CC BY
127
АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ: ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Н.Ф. Сорока, А.И. Свирновский, А.Л. Рекун Белорусский государственный медицинский университет Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии
г. Минск, Республика Беларусь
Резюме
Цель. Определить влияние иммуносупрессивных лекарственных средств на апоп-тоз лимфоцитов периферической крови больных системной красной волчанкой (СКВ) in vitro.
Материал и методы. 102 больных СКВ (92 жен. и 10 муж., средний возраст 33,7 ±
1,32 лет) и 40 здоровых лиц (доноров). Выделенные из периферической крови больных и доноров лимфоциты культивировали в течение 24 час. в присутствии (индуцированный апоптоз) или отсутствии (спонтанный апоптоз) дексаметазона (Д) (1 и 5 мкМ), лейкладина (JI) (2 мкг/мл), флударабина (Ф) (5мкг/мл) и цикло-фосфана (ЦФ) (10 мкг/мл). Для регистрации апоптоза использовали морфологический метод (флуоресцентную микроскопию). Определяли процент апоптотичес-ких клеток (абсолютный апоптотический индекс, ААИ) и вычисляли относительный апоптотический индекс (ОАИ) по формуле
ОАИ = [(ААИиндуц - ААИ спонт) / ААИСП0НТ] х 100%.
Результаты. Интенсивность спонтанного апоптоза лимфоцитов больных СКВ (14,0±0,58%) была достоверно выше, чем у здоровых лиц (6,0±0,43%, р<0,001), причем обнаружена прямая зависимость между уровнем спонтанного апоптоза мо-нонуклеарныцх клеток и степенью активности заболеваания. Введение в культуру лимфоцитов Д, JI, Фи ЦФ вызывало достоверный рост количества апоптотических клеток. По значениям ОАИ выявлено достоверное снижение чувствительности лимфоцитов больных СКВ к индукции апоптоза Д в концентрации 1 мкМ (43,3±4,66%; р<0,001) и 5 мкМ (56,4±5,31%; р<0,001), Л (82,1±6,06%; р<0,05) и Ф (50,5±5,49%; р<0,05) в сравнении с соответствующими показателями у лиц контрольной группы (128,1 ±23,11%; 110,3±19,88%; 115,0±14,81%; 80,5±12,59%). Уровни ОАИ оказались выше в подгруппах больных с более благоприятными вариантами заболевания (минимальная активность, хроническое течение, отсутствие люпус-нефрита) и лучшим ответом на проводимое лечение.
Заключение. Изучение апоптоза лимфоцитов периферической крови имеет определенное клиническое значение при СКВ. Уровень спонтанного апоптоза мононук-леаров in vitro отражает активность аутоиммунного процесса. Наибольшей информативностью в отражении клинических особенностей СКВ и результатов проводимого лечения обладает ОАИ, определение которого может использоваться для прогнозирования течения заболевания и эффективности патогенетической терапии.
Ключевые слова: апоптоз, лимфоциты, мононуклеарные клетки, системная красная волчанка
Адрес: 220116, Республика Беларусь, г. Минск, пр. Дзержинского, 83. Тел.: +375293693393.
E-mail: sorokal949@mail.ru
Системная красная волчанка (СКВ) по-прежнему является неразгаданной тайной ревматологии. Этиология ее остается неизвестной, патогенез недостаточно изучен, а путь к диагнозу подобен лабиринту. Не подлежит сомнению, что ведущее значение в патогенезе СКВ имеют аутоиммунные механизмы. Однако существует интригующая гипотеза
о центральной роли дисрегуляции апоптоза, или программированной гибели, иммунокомпетентных клеток в развитии данного заболевания [11, 17].
В научном мире продолжается дискуссия относительно характера нарушений апоптоза лимфоцитов при СКВ. Согласно мнению ряда авторов, подавление апоптоза мононуклеарных клеток способствует накоплению активированных Т- и В-лимфо-цитов и персистенции клона аутореактивных лимфоцитов, что ведет к прогрессированию аутоиммунного процесса. У большинства больных СКВ не выявлено прямых нарушений экспрессии, структуры или функции Fas-рецептора - специализированной молекулы, принимающей сигнал к развитию апоптоза. Тем не менее делается вывод о существенном снижении у данных пациентов Fas-onocpe-дованного апоптоза аутореактивных и зрелых активированных Т-лимфоцитов на периферии. Последние способны к выделению растворимой формы Fas-рецепторэ (sFas) - продукта альтернативного сплайсинга мРНК гена Fas. Постулируется, что накопление sFas в микроокружении мононуклеарных клеток конкурентным образом подавляет взаимодействие Fas-рецептора с его естественным лигандом FasL и препятствует реализации программированной гибели клеток [2, 3]. Кроме того, в роли ингибиторов Fas-зависимого апоптоза выступают циркулирующие анти-РазЬ-аутоантитела, нейтрализующие Fas-L на активированных Т-клетках [16].
В то же время другими исследователями показано, что лимфоциты периферической крови больных СКВ содержат увеличенное количество поврежденной ДНК и обладают повышенной склонностью к апоптозу ex vivo по сравнению с мононук-леарными клетками здоровых лиц. При этом количество апоптотических клеток коррелирует с активностью заболевания [5, 8, 9]. Одновременно с ускорением апоптоза лимфоцитов у больных СКВ выявляется увеличение сывороточных уровней растворимых форм Fas-рецептора (sFas) и Fas-лиганда (sFasL). sFasL образуется в результате ферментативного расщепления матричной металлопротеина-зой-7 (матрилизином) мембранной формы Fas-L (mFasL) и уступает последней в способности индуцировать программированную гибель. Имеются сообщения о наличии прямой линейной зависимости между концентрациями sFas и sFasL в сыворотке и количеством апоптотических периферических Т-клеток, что доказывает проапоптогенный эффект sFas и вспомогательную роль sFasL в удалении ауто-
реактивных мононуклеарных клеток. Возможно, программа апоптоза подразумевает высвобождение Брав с целью распространения сигнала "смерти" либо для защиты РавЬ от деградации [7, 15].
Предполагается, что программированная гибель мононуклеаров является одним из механизмов, приводящих к появлению аутоантигенов и усилению их иммуногенности. Ускорение апоптоза лимфоцитов может сопровождаться возрастанием экскреции из клеток деградированной ДНК, нук-леосом, гистонов, компонентов комплекса Гольджи и митохондрий, а также модификацией и перемещением внутриклеточных макромолекул на поверхность мембраноассоциированных фрагментов (апоптотических телец) [7, 12, 17]. Следовательно, апоптотические клетки "поставляют" ранее скрытые аутоантигены, которые активируют аутореактивные лимфоциты, способствуют образованию аутоантител и формируют с ними активированные комплементом иммунные комплексы, откладывающиеся на базальных мембранах. Причем характерный для СКВ широкий спектр аутоантител обусловлен многообразием аутоантигенов, модифицированных и освобожденных в ходе апоптоза [17].
В обычных условиях совокупность действенных механизмов обеспечивает скорую и безопасную элиминацию потенциально провоспалительного и иммуногенного материала из циркуляции. Многочисленными исследованиями доказано наличие нарушений регуляции или функционирования механизмов клиренса продуктов апоптоза при СКВ, ведущих к срыву аутотолерантности [6,12,14,17]. В первую очередь, страдает распознавание продуктов программированной гибели клеток макрофагами через С014, СЭ36, витронектин (С051/61) и тром-боспондин. Кроме того, снижается способность фагоцитов к поглощению и переработке апоптотических телец [6, 10]. Этому способствует дефицит вспомогательных белков (С1я компонент комплемента, манноз-связывающий лекгин, С-реактив-ный белок, сывороточный амилоид Р), опсонизи-рующих апоптотические клетки для облегчения их поглощения клетками-"мусорщиками" [4, 6,12, 13].
Таким образом, несмотря на все увеличивающийся поток информации, касающейся проблемы апоптоза мононуклеаров при СКВ, в этой области остается еще много невыясненного и противоречивого. Если в изучении молекулярных и биохимических механизмов апоптоза достигнуты значительные успехи, то взаимосвязям между программированной гибелью лимфоцитов и клиническими особенностями данного заболевания уделено недостаточно внимания. Целью настоящей работы явилось определение патогенетического и клинического значения показателей апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных СКВ.
Материсиг и методы
В исследование были включены 102 больных СКВ, стационарное лечение и амбулаторное наблюдение которых проводилось на базе Республиканского центра ревматологии (9-я клиническая больница г. Минска). Для постановки диагноза СКВ использовали международные диагностические критерии Американской ревматологической ассоциации (АРА, 1982).
Среди больных были 92 (90,2%) жен. и 10 (9,8%) муж. в возрасте от 15 до 65 лет (средний возраст 33,7+1,32 лет). Длительность болезни составляла от 1 мес. до 26 лет (в среднем 6,2±0,60 лет). Степень активности СКВ была минимальной у 21 (20,6%), умеренной у 62 (60,8%) и высокой у 19 (18,6%) больных. У 45 (44,1%) пациентов определялось по-дострое течение заболевания и у 57 (55,9%) хроническое. Люпус-нефрит имел место у 40 (39,2%) больных, у 62 (60,8%) пациентов отсутствовало вол-чаночное поражение почек.
Большинство больных СКВ (74,5%) принимали глюкокортикоиды (ГК) в дозах от 5 до 80 мг/сут в пересчете на преднизолон, причем 41 (40,2%) пациент получал до 20 мг/сут, 17 (16,7%) больных от 20 до 40 мг/сут и 18 (17,6%) более 40 мг/сут. Кроме того, 52 (51,0%) пациента применяли аминохинолиновые препараты (гидроксихлороквин) и 16 (15,7%) - цитостатическме иммунодепрессанты: циклофосфамид (ЦФ) и азатиоприн. У 26 (25,5%) больных диагноз СКВ был установлен впервые, и взятие крови для исследования у них производилось до начала патогенетической терапии. Результат лечения был расценен как "улучшение" у 65 (63,7%) больных, "без изменений" у 29 (28,4%) и "ухудшение" у 8 (7,8%) чел.
Контрольная группа состояла из 40 здоровых лиц (доноров): 26 (65,0%) жен. и 14 (35,0%) муж. в возрасте от 17 до 58 лет (средний возраст 34,2±2,04 лет).
Лимфоциты выделяли из гепаринизированной периферической венозной крови больных и доноров с помощью градиентного центрифугирования, переносили в среду ИРМЫ 640, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, Ь-глютамин и антибиотики, и инкубировали в течение 24 час. в атмосфере 5% углекислого газа в воздухе при 37°С. Для изучения спонтанного апоптоза часть мононук-леаров культивировали без добавления лекарственных препаратов. Для исследования индуцированного апоптоза в культуральную среду вводили иммунодепрессанты: дексаметазон (Д) в концентрациях 1 мкМ (соответствует средним терапевтическим дозам ГК) и 5 мкМ (соответствует высоким дозам), а также цитостатики в концентрациях, соответствующих терапевтическим, - лейкладин (Л) (2 мкг/мл), флударабин (Ф)(5 мкг/мл) и ЦФ (10 мкг/мл). После окончания культивирования клетки окрашивали акридиновым оранжевым и изуча-
ли под флуоресцентным микроскопом. Анализировали лимфоциты с конденсированным и фрагментированным хроматином и определяли процент апоптотических клеток (абсолютный апоптотичес-кий индекс, ААИ). С целью более объективной оценки степени индукции апоптоза вычисляли относительный апоптотический индекс (ОАИ) по формуле
ОАИ=[(ААИиндуц-ААИспонт)/ААИспонт] х 100%,
где ААИиндуц - абсолютный апоптотический индекс для индуцированного апоптоза, а ААИ-спонт - аналогичный показатель для спонтанного апоптоза.
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью пакета компьютерных программ Statistica for Windows 6.0. Для каждой серии данных вычисляли среднюю арифметическую (М), среднее квадратическое отклонение (а), стандартную ошибку средней арифметической (ш). При оценке достоверности различий между группами использовали t-критерий Стьюдента и уровень значимости (р) при сравнении двух выборок, а также однофакторный дисперсионный анализ с определением критерия Фишера (F) и его уровня значимости (р’) при сопоставлении трех выборок. Применяли метод корреляционного анализа с вычислением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs) для выявления взаимосвязи между признаками.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования апоптоза лимфоцитов периферической крови больных СКВ in vitro в сравнен™ с группой контроля приведены в табл. 1, из которой видно, что уровень спонтанного алоп-тоза в культуре мононуклеарных клеток больных СКВ оказался существенно выше (14,0+0,58%), чем у здоровых лиц (6,0±0,43%, р<0,001).
Каковы возможные причины повышенного уровня спонтанной гибели мононуклеаров у больных СКВ по сравнению с донорами? Определенное значение имел сам факт изъятия лимфоцитов из привычных условий существования и их культивирования in vitro. Лишение мононуклеарных клеток протективных эффектов микроокружения, в частности влияния защитных цитокинов и факторов роста, могло способствовать ускорению программированной гибели. Однако изучение апоптоза донорских лимфоцитов, используемых в качестве контроля, проводилось в таких же условиях, как и мононуклеарных клеток больных. Кроме того, в литературе имеются сведения об увеличенной интенсивности программированной гибели лимфоцитов больных СКВ при их исследовании ex vivo, ограничивающем пребывание клеток вне организма человека [1].
Весьма вероятно, что непосредственно аутоим-
мунные процессы приводят к ускоренной программированной гибели лимфоцитов у больных СКВ. Встреча с аутоантигенами вызывает активацию аутореактивных лимфоцитов, по каким-либо причинам "ускользнувшим" из-под контроля центральных или периферических механизмов толерантности. В дальнейшем вступают в действие механизмы активационно-индуцированного апоптоза моно-нуклеарных клеток, сопровождающиеся повышенной экспрессией Раз-рецептора и Рав-Ь на активированных лимфоцитах (преимущественно Т-клет-ках), а также избыточным присутствием в них белка р53 - свидетеля повреждений ДНК [5, 7, 9]. Следуя такой логике рассуждений, иммунопатологические реакции - причина повышенной интенсивности спонтанной гибели мононуклеарных клеток.
В то же время, принимая во внимание суть происходящих при апоптозе изменений в клетке, мож-
но говорить об избыточном образовании потенциально аутоантигенного и иммуногенного материала - компонентов ядра и других клеточных органелл, трансформированных и транслоцированных макромолекул [7,17,22]. Их накопление в условиях недостаточности клиренсовых механизмов приводит к аберрантной активации иммунной системы. С такой точки зрения, аутоиммунные процессы - следствие ускоренного апоптоза мононуклеаров.
Если интенсивность программированной гибели лимфоцитов исходно повышена, то каким образом влияют на данный процесс лекарственные препараты? Введение в культуру лимфоцитов Д вызывало достоверный рост количества апоптотических клеток в контрольной группе от 6,0±0,43% (при спонтанном апоптозе) до 9,4±0,71% (при концентрации Д 1 мкМ) и 11,9±0,57% (при концентрации Д 5 мкМ), р<0,001, а у больных СКВ - от 14,0±0,58%
Таблица 1
ПОКАЗАТЕЛИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СКВ В СРАВНЕНИИ С ГРУППОЙ КОНТРОЛЯ
Исследуемый показатель Больные СКВ Доноры (п = 40)
общая группа (п = 102) с впервые установленным диагнозом (п = 26)
Абсолютный апоптотический индекс, % Спонтанный алоптоз 14,0±0,58... 14,3*1,05... 6,0*0,43
Дексаметазон, 1 мкМ 19,3*1,20*”... 23,1*4,67... 9,4*0,71“*
Дексаметазон, 5 мкМ 20,4*0,73'”... 19,4*1,60... 11,9*0,57'"
Лейкладин, 2 мкг/мл 23,7*0,80’”... 25,3*1,79... 13,6*0,69'”
Флударабин, 5 мкг/мл 16,8±1,20’.. 16,5*1,35.. 12,3*0,78*”
Циклофосфан, 10 мкг/мл 17,3*0,80”... 17,1*1,63... 9,4*0,47’”
Относительный апоптотический индекс, % Дексаметазон, 1 мкМ 43,3*4,66... 36,9*18,06. 128,1*23,11
Дексаметазон, 5 мкМ 56,4±5,31... 44,4*6,91. 110,3*19,88
Лейкладин, 2 мкг/мл 82,1 ±6,06. 89,2*12,87 115,0*14,81
Флударабин, 5 мкг/мл 50,5*5,49. 52,3*5,89 80,5*12,59
Циклофосфан, 10 мкг/мл 28,9*2,57 31,6*5.00 39,3*5,42
Примечания: 1. * - достоверность различии между уровнями спонтанного и индуцированного апоптоза (* — р<0,05; ** - р<0,01; ***-р<0,001);
2.. - достоверность различий между показателями у больных СКВ и доноров (.- р<0,05;— р<0,01;р<0,001);
3. • — достоверность различий между показателями у больных СКВ с впервые установленным диагнозом и доноров (.- р<0,05; ..-р<0,01; ...-р<0,001).
Рисунок 1
ИНТЕНСИВНОСТЬ СПОНТАННОГО И ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СКВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТЕПЕНИ АКТИВНОСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Степень активности СКВ:
□ минимальная (I) п=21 □ умеренная (11) п=62 ■ высокая (III) п=19
Примечание: * - достоверность различий между показателями апоптоза при различной активности СКВ по Р-критерию (* - р<0,01; ** - р<0,001).
Рисунок 2
ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ АПОПТОТИЧЕСКИЙ ИНДЕКС ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СКВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТЕПЕНИ АКТИВНОСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
□ минимальная (I) п=21 0 умеренная (II) п=62 ■ высокая (III) п=19
Примечание: * - достоверность различий между показателями апоптоза при различной активности СКВ по F-критерию (* - р'<0,05; ** - р'<0,01; *** - р <0,001).
до 19,3±1,20% (1 мкМ) и 20,4±0,73% (5 мкМ), р<0,001. Воздействие JI (2 мкг/мл), Ф (5 мкг/мл) и ЦФ (10 мкг/мл) приводило к увеличению числа апоптотических мононуклеаров до 13,6±0,69%, 12,3±0,78% и 9,4±0,47% (р<0,001) в культуре донорских лимфоцитов и до 23,7±0,80% (р<0,001), 16,8±1,20% (р<0,05) и 17,3±0,80% (р<0,01) в культуре клеток больных СКВ соответственно. Таким образом, установлено, что ГК и цитостатики способны индуцировать программированную гибель лимфоцитов in vitro.
Процентное содержание апоптотических лимфоцитов, или ААИ, не в полной мере отражает индуцирующее влияние ГК и цитостатиков. Хотя интенсивность индуцированного апоптоза мононук-леарных клеток in vitro была значительно выше у
больных СКВ по сравнению с донорами, ее нарастание под влиянием лекарственных препаратов оказалось меньшим, чем у здоровых лиц. Для более наглядного представления степени индукции программированной гибели лимфоцитов был вычислен ОАИ. Из приведенных в табл. 1 данных следует, что воздействие Д в концентрации 1 мкМ на культуру лимфоцитов вызывало рост числа апоптотических клеток на 128,1123,11% (ОАИ) у доноров и на 43,3+4,66% у больных СКВ, а в концентрации 5 мкМ - на 110,3±19,88% и 56,4±5,31% соответственно (р<0,001). При использовании Л и Ф ОАИ составил для лимфоцитов здоровых лиц 115,0± 14,81 % и 80,5± 12,59%, а для мононуклеаров больных СКВ 82,1 ±6,06% и 50,5±5,49% соответственно (р<0,05). Этот факт может указывать на меньшую чувствительность иммунокомпетентных клеток больных СКВ к действию ГК и цитостатиков in vitro.
Убедившись в способности средств патогенетической терапии СКВ индуцировать программированную гибель лимфоцитов in vitro, мы столкнулись с несколькими неизбежными вопросами. Многие из исследуемых больных (74,5%) принимали иммуносупрессивные препараты. Не могло ли данное обстоятельство предварительно индуцировать апоптоз иммунокомпетентных клеток in vivo и форсировать спонтанную гибель мононуклеаров, выделенных из периферической крови пациентов, а также отрицательно повлиять на их чувствительность к индукторам апоптоза in vitro? Для исключения возможного влияния терапевтических вмешательств на апоптоз мононуклеарных клеток мы изучили подверженность лимфоцитов программированной гибели у больных СКВ с впервые установленным диагнозом, которые не получали на момент включения в исследование патогенетической терапии (см. табл. 1).
Как видно из приведенных данных, интенсивность спонтанного апоптоза в культуре мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови наблюдаемых пациентов (14,3±1,05%), значительно превышала аналогичный показатель у здоровых лиц (6,0±0,43%; р<0,001). Применительно к впервые выявленным больным апоптоз лимфоцитов, культивировавшихся без добавления лекарственных препаратов в питательную среду, действительно является спонтанным. Его повышенный уровень в сравнении с таковым у доноров благодаря исключению влияния фактора лечения указывает на возможное участие программированной гибели мононуклеаров в патогенезе СКВ.
Абсолютные показатели индуцированного апоптоза мононуклеарных клеток в выделенной группе «нелеченных» пациентов также существенно превосходили соответствующие значения в контрольной группе. Тем не менее степень индукции программированной гибели лимфоцитов под действием ГК и цитостатиков была ниже у больных
СКВ, чем у доноров, о чем свидетельствуют величины ОАИ (см. табл. 1).
Так, Д в концентрации 1 мкМ увеличивал число апоптотических клеток у пациентов и здоровых лиц соответственно на 36,9±18,06% и 128,1 ±23,11% (р<0,05). Значения ОАИ под влиянием 5 мкМ Д у больных СКВ были достоверно ниже в сравнении с донорами (44,4±6,91% и 110,3+19,88%, р<0,05, соответственно). Следовательно, выделенные из крови впервые выявленных пациентов лимфоциты, ранее не подвергавшиеся влиянию ГК, изначально обладают устойчивостью к индукции апоптоза данными препаратами.
Таким образом, при исключении предварительной лекарственной индукции программированной гибели in vivo для лимфоцитов больных СКВ характерны повышенная склонность к вступлению в спонтанный апоптоз и исходно низкая чувствительность к действию иммуносупрессивных препаратов in vitro. Весьма вероятно, что данные свойства мононуклеарных клеток обусловлены патогенезом заболевания и могут повлиять на восприимчивость пациентов к лечению.
При постановке диагноза СКВ на основании клинико-лабораторных данных устанавливали степень активности патологического процесса, в соответствии с которой все пациенты были разделены на 3 подгруппы. С целью выявления различий между ними был применен однофакторный дисперсионный анализ, причем степень активности процесса рассматривалась в качестве независимого фактора, а показатели апоптоза лимфоцитов - как зависимые переменные. Для каждой из последних определяли значение F и р'. Величины апоптотических индексов при крайних степенях активности (I и III) сравнивали также с помощью традиционно используемого t-критерия Стьюдента. Показатели апоптоза лимфоцитов в зависимости от активности СКВ представлены на рис. 1, демонстрирующего, что уровень спонтанного апоптоза мононуклеарных клеток больных СКВ достоверно увеличивался с повышением степени активности заболевания: 9,2±0,64%, 14,2±0,58% и 19,1±1,77% при минимальной (I), умеренной (II) и высокой (III) активности соответственно (F — 20,84; р'<0,001). Весьма вероятно, что программированная гибель мононук-леаров либо непосредственно участвует в инициации, поддержании и прогрессировании аутоиммунного процесса, либо является "свидетелем" (маркером) активности СКВ.
Абсолютные показатели индуцированного апоптоза под влиянием Д и JI также увеличивались вместе с активностью заболевания. Причем для обоих препаратов установлены статистически достоверные различия по t-критерию между I и III степенью активности СКВ. ААИ под влиянием Д в концентрациях 1 мкМ, 5 мкМ и JI составил соответственно 13,3± 1,22%, 17,2±1,05%, 21,2± 1,41 % при
минимальной и 24,812,12% (р<0,001), 25,812,19% (р<0,001), 26,912,26% (р<0,05) при высокой активности СКВ. В то же время дисперсионный анализ показал, что от степени активности существенным образом зависели лишь уровни Д-индуцированно-го апоптоза (F = 9,309; р'<0,01 при концентрации 1 мкМ, F = 6,158; р'<0,01 при концентрации 5 мкМ). Что касается индукции программированной гибели лимфоцитов Ф и ЦФ, то различия между значениями ААИ под воздействием данных препаратов были недостоверными.
Для полного представления о влиянии степени активности СКВ на индуцированный апоптоз мононуклеарных клеток мы не ограничились лишь количественным учетом апоптотических клеток и проанализировали значения ОАИ, представленные на рис. 2. Приведенные данные с учетом результатов дисперсионного анализа свидетельствуют о том, что с ростом активности заболевания наблюдалось достоверное уменьшение степени индукции программированной гибели лимфоцитов Д в концентрациях 1 мкМ (F = 5,423; р'<0,01) и 5 мкМ (F =
11,49; р’<0,001), Л (F = 20,73; р'<0,001) и Ф (F = 4,504; р’<0,05). Если при минимальной активности процесса индуцирующий эффект данных лекарственных средств на апоптоз мононуклеарных клеток был еще довольно ощутим, то при умеренной и высокой - существенно снижался. Полученные результаты позволяют заключить, что чувствительность лимфоцитов больных СКВ к лекарственным препаратам in vitro уменьшается при повышении активности болезни.
Исследуемые пациенты отличались также по характеру течения заболевания. Интенсивность спонтанного апоптоза при подостром течении СКВ (15,910,98%) достоверно превышала таковую при хроническом (12,610,64%, р<0,01). ААИ при подостром и хроническом течении СКВ достоверно не различались. Анализ значений ОАИ показал, что степень индукции программированной гибели лимфоцитов каждым из лекарственных препаратов, за исключением ЦФ, при хроническом течении заболевания существенно превосходила аналогичный показатель при подостром течении (рис. 3). Так, при хроническом и подостром течении болезни соответственно ОАИ составил под влиянием Д в концентрации 1 мкМ 59,315,75% и 21,813,55% (р<0,001), в концентрации 5 мкМ - 76,018,23% и 32,213,38% (р<0,001), под воздействием Л - 106,219,04% и 52,514,54% (р<0,001), Ф - 63,616,89% и 32,215,00% (р<0,01). Итак, при хроническом течении СКВ, являющемся более благоприятным, чувствительность лимфоцитов к индукторам апоптоза in vitro выше, чем при подостром течении.
Известно, что тяжесть состояния и зачастую продолжительность жизни больных СКВ определяются вовлечением в патологический процесс внутренних органов, в первую очередь -наличием лю-
Рисунок 3
ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ АПОПТОТИЧЕСКИЙ ИНДЕКС ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ХАРАКТЕРА ТЕЧЕНИЯ СКВ
■ подострое течение (п=45) □ хроническое течение (п“57)
Примечание: * - р<0,01; ** - р<0,001.
Рисунок 4
ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ АПОПТОТИЧЕСКИЙ ИНДЕКС ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СКВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОРАЖЕНИЯ ПОЧЕК
■ наличие нефрита (п=40) □ отсутствие нефрита (п=62)
Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.
пус-нефрита. Среди пациентов, включенных в исследование, волчаночное поражение почек встречалось в 39,2% (подгруппа с наличием нефрита). Поэтому мы выделили подгруппы больных с наличием и отсутствием нефрита. Уровни спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов больных с поражением почек достоверно не отличались от соответствующих показателей у пациентов без люпус-нефрита. В то же время, рассмотрев значения ОАИ, мы выявили определенные закономерности (рис.4). При вовлечении в патологический процесс почек и при отсутствии такового Д в концентрации
1 мкМ увеличивал количество апоптотических клеток соответственно на 26,1+4,32% и 57,416,32% (р<0,001), в концентрации 5 мкМ - на 44,017,55% и 64,017,06% (р = 0,068), Л - на 58,816,98% и 96,518,28% (р<0,01), Ф - на 34,5+4,03% и 55,916,80% (р = 0,093), ЦФ - на 21,613,79% и 32,4+3,21% (р<0,05). Таким образом, лимфоциты больных с поражением почек в меньшей степени подвергались программированной гибели под влиянием ГК и цитостатиков in vitro.
Рисунок 5
ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ АПОПТОТИЧЕСКИЙ ИНДЕКС ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СКВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛЕЧЕНИЯ
Результат лечения:
■ ухудшение, без перемен (п=37) □ улучшение (11*65)
А
|0°,0-fVL * 90,0- VI
Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.
Таким образом, высокая чувствительность лимфоцитов к лекарственной индукции апоптоза in vitro, оцениваемая по уровню ОАИ, позволяет предполагать более благоприятный вариант развития СКВ - низкую клинико-иммунологическую активность, хроническое течение заболевания, отсутствие люпус-нефрита. Пониженная подверженность мононуклеаров действию индукторов программированной гибели, напротив, ассоциируется с неблагоприятным клиническим прогнозом.
Находившиеся под нашим наблюдением больные СКВ получали традиционную терапию, эффективность которой мы оценивали в течение полугода после начала исследования и сопоставили результаты лечения с показателями апоптоза мононуклеар-ных клеток. Как выяснилось при количественном учете апоптотических клеток, интенсивность спонтанной гибели лимфоцитов была достоверно ниже у пациентов с улучшением, достигнутом в процессе патогенетической терапии (13,010,65%), чем у больных с ухудшением либо с отсутствием изменений (15,911,08%; р<0,05). Что касается величин ОАИ, представленных на рис. 5, то степень индукции апоптоза лимфоцитов при улучшении в ходе лечения и при ухудшении либо без перемен составила соответственно для Д в концентрации 1 мкМ 53,715,62% и 21,814,18% (р<0,001), в концентрации 5 мкМ - 71,317,28% и 29,6+3,74% (р<0,001), для Л -98,7+8,31% и 52,414,86% (р<0,001), для Ф -61,916,69% и 31,515,37% (р<0,01), для ЦФ -33,713,39% и 21,013,26% (р<0,05). Следовательно, лимфоциты больных, лекарственная терапия которых оказалась более эффективной, обладали гораздо большей чувствительностью к действию индукторов апоптоза in vitro.
Итак, оценив уровень ОАИ в начале наблюдения за больным как достаточно высокий, мы можем с определенной вероятностью предвидеть хороший ответ на проводимое лечение. Изначальная
устойчивость лимфоцитов к индукции апоптоза in vitro может свидетельствовать о развитии у пациента лекарственной резистентности. Выявленные закономерности позволяют предложить метод определения ОАИ для прогнозирования эффективности патогенетической терапии больных СКВ.
Взаимосвязи показателей апоптоза мононукле-арных клеток с клиническими особенностями заболевания подтверждены при проведении корреляционного анализа с вычислением rs. Выявлена положительная корреляция между интенсивностью спонтанного апоптоза лимфоцитов и степенью активности СКВ (rs = +0,531; р<0,001). Установлена отрицательная корреляция ОАИ под воздействием Д в концентрации 1 мкМ, 5 мкМ, Л и Ф с характером течения (rs = -0,694; -0,478; -0,511; -0,610 соответственно; р<0,001) и степенью активности заболевания (rs = -0,528; -0,428; -0,557; р<0,001; rs = -
0.534. р<0,01 соответственно). Между наличием люпус-нефрита-и подверженностью мононуклеа-
ЛИТЕРАТУРА
1. Лапин С.В., Калленберг К.Г.М., Тотолян А.А. Апоптоз Т-лимфоцитов и антифосфолипидные антитела в крови больных системной красной волчанкой. Мед. иммунол., 1999, 1, 3, 69-70.
2. Фильченков А.А., Степанов Ю.М., Липкин В.М. и др. Участие системы Fas/Fas-лиганд в регуляции гомеостаза и функционировании клеток иммунной системы. Аллергол. и иммунол., 2002, 3, 1, 24-35.
3. AI-Maini М.Н., Mountz J.D., Al-Mohri Н.А. et al. Serum levels of soluble Fas correlate with indices of organ damage in systemic lupus erythematosus. Lupus, 2000, 9, 2, 132-139.
4. Bijl М., Horst G., Bijzet J. e.a. Serum amyloid P component binds to late apoptotic cells and mediates their uptake by monocyte-derived macrophages. Arthritis Rheum., 2003, 48, 1, 248254.
5. Bijl М., Horst G., Limburg P.C. et al. Fas expression on peripheral blood lymphocytes in systemic lupus erythematosus (SLE): relation to lymphocyte activation and disease activity. Lupus, 2001, 10, 12, 866-872.
6. Charles P.J. Defective waste disposal: does it induce autoantibodies in SLE? Ann. Rheum. Dis., 2003, 62, 1, 1-3.
7. Courtney P.A., Crockard A.D., Williamson K. et al. Lymphocyte apoptosis in systemic lupus erythematosus: relationships with Fas expression, serum soluble Fas and disease activity. Lupus, 1999, 8, 7, 508-513.
8. Emlen W., Niebur J., Kadera R. Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. J. Immunol., 1994, 152, 7, 3685-3692.
ров действию Д (1 мкМ), Л и Ф также наблюдалась отрицательная корреляционная взаимосвязь (rs = -0,557; -0,378; р<0,001; rs = -0,417; р<0,05 соответственно). Напротив, выявлена положительная корреляция способности Д (1 мкМ, 5 мкМ), Л и Ф индуцировать апотоз мононукпеарных клеток in vitro с эффективностью терапии у наблюдаемых пациентов (rs = +0,525; +0,462; +0,436; р<0,001; rs = +0,585; р<0,01 соответственно).
Заключение
Таким образом, апоптоз лимфоцитов периферической крови играет важную роль в патогенезе СКВ, а показатели, его характеризующие, имеют определенное клиническое значение. Уровень спонтанного апоптоза мононуклеаров in vitro отражает активность аутоиммунного процесса у больных СКВ. Определение величины ОАИ позволяет прогнозировать клиническое течение СКВ и эффективность патогенетической терапии.
9. Funauchi М., Sugiyama М., Suk Yoo В. et al. А possible role of apoptosis for regulating autoreactive responses in systemic lupus erythematosus. Lupus. 2001, 10, 4, 284-288.
10. Herrmann М., Voll R.E., Zoller O.M. et al. Impaired phagocytosis of apoptotic cell material by monocyte-derived macrophages from patients with systemic lupus erythematosus. Arthr. Rheum., 1998, 41,7, 1241-1250.
11. Lorenz H.M., Herrmann М., Kalden J.R. The pathogenesis of autoimmune diseases. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl., 2001, 235, 16-26.
12. Mevorach D. Systemic lupus erythematosus and apoptosis: a question of balance. Clin. Rev. Allergy Immunol., 2003, 25, 1, 49-60.
13. Nauta A.J., Castellano G., Xu W. et al.
Opsonization with Clq and mannose-binding lectin targets apoptotic cells to dendritic cells. J. Immunol., 2004, 173, 5, 3044-3050.
14. Navrati! J.S., Ahearn J.M. Apoptosis, clearance mechanisms, and development of systemic lupus erythematosus. Curr. Rheum.. Rep., 2001, 3, 3, 191-198.
15. Silvestris F., Grinello D., Tucci M. et al.
Enhancement of T cell apoptosis correlates with increased serum levels of soluble Fas (CD95/Apo-l) in active lupus. Lupus, 2003, 12, 1, 8-14.
16. Suzuki N., Ichino М., Mihara S. et al. Inhibition of
Fas/Fas ligand-mediated apoptotic cell death of lymphocytes in vitro by circulating anti-Fas ligand autoantibodies in patients with systemic lupus erythematosus. Arthr. Rheum., 1998, 41, 2, 344-353.
17. White S., Rosen A. Apoptosis in systemic lupus erythematosus. Curr. Opin. Rheum., 2003, 15, 5, 557562.
Поступила 30.03.06
Abstract
N.F. Soroka, A.I. Svirnovsky, A.L. Rekun
Peripheral blood lymphocyte apoptosis in patients with systemic lupus erythematosus: pathogenetic and clinical aspects
Objective. To determine clinical significance of peripheral blood lymphocytes apoptosis indices in pts with systemic lupus erythematosus (SLE).
Material and methods. 102 pts with SLE (92 female and 10 male, mean age 33,7± 1,32 years) and 40 healthy donors (control group) were included. Peripheral blood lymphocytes of pts and donors were cultured for 24 hours with (induced apoptosis) or without (spontaneous apoptosis) Dexametasone (D) (1 and 5 pM), Leukladine (L) (2 pg/ml), Fludarabin (F) (5 pg/ml) and Cyclophosphamide (CP) (10 pg/ml). Apoptosis was evaluated with fluorescence microscopy. Apoptotic cell percentage (absolute apoptotic index, AAI) was determined and relative apoptotic index (RAI) was calculated according to the following formula: RAI=[(AAIinduced-AAIspoptaneous)/AAIspontaneous]xlOO%
Results. Peripheral blood lymphocytes spontaneous apoptosis in pts with SLE was significantly more intensive (14,0±0,58%) than in healthy donors (6,0±0,43%, p<0,001).There was direct correlation between mononuclear cells spontaneous apoptosis level and disease activity. Addition D, L, F and CP to the lymphocyte culture provided significant elevation of apoptotic cell count. RAI showed significant decrease of SLE pts lymphocytes sensitivity to the induction of apoptosis with D lpM (43,3±4,66%, p<0,001) and 5pM (56,4±5,31%, p<0,001), L (82,1+6,06%, p<0,05) and F (50,5±5,49%, p<0,05) in comparison with control (128,1±23,11%, 110,3± 19,88%, 115,0+14,81%, 80,5+12,59%). RAI level was higher in subgroups of pts with less severe variants of the disease (minimal activity, chronic course, absence of lupus-nephritis).
Conclusion. Evaluation of peripheral blood lymphocytes apoptosis possesses some clinical significance in SLE. The level of mononuclear cells spontaneous apoptosis in vitro reflects activity of autoimmune process. RAI is the most informative index for assessment of SLE clinical features and results of current treatment. It can be used for prognosis of the disease course and treatment efficacy.
Key words: apoptosis, lymphocytes, mononuclear cells, systemic lupus erythematosus
