CC BY
205
УДК 615.322:543.544.123
АНТОЦИАНЫ ПЛОДОВ ВИШНИ И РОДСТВЕННЫХ РАСТЕНИИ1
e-mail: deineka@bsu.edu.ru Ach87@mail.ru, Deyneka@bsu.edu.ru sorokopudov@bsu.edu.ru shevchenko_s@bsu.edu.ru
Белгородский государственный национальный исследовательский университет, 308015 Белгород, Россия, ул. Победа.85
Л.А. Дейнека A-Н. Чулков B^. Дейнека
В.Н. Сорокопудов CM Шевченко
В работе определен антоциановый состав плодов ряда вишен из ботанического сада БелГУ. Предложен метод сопоставления состава комплекса по активности соответствующих ферментов: рамнозил-трансферазы, внедряющей рамнозид-ный радикал в положение 6 глюкозидного радикала и глюко-зил-трансферазы, внедряющей глюкозильный радикал в положение 2 имеющегося глюкозидного радикала, что обеспечивает биосинтез всего спектра известных производных циа-нидина. Установлено, что наивысшим уровнем накопления антоцианов из исследованных образцов отличается вишня «антипка», Свгазиз шаИа1еЪ - 550 - 750 мг на 100 г свежих плодов.
Ключевые слова: ВЭЖХ, антоцианы, Cerasus sp.,
Prunus avium, Prunus padus.
Введение
Природные фенольные соединения вообще и антоцианы в частности относятся к важнейшим природным антиоксидантам [1, 2]. Биосинтез в плодах вишен значительного количества антоцианов позволяет их рассматривать даже как компоненты функциональной пищи [2]. Антоцианы из плодов вишен обеспечивают плодам высокую антиоксидантную и антивоспалительную активность (противовоспалительная активность цианидина выше, чем у аспирина) [3], замедляют развитие опухолей (по опытам на мышах), раковых клеток толстой кишки [2]. Эпидемиологические исследования показали, что потребление продуктов, содержащих большое количество фенольных соединений обратно коррелирует с частотой заболеваний сердечно-сосудистой системы [4]. Эти соединения замедляют развитие атеросклероза благодаря антиоксидантному действию, защищая липопротеины низкой плотности.
Анализируя собственные и литературные данные по биосинтезу антоцианов в плодах вишен, авторы работы [4], указывают на то, что в антоциановом комплексе плодов вишен обычно обнаруживают: 1) цианидин-3-глюкозид (Су-3-01и), 2) циани-дин-з-(2”-глюкозилрутинозид) (Су-32°КиО, 3) цианидин-3-софорозид (Су-3-БорЬо), 4) цианидин-3-рутинозид (Су-3-Ки"0 и некоторые из аналогичных производных пеони-дина, или соединений, в состав которых входит ксилозильный радикал; но они присутствуют в небольших количествах.
Первые четыре из указанных выше соединений рассматриваются как основные компоненты антоцианового комплекса плодов вишен и в работе итальянских исследователей с соотношением между ними и суммарным накоплением (от 28 до 80 мг на 100 г) зависящими от сорта [2]. В работе других авторов [5] сообщается об образовании тех же веществ, но к списку добавлены два производных пеларгонидина.
Несмотря на то, что работ, в которых бы исследовалась биологическая активность индивидуальных составляющих сложных антоциановых комплексов, практически нет, информация об индивидуальном составе таких комплексов представляет интерес по ряду причин, включая оценку качества и установление фальсификации получаемой из вишен продукции.
1 Работа выполнена в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-
педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 гг., государственный контракт № П425 и государственный контракт № П508.
Гликозиды цианидина плодов вишен
Сведений о антоциановом составе вишен, выращиваемых в России, нами в литературе не обнаружено. Цель настоящей работы - изучение антоцианового состава плодов вишен, выращенных в Ботаническом саду БелГУ.
Материалы и методы исследования
Плоды собирали в стадии технической спелости в ботаническом саду БелГУ, замораживали в морозильной камере, где и хранили до исследования. Для исследования анто-цианового комплекса плоды размораживали, отделяли от семян и помещали в химический стакан, периодически разминая их под слоем 0.1 М водного раствора HCl. Смесь выдерживали 0.5 ч - 3 ч, экстракт отделяли фильтрованием через бумажный фильтр, добавляя новую порцию экстрагента до обесцвечивания массы вишен (двух последовательных экстракций обычно было достаточно), фильтраты объединяли и доводили до метки экстрагентом. Часть полученного экстракта фотометрировали для определения суммарного содержания антоцианов, выполняя пересчет на цианидин-3-глюкозид [6].
Для ВЭЖХ определения индивидуального состава антоцианового комплекса экстракт очищали методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах ДИАПАК С18. Патроны активировали пропусканием 5 мл ацетона, кондиционировали пропусканием 15-20 мл 0.1М водного раствора HCl. Затем на патроне концентрировали солянокислый экстракт (10-20 мл). Патрон промывали 2 мл 0.1М водного раствора HCl. Реэкстракцию антоцианов с патрона проводили пропусканием раствора, содержащего по 20 об.% муравьиной кислоты и ацетонитрила в воде. Все операции проводили со скоростью 1-2 капли в секунду. Перед введением в хроматографическую систему реэкстракт разбавляли водой в 2 раза.
Условия ВЭЖХ определения. В работе использовали хроматограф Agilent 1200 Infinity c диодно-матричным детектором (диапазон спектра 370 - 600 нм) с записью хроматограмм при 515 нм; колонка 250x4 мм Reprosil-Pur C18-AQ, 5 мкм; подвижная фаза: 10 об.% ацетонитрила (для ВЭЖХ) и 10 об.% муравьиной кислоты в дистиллированной воде.
Результаты исследования и их обсуждение
Для системного анализа особенностей антоцианового комплекса нами ранее был предложен метод анализа по активности соответствующих ферментов [7, 8]. В случае вишен следует выделить:
1) активность рамнозилтрансферазы №Т), переносящей в положении 6” глюко-зидного (или софорозидного) фрагмента рамнозильный радикал:
Су-3-01и + Rhamn — Cy-зRut,
Су-3-БорЬо + Rhamn — Су-32^и^
2) активность глюкозилтрансферазы (20Т), переносящей в положение 2” глюко-зидного радикала еще один глюкозильный радикал:
Су-3-01и + 01и — Су-з-БорЬо,
Cy-3-Rut + 01и — Су-32^и^
К этому следует добавить лишь активность 3'-флавонолгидроксилазы, обеспечивающей замену пеларгонидиновых производных цианидиновыми:
Рё(С1у) - Су(01у),
и метилтрансферазы, превращающей уже производные цианидина в производные петунидина.
Су(01у) - Рп(01у).
По нашим представлениям, основанным на анализе жирнокислотного состава масел семян, мы выделили три растения - вишню, черешню и черемуху - как близкие родственные растения, единственные из семейства Розовые, синтезирующие триглицериды, содержащие радикалы а-элеостеариновой кислоты - триеновой кислоты с сопряженными двойными связями [9]. По этой причине объектами настоящих исследований мы избрали плоды этих растений.
По характеру хроматограмм антоциановые экстракты можно разделить на несколько различных типов, см. рис.1. Отнесение, предложенное на рис.1 было выполнено с использованием двух закономерностей.
Во-первых, используя хроматограммы экстракта черного винограда, были определены времена удерживания основных неацилированных компонентов, присутствующих практически во всех окрашенных в цвета от красного до черного плодах - 3-глюкозидов дельфинидина, цианидина, петунидина, пеонидина и мальвидина [8]. Но сопоставление удерживания в этом случае позволяет определить только цианидин-3-глюкозид. Цианидин-3-рутинозид обнаружили сопоставлением времем удерживания образца и компонентов антоцианового экстракта плодов черной смородины, также обладающей постоянным качественным составом вне зависимости от сорта [10].
Во-вторых, для детектирования остальных компонентов использовали ранее установленные закономерности элюирования гликозидов с различным составом глико-зидного фрагмента [11], а также в сопоставлении с удерживанием антоцианов плодов красной смородины и бузины обыкновенной.
Наконец, в качестве дополнительного подтверждения справедливости полученного отнесения мы использовали запись спектров веществ в ячейке детектора, что позволяет разделить производные дельфинидинового (включающего дельфинидин, пе-тунидин и мальвидин) и цианидинового (цианидина и пеонидина) рядов, рис.2. И, наконец, присутствие в исследуемой смеси только одного основного агликона (цианиди-на) было подтверждено ВЭЖХ анализом продукта омыления экстракта, получаемого кипячением экстракта в ю%-ном растворе серной кислоты в течение 0.5 ч с последующей очисткой агликона твердофазной экстракцией на патронах ДИАПАК С18.
В сводной таблице 1 представлены данные по большому числу исследованных образцов экстрактов вишен и родственных растений. Антоциановый комплекс вишни степной, например, образован в основном рутинозидным производным, Су-3^и^ что указывает на высокую активность RT и низкую активность 20Т. В случае вишни «анти-пки» активность первого из упомянутых ферментов примерно вдвое меньше. У ряда
сортов вишни обыкновенной высока активность обоих ферментов, что обеспечивает биосинтез основного компонента - Су-32(^и^
0 5 10
Рис.1. Разделение компонентов экстрактов плодов некоторых вишен
Рис.2. Сопоставление спектров поглощения 3-глюкозидов дельфинидина (1), петунидина(2) и мальвидина (3), цианидина(4) и пеонидина (5)
Таблица 1
Компонентный состав антоцианов плодов вишни и родственных соединений
Сорт / Вид Доля антоциана*, %
Cy-з- Pg-3- Pn-3- Ост.
Sopho | 2GRut I Glu | Rut Glu | Rut Rut
Вишня обыкновенная, Prunus cerasus L. или Cerasus vulgaris Mill.
Щедрая l0.8 635 2.2 12.4 0 0 0 9.1
Золушка l.2 649 6.0 23.3 0 0 0 1.6
Расплетка 2.6 62.8 4.8 25.9 0 0 0 4.0
Быстринка <0.5 636 8.9 23.7 0 0 0 3.7
Уральская красавица 1.1 62.4 5.8 25.4 0 0 0 2.3
Багряная 3.0 4.4 4.4 85.5 0 0 0 2.7
Куйбышевская ранняя <0.5 4.6 5.5 81.8 0 0 0 8.1
Прима <0.5 <0.5 2.0 83.1 0 0 0 14.9
Хуторянка <0.5 3.5 6.3 83.2 0 0 0 7.0
Сильва <0.5 <0.5 1.9 79.8 0 0 0 18.3
Родственные растения
Черешня, Prunus avium 0.8 0.9 13.0 78.6 0 0 3.5 3.1
Черемуха, Prunus padus 4.5 <0.5 33.7 591 0 0 0 1.8
Церападус <0.5 <0.5 7.7 70.4 0 0 18.8 3.1
Вишни
«Антипка», Cerasus mahaleb <0.5 <0.5 43.7 51.6 <0.5 0 0 4.7
Степная (кустарниковая) Сегавив 1ги^со8а 3.3 597 4.2 22.2 0 0 0 6.7
Степная, Сегавив ^и^сова <0.5 6.1 4.7 82.3 0 0 0 6.8
Войлочная, Сегавив tomentosa <0.5 <0.5 2.8 12.4 4.3 77.0 0 3.5
Для оценки антоциановго состава плодов вишен по активности ферментов можно предложить два параметра:
1) активность ИТ, которая может быть рассчитана по сумме долей каждого из компонентов, содержащих рамнозильный радикал:
Сумма всех производных цианидива
2) активность 20Т, которая может быть рассчитана по доле каждого из компонентов, содержащих глюкозильный радикал в положении 2”:
Сумма всех производных цианидива
Как видно из представленных в таблице 2 данных, примерно половина сортов вишен вне зависимости от уровня суммарного накопления антоцианов характеризуется высокой относительной активностью ИТ, что приводит к доминированию среди антоцианов двух соединений - Су-Э-Ии Су-3-2ОКи^ К такому типу относится значительное число сортов, как данные о которых опубликованы в научной литературе, так и исследованных нами из числа плодов, полученных из других источников: «Малиновка», «Сибирская», «Ленинградская скороспелая», «Кентская», «Гирлянда», «Шубинка», «Ленинградская», «Уральская рубиновая», «Тургеневская», «Владимирская», «Апух-тинская», «Рогнеда», хотя в этом же ряду снижается активность 20Т с 84 до 44 %.
У других, несколько реже (по нашим данным) встречающихся, но также типичных представителей вишен, основной компонент экстракта Су-зИи^ С низкой активностью 20Т: «Прима», «Хуторянка» и «Сильва», напоминающих по этому параметру черешни, черемуху и церападус; к ним примыкают также вишня степная и вишня «анти-
пка». Из ранее исследованных нами плодов к этому типу можно добавить сорта: «Рове-стник», «Лебедянская», «Десертная Морозовой», «Багряная» и «Сильва».
Что же касается вишни войлочной, то у нее активность флаванол-з'-гидроксилазы оказывается крайне низкой, табл.1, что приводит к накоплению производных пеларгонидина.
По абсолютному накоплению антоцианов вишня обыкновенная относится к умеренным источникам - содержание антоцианов находится в диапазоне 0.030 А
0.160 г на 100 г свежих плодов. В случае черемухи накопление антоцианов несколько выше (360 мг на 100 г), в гибриде этих двух растений уровень накопления антоцианов промежуточный (180 мл на 100 г). Но наиболее богатым по антоцианам оказались плоды вишни «антипки» - 550 А 750 мг на 100 г, что делает их ценным сырьем для получения природных антоциановых колорантов, тем более что эти плоды в пищу не используют (человек, но не птицы!, которым очень по вкусу этот богатейший источник антиоксидантов).
Таблица 2
Характеристики действия ферментных систем, отвечающих за накопление антоцианов в плодах вишен
№ Сорта Cerasus vulgaris или виды Cerasus Активность с юрментов, % Суммарное накопление*
RT 2GT
1 Щедрая 85.4 87 0.025
2 Золушка 92.5 71.5 0.114
3 Расплетка 92.3 70.9 0.102
4 Быстринка 90.7 70.1 0.117
5 Уральская красавица 92.7 68.5 0.086
6 Багряная 92.4 8.01 0.058
7 Куйбышевская ранняя 94-0 4.89 0.05
8 Прима 97.6 0 0.069
9 Хуторянка 93-0 0 0.12
10 Сильва 97-7 0 0.025
11 Церападус 90.1 0 0.193
12 «Антипка», Cerasus mahaleb 54.1 0 0.629
13 Степная (кустарниковая), Cerasus fruticosa 91.6 68.8 0.103
14 Степная, Cerasus fruticosa 95 6.42 0.156
* - в пересчете на цианидин-3-глюкозид.
Список литературы
1. Lila M.A. Anthocyanins and Human Health: An In Vitro Investigative Approach // J. Bio-med. Biotechnol. - 2004. - V.2004. - P. 306-313.
2. Blando F., Gerardi C., Nicoletti I. Sour Cherry (Prunus cerasus L) Anthocyanins as Ingredients for Functional Foods // J. Biomed. Biotechnol. - 2004. - V.5. - P. 253-258.
3. Wang H., Nair M.G., Strasburg G.M., Chang Y.-C., Booren A.M., Gray J.I., DeWitt D.L. Antioxidant and Antiinflammatory Activities of Anthocyanins and Their Aglycon, Cyanidin, from Tart Cherries // J. Nat. Prod. - 1999. - V.62. - P. 294-296.
4. Simunic V., Kovac S., Gaso-Sokac D., Pfannhauser W., Murkovic M. Determination of anthocyanins in four Croatian cultivars of sour cherries (Prunus cerasus) // Eur. Food Res. Technol. -2005. - V.220. - P. 575-578.
5. Chaovanalikit A., Wrolstad R.E. Anthocyanin and Polyphenolic Composition of Fresh and Processed Cherries // J. Food Sci. - 2004. - V.69. - P. FCT73-FCT83.
6. Giusti M., Wrolstad R.E. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy // Current Protocols in Food Analytical Chemistry. - 2001. - F1.2.1-F1.2.13.
7. Сорокопудов В.Н., Дейнека В.И., Лукина И.П., Дейнека Л.А. Антоцианы плодов некоторых видов рода Rubus L. из коллекции ботанического сада БелГУ. // Химия растительного сырья. - 2005. - №4. - С. 61-65.
373
Выпуск 15/1
8. Дейнека ЛА., Литвин Ю.Ю., Дейнека B^. Критерии для классификации винограда по антоциановому комплексу плодов // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. - 2008. - №7(47), Bbra.7. - С. 71-78.
9. Дейнека B■И■, Григорьев A.M., Дейнека Л■A■, Ермаков A.M., Сиротин A.A., Староверов B.M. Aнализ компонентного состава антоцианов плодов и жирных кислот масел семян некоторых видов семейства Rosaceae методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Растительные ресурсы. - 2005. - Bbra.l. - С. 91 -98.
10. Дейнека ЛА., Шапошник Е.И., Гостищев Д■A■, Дейнека B■И■, Сорокопудов B.H., Селе-менев B■Ф■ BЭЖХ в контроле антоцианового состава плодов черной смородины / / Сорбц. хром. процесс. - 2009. - Т.9, Bbra^ - С. 529-536.
11. Дейнека B.^, Григорьев A.M. Относительный анализ удерживания гликозидов циани-дина. // Ж. физ. химии. - 2004. - T. 78, №5. - С.923-926.
SOUR CHERRY FRUIT AND RELATED PLANTS ANTHOCYANINS
In the paper anthocyanin composition of series sour cherry fruits harvested in Belgorod State University Botanical Garden is reported. The approach is proposed based upon certain enzyme activity -6”-O-rhamnosyltransferase as well as 2”-O-glucosyltranspherse; that provide biosynthesis of all the series of cyanidine derivatives. Fruits of Cerasus mahaleb accumulate the maximum (550 - 750 mg per 100 g fresh fruit) doze of antocyanins among the other fruits under investigation.
Key words: HPLC, anthocyanins, Cerasus sp., Prunus avium, Prunus padus.
LA Deineka A.N.Chulkov V.l. Deineka V.l.Sorokopudov S.M. Shevchenko
Belgorod National Research University, 308015, Belgorod, Russia, Pobeda str.85
e-mail: deineka@bsu.edu.ru Ach87@mail.ru Deyneka@bsu.edu.ru sorokopudov@bsu.edu.ru shevchenko s@bsu.edu.ru
