереав вiдсутнiй.
Л1ТЕРАТУРА
1. Дуда, О. К., Бойко, В. О., Коцюбайло, Л. П., & Голуб, А. П. (2017). Дисбиоз кишечника и его коррекция в практике врача-инфекциониста. Семейная медицина, 3 (71), 32-36. doi:10.30841/2307-5112.3(71).2017.115931
2. Thursby, E., & Juge, N. (2017). Introduction to the human gut microbiota. Biochemical Journal, 474(11), 1823-1836. doi:10.1042/bcj20160510
3. Walker, W. A. (2017). Dysbiosis. The microbiota in gastrointestinal pathophysiology, 227-232. doi:10.1016/b978-0-12-804024-9.00025-2
4. Becattini, S., Taur, Y., & Pamer, E. G. (2016). Antibiotic-induced changes in the intestinal microbiota and disease. Trends in Molecular Medicine, 22(6), 458-478. doi:10.1016/j.molmed.2016.04.003
5. De Kraker, M. E. A., Stewardson, A. J., & Harbarth, S. (2016). Will 10 million people die a year due to antimicrobial resistance by 2050? PLOS Medicine, 13(11), e1002184. doi:10.1371/journal.pmed. 1002184
6. Iacob, S., & Iacob, D. G. (2019). Infectious threats, the intestinal barrier, and its Trojan Horse: dysbiosis. Frontiers in Microbiology, 10. doi:10.3389/fmicb.2019.01676
7. Wilkins, L. J., Monga, M., & Miller, A. W. (2019). Defining dysbiosis for a cluster of chronic diseases. Scientific Reports, 9(1). doi:10.1038/s41598-019-49452-y
8. Shenderov, B. A. (2013). Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception. Microbial Ecology in Health & Disease, 24(0). doi:10.3402/mehd.v24i0.20399
9. Singh, A., Vishwakarma, V., & Singhal, B. (2018). Metabiotics: the functional metabolic signatures of probiotics: current state-of-art and future research priorities—metabiotics: probiotics effector molecules. Advances in Bioscience and Biotechnology, 09(04), 147-189. doi:10.4236/abb.2018.94012
10. Richards, J. L., Yap, Y. A., McLeod, K. H., Mackay, C. R., & Marino, E. (2016). Dietary metabolites and the gut microbiota: An alternative approach to control inflammatory and autoimmune diseases. Clinical and Translational Immunology, 5(5), e82.
11. Gagliardi, A., Totino, V., Cacciotti, F., Iebba, V., Neroni, B., Bonfiglio, G., Trancassini, M., Passariello, C., Pantanella, F, & Schippa, S. (2018). Rebuilding the gut microbiota ecosystem. International Journal of Environmental Research and Public Health, 15(8), 1679.
12. Knysh, O. V., & Martynov, A. V. (2020). Potentiation of the antimicrobial effect of Lactobacillus reuteri DSM 17938 cell-free extracts by ascorbic acid. Medicni perspektivi, 25(1), 17-24. doi: 10.26641/23070404.2020.1.200393
13. Knysh, O. V., Pogorila, M. S., & Voyda, Y. V. (2020). In vitro immunomodulatory effect of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus reuteri cell free extracts. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 11(1), 93-97. doi:10.15421/022013
14. Knysh, O. V. (2019). Bifidogenic properties of cell-free extracts derived from probiotic strains of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus reuteri. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 10(1), 124128. doi:10.15421/021919
15. Knysh, O. V. (2019). The effects of cell-free extracts derived from probiotic strains Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus reuteri on the proliferation and biofilm formation by Lactobacillus reuteri in vitro. Zaporozhye Medical Journal, 0(6). doi:10.14739/2310-1210.2019.6.186711
16. Резшков, О. Г., Соловйов, А. I., Добреля, Н. В., & Стефанов, О. В. (2006). Бюетична експертиза доктшчних та шших наукових дослщжень, що виконуються на тваринах: метод. рекомендаций Вiсник фармакологи та фармаци, (7), 47-61.
17. Дармов, И. В., Чичерин, И. Ю., Ердякова, А. С., Лундовских, И. А., & Погорельский, И. П. Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных. Патент № 2477894. Российская Федерация, опубл. 20.03. 2013. Бюл, (8).
18. Larcombe, S., Jiang, J.-H., Hutton, M. L., Abud, H. E., Peleg, A. Y., & Lyras, D. (2020). A mouse model of Staphylococcus aureus small intestinal infection. Journal of Medical Microbiology, 69(2), 290-297. doi:10.1099/jmm.0.001163
19. Piqué, N., Berlanga, M., & Miñana-Galbis, D. (2019). Health benefits of heat-killed (tyndallized) probiotics: An overview. International Journal of Molecular Sciences, 20(10), 2534. doi:10.3390/ijms20102534
20. Lopetuso, L., Graziani, C., Guarino, A., Lamborghini, A., Masi, S., & Stanghellini, V. (2017). Gelatin tannate and tyndallized probiotics: a novel approach for treatment of diarrhea. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 21(4), 873-883.
21. Taverniti, V., & Guglielmetti, S. (2011). The immunomodulatory properties of probiotic microorganisms beyond their viability (ghost probiotics: proposal of paraprobiotic concept). Genes & Nutrition, 6(3), 261-274. doi:10.1007/s12263-011-0218-x
22. Canducci F., Armuzzi A., Cremonini F., Cammarota G., Bartolozzi F., Pola P., Gasbarrini G., Gasbarrini A. (2000). A lyophilized and inactivated culture of Lactobacillus acidophilus increases Helicobacter pylori eradication rates. Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 14(12), 1625-1629. doi:10.1046/j.1365-2036.2000.00885.x
