CC BY
42
АПОПТОЗ В РЕГЕНЕРАЦИОННОМ ГИСТОГЕНЕЗЕ ПЕЧЕНИ
после частичной гепатэктомии у крыс
И.М. Газизов 12, А.А. Гумерова 2, А.П. Киясов 12
1 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Apoptosis in regenerative histogenesis of the liver after partial hepatectomy in rats
I.M. Gazizov1■2, AA. Gumerova 2, A.P. Kiassov1■2
1 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
2 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia
Исследования регенерации печени на модели частичной гепатэктомии в последние десятилетия позволили практически по часам расписать включение различных генов, изменение концентрации цитокинов, установить кинетику пролиферативного ответа различных типов клеток, вовлеченных в восстановление органа . К сожалению, следует отметить, что процессам апоптоза, который всегда активируется параллельно с регенерацией, уделялось незначительное внимание. С практической точки зрения понимание процессов апоптоза может быть необходимо для разработки новых терапевтических подходов в лечении заболеваний печени, направленных на усиление анти-апопто-тических сигналов и стимуляцию клеток к пролиферации Данная работа выполнена с целью изучения участия апо-птоза в регенерацонном гистогенезе печени после частичной гепатэктомии у крыс . В ходе эксперимента через 1, 2, 3, 5, 7, 14 сут . после операции анализировали экспрессию РСЫА, каспазы 3 и 9, Вс1-2 методами иммуногистохимии . Результаты исследования показали, что каспаза 9 и Вс1-2 экспрессируются на протяжении всей первой недели после ЧГ, каспаза 3 — в первые 3 сут . Максимальная экспрессия каспазы 9 в гепатоцитах и синусоидных клетках выявлена через 2 сут . , а в холангиоцитах — через 5 сут . после частичной гепатэктомии . Пик экспрессии Вс1-2 в си-нусоидных клетках отмечен через 3 сут , а в гепатоцитах и холангиоцитах — через 5 сут . после операции . Таким образом, механизмы апоптоза и антиапоптоза одновременно активируются в ходе регенерации печени после частичной гепатэктомии у крыс При этом необратимый апоптоз имеет место лишь в первые трое суток после ЧГ и затрагивает незначительную долю гепатоцитов и синусоидных клеток
Ключевые слова: печень, апоптоз, регенерация, частичная гепатэктомия, каспаза
Study of liver regeneration after partial hepatectomy in last few decades enabled to understand hourly changes of expression of different genes, levels of cytokines, determine proliferation kinetics of liver cell types . Unfortunately, processes of apoptosis, which always activates together with regeneration was not given enough attention . In a practical point of view, understanding of apoptosis is needed for development of new therapeutic approaches in liver treatment based on enhancing of anti-apoptotic signals and inducing cells into proliferation . This work was dedicated to study apoptosis during liver regeneration after partial hepatectomy in rats . We analyzed expression of PCNA, caspase 3 and 9, Bcl-2 immunohistochemically during liver regeneration on 1, 2, 3, 5, 7, 14 postoperative days . Our results have showed that caspase 9 and Bcl2 are expressed during first postoperative week, caspase-3 only in first three days . Maximal expression of caspase 9 in hepatocytes and sinusoidal cells occurs after 2 days, in cholangiocytes — after 5 days . Maximal expression of Bcl-2 in sinusoidal cells occurs after 3 days, in hepatocytes and cholangiocytes — after 5 days . So, during liver regeneration after partial hepatectomy in rats mechanisms of apoptosis and antiapoptosis are activated simultaneously . Irreversible apoptosis is possible only during first 3 postoperative days and involves only minor fraction of hepatocytes and sinusoidal cells
Keywords: liver, apoptosis, regeneration, partial hepatectomy, caspase .
Введение
Классической моделью изучения регенерации печени является модель частичной гепатэктомии (ЧГ) . Она была предложена и выполнена на крысах в 1931 г . Г . Хиггенсом и Р . Андерсоном и позволила установить, что оставшиеся доли восстанавливают исходную массу печени в течение 1—2 нед . [1]. В дальнейшем при изучении регенерации на модели ЧГ были описаны кинетика пролиферативного ответа различных клеточных типов [2], последовательность и уровень вовлечения факторов роста, факторов транскрипции, генов, роль гормонов [3], внеклеточного матрикса [4]. Восстановление первоначального размера печени возвращает гепатоциты в G0-фазу клеточного цикла. Считается, что количество ге-патоцитов, образовавшихся в ходе пролиферации, превышает их первоначальное число, и небольшая волна апоптоза гепатоцитов завершает процессы восстановления печени после ЧГ, являясь механизмом коррекции избыточной пролиферации [5].
e-mail: ilnazaziz@mail . ru
При этом вопрос о процессах апоптоза в других типах клеток печени остается неизученным . В связи с этим целью нашей работы стало изучение апо-птоза в ходе регенерационного гистогенеза печени путем иммуногистохимического анализа экспрессии маркеров апоптоза, пролиферации в клетках печени после частичной гепатэктомии .
Материал и методы
Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах, находящихся на стандартном пищевом рационе вивария Центральной научно-исследовательской лаборатории Казанского ГМУ со свободным доступом к воде . Операцию ЧГ (67%) проводили в условиях операционной под эфирным наркозом по методике, описанной G . M . Higgins и R . M . Anderson (1932) [1]. Удаленные во время операции доли печени взвешивали, фотографировали и использовали в качестве контроля В качестве контроля также использовали печень животных
после SHAM-операции (плацебо-операция), которая состояла в проведении лапаротомии под эфирным наркозом без ЧГ . Забор органов после ЧГ производили через 1, 2, 3, 5, 7 и 14 сут . после ЧГ, материал помещали в 10% нейтральный формалин на 0,2 М фосфатном буфере (рН = 7,4) на 24 ч . для фиксации и заливали в парафин по стандартной методике .
Срезы печени окрашивали иммуногистохимиче-ски с коммерческими антителами к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA, клон PC10, DAKO, 1:100), десмину (клон D33, DAKO, 1:30), антиапоптотическому белку Bcl-2 (клон 124, DAKO, 1:30), каспазе 9 (Casp9, Abcam, 1:100) и каспазе 3 (Casp3, Abcam, 1:50). Иммуногистохимическое окрашивание было проведено стрептавидин-биоти-новым методом при помощи визуализационных систем Novolink (Novocastra, Великобритания) и LSAB (DAKO, Дания) .
Морфометрические исследования для изучения динамики изменения численности клеточных элементов проводили с применением морфометриче-ской окулярной сетки при увеличении х400 на микроскопе Leica DM 1000 (Германия) . Статистический анализ проводили с использованием пакета анализа Microsoft Excel .
Результаты и обсуждение
Макроскопические изменения печени, активация стволового компартмента, динамика пролиферации клеточных типов и изменения микроархитектоники печени после ЧГ были показаны в наших исследованиях ранее [6, 7]. Результаты исследования экспрессии PcNA подтвердили, что деление гепатоцитов начинается через сутки после операции, максимум их пролиферативной активности приходится на 2 сут , на 3—5 сут . экспрессия PCNA уменьшается, а через 7 сут . — сравнима с контрольными образцами . Пик пролиферации синусоидных клеток (перисинусои-дальные клетки печени, эндотелиальные, ямочные клетки, клетки Купфера) и холангиоцитов наблюдается на 3—5 сут . после операции [6].
Известно, что каспазы, вовлеченные в апоптоз, могут быть разделены на 3 группы: инициаторные (ка-спазы 2, 8, 9, 10), эффекторные (каспазы 3, 6, 7), каспазы воспаления (каспазы 1, 4, 5) [8]. Увеличение в клетке уровня инициаторных каспаз, в том числе каспазы 9, свидетельствует об обратимом, т . е . адаптационно-зависимом апопатозе, а увеличение уровня эффекторных каспаз — о необратимом апоптозе [9]. Изучение экспрессии каспазы 9 не выявило наличия данного маркера в контрольных
образцах печени и в печени после SHAM-операции . После ЧГ мы обнаружили экспрессию каспазы 9 в ядрах единичных гепатоцитов и синусоидных клеток уже через сутки после операции (табл. 1) . Через двое суток мы наблюдали экспрессию данного маркера в цитоплазме холангиоцитов, в ядрах и цитоплазме 13% гепатоцитов и синусоидных клеток . Среди последних экспрессию каспазы 9 мы выявили в перисинусоидальных клетках печени посредством двойного иммуногистохимического окрашивания с антителами к каспазе 9 и десмину (рис . 1А) . Через трое суток число экспрессирующих каспазу 9 гепатоцитов и синусоидных клеток уменьшается (паттерн экспрессии — ядерный), а холангиоцитов — увеличивается (паттерн экспрессии — цитоплазматический). Через 5 сут . число позитивных клеток продолжало расти, доля каспаза 9-позитивных холангиоцитов достигала максимума в 24,2% (рис . 1Б). При этом каспазу 9 мы выявляли не только в цитоплазме, но и в ядрах холангиоцитов . Через 7 сут . каспа-зу 9 выявляли в ядрах единичных холангиоцитов, синусоидных клеток и гепатоцитов Через 2 нед после ЧГ экспрессии каспазы 9 в печени мы не обнаруживали . Таким образом, можно сделать вывод, что каспаза 9 экспрессируется в ходе регенерации печени крыс на протяжении всей первой недели после ЧГ с максимальной экспрессией в гепатоцитах и сину-соидных клетках через 2 сут . , а в холангиоцитах — через 5 сут , что указывает на активацию механизмов адаптационного-зависимого апоптоза . Важно отметить, что поразительным выглядит достаточно высокий уровень экспрессии каспазы 9 основными клетками печени на фоне начальной фазы регенерации (табл . 1) . Этот факт, возможно, объясняется общностью рецепторов и сигнальных путей, регулирующих апоптоз и регенерацию [10]. В ближайшие часы после ЧГ в клетках печени сигналы апоптоза и пролиферации оказываются в коактивированном состоянии Точкой пересечения этих сигналов могут быть факторы Stat3 и ^кр, при значительном увеличении уровня которых клетки подавляют апоп-тоз путем экспрессии антиапоптотических белков Вс1-2, Вс1-х1, Hsp-70, выходят из G0-фазы и вступают в пролиферацию Подтверждением этой гипотезы стали установленные нами посредством двойного иммуногистохимического окрашивания факты, что в печени после ЧГ перисинусоидальные клетки печени коэкспрессируют каспазу 9 и Вс1-2 (рис . 1В), а гепатоциты и синусоидные клетки коэкспрессируют каспазу 9 и PCNA (рис . 1Г) . Нашу гипотезу также косвенно подтверждают исследования опухолей головного мозга, при изучении которых была пока-
Таблица 1. Число Casp9-позитивных клеток в печени крыс после частичной гепатэктомии
Срок эксперимента Доля CaspQ-позитивных гепатоцитов, % Доля CaspQ-позитивных синусоидных клеток, % Доля CaspQ-позитивных холангиоцитов, %
1 сутки 9,3±1,3* 3,8±1,8* 0
2 суток 13,1±2,2* 13±2,5* 7,8±2*
3 суток 7,6±1,6* 8,6±2,7* 12,3±3,1*
5 суток 1,8±1* 3,4±0,75* 24,2±4,2*
7 суток 1,6±0,7* 3,8±0,6* 5,7±3,2*
* — статистически значимое различие при сравнении с показателями контроля, Р<0,01.
зана коэкспрессия проапоптотических и антиапопто-тических генов [11]. Авторы статьи предположили наличие конкурентной экспрессии функционально разнонаправленных процессов, исход которой определяет прогрессию либо остановку онкогенеза клеток . В случае регенерации печени механизмы и динамика клеточного цикла принципиально не отличаются, и мы можем сделать вывод, что при регенерации печени после ЧГ происходит конкурентная экспрессия генов апоптоза и антиапоптоза
Результаты изучения экспрессии антиапоптоти-ческого белка Вс1-2 показали, что в контрольных образцах печени и после SHAM-операции Вс1-2 экспрессируется только в ядрах единичных гепа-тоцитов . Через сутки после ЧГ Вс1-2 экспрессируется в цитоплазме гепатоцитов, синусоидных клеток и холангиоцитов (табл. 2). Через двое суток в клетках сохраняется цитоплазматический паттерн экспрессии Вс1-2, число Вс1-2-позитивных холан-гиоцитов увеличивается Через трое суток после операции наблюдается максимальная экспрессия
Вс1-2 в синусоидных клетках, паттерн экспрессии цитоплазматический и ядерный . На пятые сутки выявлена максимальная экспрессия Вс1-2 в цитоплазме и ядрах холангиоцитов и в ядрах гепатоцитов Через семь суток число Вс1-2-позитивных клеток уменьшается, но в целом характер экспрессии сохраняется Через две недели после операции в образцах печени экспрессии Вс1-2 выявлено не было . Таким образом, Вс1-2 экспрессируется в ходе регенерации печени крыс на протяжении первой недели после ЧГ с максимальной экспрессией в синусо-идных клетках через трое суток, а в гепатоцитах и холангиоцитах — через 5 сут . Высокая потребность в восстановлении функций печени после ЧГ, безусловно, обуславливает доминирование процессов пролиферации и увеличения уровня антиапоптоти-ческих белков . Не удивительно, что при двойном иммуногистохимическом окрашивании нами были обнаружены гепатоциты (рис . 2А), холангиоциты (рис . 2Б) и синусоидные клетки (рис . 2В), коэк-спрессирующие Вс1-2 и РСЫА .
% Шт ы ■ ^
ЙЕяОк
*м
'¿к
¿г
г? Ф'-''
ШР^Ж^ - *
1Ш *' : * < < -
Г
Ф Ф "V * ' €
-> У
* * • » / ф щ *
— / " Д^Ь *'А * ■ у- .
* Ф ,' *
• Я* ^ - т
т € т
■ ЩШ, . - *». г.
* - • - .
ф
т
^¿¿ЗФ **
*
Рис. 1. Печень крысы после частичной гепатэктомии, иммуногистохимическое окрашивание с антителами:
А — к каспазе 9 (синий) и десмину (красный); Б — к каспазе 9;
В — к каспазе 9 (синий) и Вс1-2 (красный); Г — к PCNA (синий) и каспазе 9 (красный). А, В, Г — через 2 сут. после ЧГ; Б — через 5 сут. после ЧГ. Ув.: А, В х1000; Б, Г х400. Докраска ядер - гематоксилин
Таблица 2. Число Bd-2-позитивных клеток в печени крыс после частичной гепатэктомии
Срок эксперимента Доля Вс1-2-позитивных гепатоцитов, % Доля Вс1-2-позитивных синусоидных клеток, % Доля Вс1-2-позитивных холангиоцитов, %
1 сутки 3,1±0,4* 4,8±1,6* 17,3±3,3*
2 суток 2,54±0,2* 5,45±0,5* 44±2,2*
3 суток 2,6±0,4* 13±2,5* 48,5±3,6*
5 суток 4,0±0,4* 6,3±0,6* 61,3±5,1*
7 суток 3,6±0,5* 4,1±0,7* 27,2±4,5*
* — достоверное различие при сравнении с показателями контроля, Р<0,01.
Рис. 2.
Печень крысы после частичной гепатэктомии, иммуногистохимическое окрашивание с антителами:
А — к PCNA (синий) и Вс1-2 (красный); Б — к PCNA (синий) и Вс1-2 (красный); В — к PCNA (синий) и Вс1-2 (красный); Г — к каспазе 3; Д. к каспазе 3.
А—В — через 3 сут. после ЧГ, Г — через 1 сут. после ЧГ, Д — через 2 сут. после ЧГ. Ув.: А х1000; Б—Д х400. Докраска ядер — гематоксилин
Однако в ходе регенерации печени после ЧГ регистрируется и необратимый апоптоз, который мы выявляли путем изучения экспрессии каспазы 3 . В печени после SHAM-операции и контрольных образцах экспрессии каспазы 3 ни на одном из сроков выявлено не было Через сутки после ЧГ присутствие каспазы 3 установлено в цитоплазме 2,35% гепатоцитов и в единичных синусоидных клетках (рис . 2Г). Через двое-трое суток после ЧГ экспрессия каспазы 3 уменьшалась и выявлялась в ядрах и цитоплазме единичных гепатоцитов и синусоидных клеток (рис . 2Д) . Через 7 и 14 сут . экспрессия каспазы 3 установлена лишь в единичных мононуклеарных клетках, расположенных в просвете сосудов печени . Следовательно, необратимый апоптоз в печени после ЧГ происходит только в первые трое суток после операции, наиболее активен в первые сутки, но за-
трагивает значительно меньше клеток, чем обратимый адаптационно-зависимый апоптоз, связанный с каспазой 9 . Таким образом, полученные нами результаты изучения экспрессии каспазы-3 не согласуются с устоявшейся теорией регенерации печени после ЧГ, предполагающей участие механизмов апоптоза в завершающем этапе восстановления печени после ЧГ в качестве механизма коррекции результатов избыточной пролиферации [5]. Видимо, в клетках печени существует более тонкая настройка приостановки пролиферации, не требующая существенного участия механизмов апоптоза Наблюдаемый же нами необратимый апоптоз (экспрессия каспазы 3) в первые трое суток после ЧГ может быть обусловлен активацией механизмов контроля качества генотипа клеток в ходе регенерации для элимининации дефектных клеток
ЛИТЕРАТУРА:
1. Higgins G . M ., Anderson R . M . Experimental pathology of the liver: I . Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal . Arch . Pathol . 1931; 12: 186-202 .
2 . Bucher N . L. R ., Farmer S . Liver regeneration after partial hepatectomy: genes and metabolism . In: Strain AJ, Diehl A, eds . Liver growth and repair . London: Chapman and Hall, 1998; 3-27 .
3 . Taub R . Liver regeneration: from myth to mechanism . Nat . Re .v Mol . Cell . Biol . 2004; 5: 836-47 .
4 . Martinez-Hernandez A ., Amenta P . S . The hepatic extracellular matrix . II . Ontogenesis, regeneration and cirrhosis . Virchows Arch . A Pathol . Anat . Histopathol . 1993; 423: 77-84 .
5 . Sakamoto T., Liu Z ., Murase N . et al . Mitosis and apoptosis in the liver of interleukin-6-deficientmice after partial hepatectomy Hepatology 1999; 29: 403-11.
6 . Газизов И . М ., Калигин М . С ., Андреева Д . И . и др . Изменения микроструктуры печени после частичной гепатэктомии у крыс . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; VIII (3): 101-5 .
7 . Газизов И . М ., Гумерова А.А. и др . Экспрессия рецептора к фактору стволовых клеток С-kit в регенерирующей печени после частичной гепатэктомии . Морфологические ведомости 2008; 1-2: 23-27
8 . Rai N . K . Apoptosis: a basic physiologic process in wound healing . Int . J . Low . Extrem . Wounds . 2005; 4: 138-44.
9 . Онищенко Н .А., Люндуп А. В ., Газизов И . М . и др . Двухфазная динамика воздействия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ммск) костного мозга на печень при моделировании фиброзирующего гепатита . Вестник трансплантологии и искусственных органов 2011; XIII (3): 51-8 .
10 Galun E , Axelrod J H The role of cytokines in liver failure and regeneration: potential new molecular therapies Biochimica et Biophysica Acta . 2002; 1592: 345-58 .
11. Bruggers C . S . , Fults D . , Perkins S . L. , Coffin C . M . , Carroll W . L . Coexpression of genes involved in apoptosis in central nervous system neoplasms J Pediatr Hematol Oncol 1999; 21(1):19-25 .
Поступила: 10.10.2015
