CC BY
34
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
УДК 615.017:615.22:6167-08-035
[М
АНТИТРОМБОТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО БЕНЗИМИДАЗОЛА, ИМЕЮЩЕГО В СВОЕЙ СТРУКТУРЕ ПРОСТРАНСТВЕННО ЗАТРУДНЕННЫЙ ФЕНОЛЬНЫЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬ
Спасов А.А.1, Кучерявенко А.Ф.1, Гайдукова К.А.1, Черников М.В.2, Жуковская О.Н.3
1 Волгоградский государственный медицинский университет 400131, Россия, г. Волгоград, площадь Павших Борцов, д. 1
2 Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России 357532, Россия, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11
3 НИИ физической и органической химии Южного федерального университета 344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 194/2
Цель - изучение антитромбогенных свойств соединения РУ-1144 с ранее выявленной выраженной антиагрегантной и антиоксидантной активностью, на модели артериального тромбоза сонной артерии крыс, индуцированного хлоридом железа (III), в сравнении с известными антиагрегантными препаратами - ацетилсалициловой кислотой и клопи-догрелом, а также антиоксидантным препаратом - этилметилгидроксипиридина сукцинат.
Материалы и методы. Антитромботическая активность соединения РУ-1144 была изучена на модели артериального тромбоза сонной артерии крыс, вызванного аппликацией 50% хлорида железа (III) и модели Global Thrombosis Test (по Горогу). Оценку данного вида активности производили по удлинению времени образования тромба. Исследования влияния соединения РУ-1144 на параметр времени кровотечения проводили на мышах. В качестве препаратов сравнения использовали ацетилсалициловую кислоту, клопидогрел и ЭМГПС.
Результаты. Выявленное на модели артериального тромбоза, индуцированного аппликацией хлорида железа (III), антитромботическое действие субстанции РУ-1144, превосходило таковое как у ацетилсалициловой кислоты, так и у клопидогрела в 3,5 раза, и в 2,9 раза - у ЭМГПС. На модели Global Thrombosis Test (тест Горога) in vitro соединение РУ-1144 снижало тромбогенный потенциал крови в равной степени с ацетилсалициловой кислотой и клопидогрелом. При оценивании «времени кровотечения» вещество РУ-1144 пролонгировало кровотечение в среднем в 2 раза менее выражено чем АСК и клопидогрел.
Заключение. Проведенные исследования продемонстрировали у соединения РУ-1144 выраженную антитромботи-ческую активность, превышающую таковую у ацетилсалициловой кислоты, клопидогрела и ЭМГПС, при этом способность удлинять время кровотечения была достоверно ниже, чем у препаратов сравнения.
Ключевые слова: антитромботическая активность, тромбоз, бензимидазол, АСК, клопидогрел, этилметилгидроксипиридина сукцинат, тромбоз по Горогу, время кровотечения
Сокращения: ЭМГПС - этилметилгидроксипиридина сукцинат; АСК - ацетилсалициловая кислота.
ANTITROMBOTIC ACTIVITY OF A NEW BENZIMIDAZOLE DERIVATIVE WITH A SPATIALLY DIFFICULT PHENOLIC SUBSTITUTE IN ITS STRUCTURE
Spasov A.A.1, Kucheryavenko A.F.1, GaidukovaK.A.1, Chernikov M.V.2, Zhukovskaya O.N.3
1 Volgograd State Medical University
1, Pavshikh Bortsov Square, Volgograd, Russia 400131
2 Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University, 11, Kalinin av., Pyatigorsk, Russia 357532
3 Research Institute of Physical and Organic Chemistry, Southern Federal University 194, Bldg 2, Stachki Av., Rostov-on-Don, Russia 344090
Для цитирования: Спасов А.А., Кучерявенко А.Ф., Гайдукова К.А., Черников М.В., Жуковская О.Н. Антитромботическая активность нового производного бензимидазола, имеющего в своей структуре пространственно затрудненный фенольный заместитель. Фармация и фармакология. 2020;8(2):78-85. DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-78-85
© Спасов А.А., Кучерявенко А.Ф., Гайдукова К.А., Черников М.В., Жуковская О.Н., 2020
For citation: Spasov A.A., Kucheryavenko A.F., Gaidukova K.A., Chernikov M.V., Zhukovskaya O.N. Antitrombotic activity of a new benzimidazole derivative with a spatially difficult phenolic substitute in its structure. Pharmacy & Pharmacology. 2020;8(2):78-85. DOI: 10.19163/2307-92662020-8-2-78-85
Получено 10.02.2020
Рецензия (1) 10.04.2020
E-mail: aspasov@mail.ru Рецензия (2) 20.04.2020 Принята к печати 28.04.2020
Received 10 February 2020 Review (1) 10 April 2020
Review (2) 20 April 2020
E-mail: aspasov@mail.ru Accepted 28 April 2020
PHARMACY & DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-78-85
PHARMACOLOGY
The aim of the study was to investigate antithrombogenic properties of compound RU-1144 with previously identified pronounced antiplatelet and antioxidant activities. The thrombosis induced by Ferric chloride (FeCl3) was carried out in rats' carotid artery, in comparison with the known antiaggregant drugs - acetylsalicylic acid (ASA) and clopidogrel, as well as with the antioxidant preparation - ethylmethylhydroxypyridine succinate (EMHPS).
Materials and methods. The antithrombotic activity of compound RU-1144 was studied on the model of the rats with carotid artery thrombosis, induced by the application of 50% ferric chloride (FeCl3), and the Global Thrombosis Test model (the Gorog Thrombosis Test). The evaluation of this type of activity was carried out by prolonging the time of a blood clot formation. The studies of the compound RU-1144 effect on the bleeding time parameter were performed in mice. Acetylsalicylic acid, clopidogrel and EMHPS were used as reference drugs.
Results. The antithrombotic effect of the RU-1144 substance revealed in the model of arterial thrombosis induced by the application of ferric chloride (FeCl3), exceeded that of both acetylsalicylic acid and clopidogrel by 3.5 times and that of EMHPS by 2.9 times. In the model of the in vitro Global Thrombosis Test (the Gorog Thrombosis Test), compound RU-1144 reduced the thrombogenic potential of the blood equally with acetylsalicylic acid and clopidogrel. The assessment of "the bleeding time", caused by the RU-1144 substance, showed that the prolongation of bleeding was twice as less pronounced than that caused by ASA and clopidogrel.
Conclusion. The performed studies demonstrated a pronounced antithrombotic activity of compound RU-1144, which exceeded that of acetylsalicylic acid, clopidogrel and EMHPS, while the ability to prolong the bleeding time was reliably lower than that of reference drugs.
Keywords: antithrombotic activity, thrombosis, benzimidazole, ASA, clopidogrel, ethylmethylhydroxypyridine succinate, the Gorog Thrombosis Test, bleeding time
Abbreviations: EMHPS - ethylmethylhydroxypyridine succinate; ASA - acetylsalicylic acid.
ВВЕДЕНИЕ
Сердечно-сосудистые заболевания на данный момент являются ведущей причиной глобальной ин-валидизации и смертности во всем мире [1-3]. По данным Всемирной организации здравоохранения к 2030 году будет зарегистрировано более 20 миллионов смертей в год от заболеваний, связанных с повышением тромбогенного потенциала крови. Среди них - ишемическая болезнь сердца, инсульт, нарушение периферического кровообращения, осложнения сахарного диабета и др., поэтому антиагрегантная терапия является важной составляющей в различных областях клинической практики [4].
Известно, что атеросклеротическая бляшка приводит к неравномерному сужению участка сосуда и, в результате этого, при прохождении потока крови через это место возникают турбулентные ускорения, влияющие в свою очередь на форменные элементы крови, прежде всего эритроциты и тромбоциты, повышая их агрегационную способность. Помимо форменных элементов, воздействию подвергается стенка сосуда, что выражается в повреждении эндотелия, возникновении возможности контакта коллагеновых волокон с тромбоцитами с последующей их адгезией на поврежденной поверхности, активацией, агрегацией и образованием тромба [5].
Таким образом, активация тромбоцитарного звена гемостаза может стать причиной осложнений со стороны сердечно-сосудистой системы, а именно возникновения артериальных тромбозов [1]. Кроме того, важная роль в патогенезе тромбообразования отводится активации процессов перекисного окисления липидов, усиление которой приводит к повышению процессов агрегации тромбоцитов и коагуля-ционного звена гемостаза [6, 10]. Данная концепция является теоретическим обоснованием использования антиоксидантных средств, в качестве допол-
нительной патогенетической терапии артериальных тромбозов. Таким образом, проведение своевременных и правильных профилактических мероприятий, направленных на ингибирование процессов агрегации тромбоцитов и перекисного окисления липидов, может предотвращать преждевременную смерть, увеличивать продолжительность жизни, улучшать ее качество, а также снижать экономические затраты общества на лечение и реабилитацию [7-9].
В ходе ранее проведенных исследований, среди гетероциклических соединений были выявлены вещества, проявляющие антиагрегантные и антиокси-дантные свойства [11-13]. Соединение под шифром РУ-1144 (1-(2,6-дитретбутил-4-(1-гидроксиэтил)-фе-нил-пиримидобензимидазолгидрохлорид), способно ингибировать процессы агрегации тромбоцитов и перекисного окисления липидов, превосходя препараты сравнения ацетилсалициловую кислоту, клопи-догрел и этилметилгидроксипиридина сукцинат [31]. Существуют различные методы исследования данных видов активности [15, 16]. Однако наиболее распространенным является изучение антитромботиче-ских свойств на моделях артериальных тромбозов.
Поэтому, целью нашего исследования явилось сравнительное изучение антитромботической активности соединения РУ-1144 и антиагрегантных препаратов с высокой доказательной базой ацетилсалициловой кислоты и клопидогрела, а также анти-аоксидантного средства ЭМГПС на модели артериального тромбоза сонной артерии крыс, а также на модели Global Thrombosis Test (по Горогу) и влияние на параметр «время кровотечения».
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные
Эксперименты выполнены на108 белых нелинейных крысах-самцах массой 250-300 г и 24 белых беспо-
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
родных мышах-самцах, массой 20-22 г, содержащихся в условиях вивария (температура 22-24°С, относительная влажность воздуха 40-50%) с естественным световым режимом на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92). Все животные получены из питомника ООО «НИЦБМТ». Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.08.2014 №51 «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Все животные подвергались карантину в течение 14 дней (крысы и мыши) в условиях отдельных боксов вивария ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России. В течение карантина, не менее чем 2 раза (1 и 14 день у крыс и мышей) проводилось измерение массы тела животных. Ежедневно проводили контроль клинического состояния путем визуального осмотра в группах. Животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями были исключены из экспериментальных групп. Все процедуры с животными в исследовании проводились в соответствии с общепринятыми этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (1986) и с учетом Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Все процедуры с животными проводились в соответствии со стандартами, изложенными в восьмом издании руководства по уходу и использованию лабораторных животных и ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Экспериментальное исследование одобрено Региональным Исследовательским Этическим Комитетом Волгоградской области протокол № 2083-2016 от 18.11.2016 г. Данное исследование выполнено в соответствии с требованиями «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [15].
Дизайн исследования
Проведено экспериментальное исследование антитромботической активности производного бен-зимидазола под шифром РУ-1144 (1-(2,6-дитретбу-тил-4-(1-гидроксиэтил)-фенил-пиримидобензимида-зол гидрохлорид) (НИИ ФОХ ЮФУ), имеющего в своей структуре пространственно затрудненный феноль-ный заместитель. В качестве препаратов сравнения были выбраны известные антиагрегантные средства с высокой доказательной активностью-ацетилсали-циловая кислота («Sigma», США) и клопидогрел («Sanofi», Франция), а также антиоксидантное средство - этилметилгидроксипиридина сукцинат («ЭМГПС»®, ООО «Фармасофт», Россия) [16]. Соединение РУ-1144 и препараты сравнения вводились внутрижелудочно с помощью интрагастрального зонда.
В качестве растворителя веществ использовали очищенную дистиллированную воду. Антитромботи-ческую активность соединения РУ-1144 и препаратов сравнения изучали на модели артериального тромбоза сонной артерии крыс, вызванного поверхностной аппликацией 50% раствора хлорида железа (III). Исследуемые вещества вводили крысам однократно внутрижелудочно за 2 часа до нанесения тромботи-ческого агента на сонную артерию животных [17]. За 30 минут до начала воспроизведения экспериментального артериального тромбоза крыс внутрибрю-шинно наркотизировали хлоралгидратом (400 мг/кг). После наступления наркоза послойно вскрывали кожу и ткани, выделяя сонную артерию. На небольшой участок сонной артерии укладывали ватный диск, смоченный 50% раствором хлорида железа (III) (0,025 мл). При помощи специальной пленки «Parafilm» изолировали окружающие ткани. Для регистрации изменений кровотока использовали ультразвуковой допплерограф «Минимакс-Допплер-К» («Минимакс», Санкт-Петербург). Ультразвуковой датчик аппарата устанавливали на небольшом расстоянии от ватного диска, наложенного на сонную артерию. Регистрацию кровотока проводили до полной окклюзии сосуда.
Соединение РУ-1144 и препараты сравнения были изучены в дозах эквимолярных дозе 19 мг/кг ацетилсалициловой кислоты (фармакологически активная доза, полученная на модели АДФ-индуциро-ванной агрегации тромбоцитов крыс в тесте in vivo). Для исследуемого вещества РУ-1144 эта доза составила 48 мг/кг, а для препаратов сравнения клопидогрела и ЭМГПС - 32 и 28 мг/кг соответственно). В зависимости от проявленного антитромботического эффекта с целью определения ED50 (доза, в которой изученные соединения увеличивают время наступления полной окклюзии сосуда тромбом по отношению к контролю на 50%), исследуемые дозы веществ и препаратов сравнения либо увеличивались, либо уменьшались. Соединение РУ-1144 было также изучено в дозах 24 и 12 мг/кг, АСК - 100 и 150 мг/кг, клопидогрел - 60; 120 и 180 мг/кг, а препарат сравнения ЭМГПС исследовался в дозах, которые составили 150 и 100 мг/кг, соответственно.
Антитромботическую активность соединения РУ-1144 исследовали на модели Global Thrombosis Test invitro с исследованием биологического материала exvivo после однократного внутрижелудочного введения в дозе 18,8 мг/кг (фармакологически активная доза, полученная на модели АДФ-индуцирован-ной агрегации тромбоцитов крыс в тесте in vivo) [18]. Препараты сравнения ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел исследовали в дозах 28,5 и 13,8 мг/кг соответственно. Через 2 часа после введения исследуемых соединений осуществляли забор крови из брюшной аорты шприцем в объеме 5 мл, содержащим 20 мкМ индуктора агрегации тромбоцитов АДФ.
PHARMACY & DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-78-85
PHARMACOLOGY
Животных предварительно наркотизировали хлоралгидратом (внутрибрюшинно - 400 мг/кг). Полученную кровь немедленно помещали в специальную пробирку Горога без добавления стабилизаторов и консервантов. Основными критериями оценки анти-тромботического действия тестируемого соединения и препаратов сравнения служили показатели времени окклюзии и времени лизиса, анализ которых осуществляли при помощи программного обеспечения GTT Draw 2.3.
С целью определения нежелательного эффекта антиагрегантных препаратов была использована модель «время кровотечения на мышах» [19]. Для воспроизведения данной модели предварительно проводили наркотизацию животных, используя хлоралгидрат в дозировке 400 мг/кг, после чего отсекали 5 мм кончика хвоста, который помещали в пробирку с физиологическим раствором, находящейся на водяной бане (37°С). Для оценки эффекта регистрировали время, выраженное в секундах, от момента отсекания кончика хвоста до момента полной остановки кровотечения. По действию на данный параметр соединение РУ-1144 было изучено в дозе 18,8 мг/кг, а препараты сравнения АСК и клопидогрел в дозах 28,5 и 13,8 мг/кг соответственно. Введение исследуемых соединений осуществляли за 2 часа до начала эксперимента.
Группы контрольных животных получали очищенную дистиллированную воду внутрижелудочно однократно в эквивалентном объеме.
Статистическая обработка результатов
Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с использованием критерия Манна-Уитни, критерия one-way ANOVA с поправкой Бонферрони при помощи пакета статистических программ GraphPad Prism5.0. («GraphPad», США) и Microsoft Excel 2007 (Microsoft, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ходе исследования на модели артериального тромбоза, были получены данные, свидетельствующие о наличии антитромботических свойств исследуемого вещества и препаратов сравнения.
Среднее время окклюзии сонной артерии животных контрольной группы составило 19,4±1,5 мин. (табл. 1), что согласуется с литературными данными [23, 26].
Соединение РУ-1144, в дозе равной 48 мг/кг достоверно пролонгировало время полной окклюзии сонной артерии до 31,4 мин., что на 61,1% достоверно превосходило данный показатель контрольной группы животных. При дальнейшем снижении дозы тестируемого соединения до 24 мг/кг время образования тромба также достоверно уменьшалось и составляло 27 мин. Дальнейшее уменьшение дозы до 12 мг/кг достоверно пролонгировало насту-
пление полной окклюзии сонной артерии на 14,1% (табл. 1).
АСК в дозе 19 мг/кг недостоверно по отношению к контролю пролонгировала время образования тромба на 6,4%. Поэтому в дальнейшем исследовании дозы ацетилсалициловой кислоты были повышены до 100 и 150 мг/кг. При этом, в дозе 100 мг/кг препарат сравнения увеличивал время наступления полной окклюзии сонной артериина 29,5%, а в дозе 150 мг/кг - на 58,5%. Таким образом, повышение дозы ацетилсалициловой кислоты увеличивало исследуемый показатель на 58,5% (табл. 1).
Клопидогрел в дозе 32 мг/кг достоверно удлинял время тромбообразования на 9,0% по сравнению с группой контрольных животных. Дальнейшее увеличение дозы до 60 мг/кг, а затем до 120 и 180 мг/кг, приводило к увеличению времени до полной окклюзии сонной артерии на 21,8, 34,6 и 65,4%, соответственно (табл. 1).
ЭМГПС в дозе 28 мг/кг увеличивал время наступления полной окклюзии сонной артерии крыс на 8,11%. Повышение дозы препарата до 100 и 150 мг/кг приводило к удлиняло данный показатель на 41,03 и 75,21% соответственно.
Исходя из полученных данных, были рассчитаны ED50 антитромботической активности соединения РУ-1144 и препаратов сравнения. Так, для тестируемого образца РУ-1144 данная величина составила 37,8 мг/кг, для ацетилсалициловой кислоты - 133,0 мг/кг, а для клопидогрела и ЭМГПС - 132,0 и 108,4 мг/кг, соответственно. Таким образом, по показателю ED50 антитромботической активности соединение РУ-1144 превосходило антиагрегантные препараты ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел в 3,52 и 3,49 раза соответственно, а антиоксидантное средство ЭМГПС - в 2,87 раза.
На следующем этапе была исследована анти-тромботическая активность соединения РУ-1144 и препаратов сравнения АСК и клопидогрела на модели Global Thrombosis Test (по Горогу). При выполнении данного эксперимента в контрольной группе животных время наступления полной окклюзии в тест системе составило 95,2 с. (табл. 2). Исследование биологического материала животных, которым внутрижелудочно вводили соединение РУ-1144, показало статистически достоверное увеличение времени наступления полной окклюзии на 37% по сравнению со значениями, полученными в контрольной группе и составило 130,5 с. При этом исследуемое соединения недостоверно увеличивало время лизиса относительной контроля (табл. 2).
Референсный препарат - АСК, изученная в дозе 28,5 мг/кг, также достоверно приводила к пролонгированию времени наступления полной окклюзии в тест системе, при этом данный показатель в 1,2 раза превышал показатель контрольной группы животных, при этом не влияла на время лизиса сгустка.
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
Таблица 1 - Влияние соединения РУ-1144, АСК, клопидогрела и ЭМГПС на время полной окклюзии сонной артерии крыс на модели артериального тромбоза, индуцированного аппликацией
хлорида железа (III) (M±m) (n=6)
№ п/п Тестируемые образцы Доза, мг/кг Время образования тромба, мин. Д% пролонгирования времени образования тромба ED50, мг/кг
1 Контроль 19,4±1,5
12 22,3±0,7* 14,1±3,6*
2 РУ-1144 24 27,0±0,6* 38,5±2,8* 37,8
48 31,4±1,0* 61,1±5,4*
19 20,8±0,3* 6,4±1,6*
3 АСК 100 25,3±0,5* 29,5±2,5* 133,0
150 30,9±0,3* 58,5±1,4*
32 21,3±0,3* 9,0±1,3*
4 Клопидогрел 60 23,8±0,3* 21,8±1,6* 132,0
120 25,8±0,4* 34,6±1,3*
180 32,3±0,4* 65,4±2,2*
28 21,1±0,3* 8,1±1,6*
5 ЭМГПС 100 27,5±0,6* 41,0±2,9* 108,4
150 34,2±0,8* 75,2±4,3*
Примечания:
n - число животных в группе
* - данные достоверны по отношению к контролю (критерий Манна-Уитни, p<0,05)
Таблица 2 - Антитромботическая активность соединения РУ-1144 и препаратов сравнения АСК и клопидогрела на модели Global Thrombosis Test (по Горогу) ex vivo (M±m, n=6)
№ п/п Тестируемые образцы Доза, мг/кг Время окклюзии, с Время лизиса, с
1 Контроль - 95,2±1,4 635,2±29,0
2 РУ-1144 18,8 130,5±7,8* 711,2±39,4
3 Ацетилсалициловая кислота 28,5 117,5±4,1* 629,3±15,7
4 Клопидогрел 13,8 150,0±4,0* 631,5±17,1
Примечания:
n - число животных в группе
* - данные достоверны относительно контроля, критерий Манна-Уитни (p<0,05)
Таблица 3 - Влияние соединения РУ-1144, АСК и клопидогрела на время кровотечения из хвостовой вены мышей, в дозах ED антиагрегантной активности in vivo (M±m) (n=6)
№ п/п Тестируемые образцы Доза, мг/кг Время кровотечения, с Д% пролонгирования времени кровотечения
1 Контроль 349,3±7,2
2 РУ-1144 18,8 445,5±10,5*# 27,5±3,0*#
3 АСК 28,5 583,9±9,1* 67,2±2,6*
4 Клопидогрел 13,8 566,0±10,0" 62,0±2,9*
Примечания:
n - число животных в группе
* - данные достоверны по отношению к контролю, критерий one-wayANOVA с поправкой Бонферрони (p<0,05)
# - данные достоверны по отношению к препаратам сравнения, критерий one-wayANOVA с поправкой Бонферрони (p<0,05)
Таблица 4 - Антиагрегантная активность соединения РУ-1144 и препаратов сравнения в исследованиях in vitro (IC) и in vivo (ED )
№ п/п Тестируемые образцы 1С50,мкМ ED50 мг/кг
1 РУ-1144 5,5 18,8
2 АСК 120,0 28,5
3 Клопидогрел —* 13,8
Примечания:
* - в виду того, что клопидогрел является пролекарством, он не может использоваться в in vitro тестах.
PHARMACY & DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-78-85
PHARMACOLOGY
В группе животных, получавших клопидогрел, время окклюзии было на 57,6% выше показателей контрольной группы исследования, но при этом время лизиса было сравнимо со значениями, полученными в группе исследования контрольных животных (табл. 2).
Таким образом, как видно из полученных результатов исследования на данной модели наибольшее антитромботическое действие продемонстрировал препарат сравнения клопидогрел, который в исследуемой дозе увеличивал время окклюзии тест-системы в 1,7 раза, недостоверно превосходя соединение РУ-1144 и достоверно превосходя ацетилсалициловую кислоту в 1,3 раза. Также показано, что исследованные соединения не оказывают влияния на показатель времени лизиса.
При исследовании влияния соединения РУ-1144 и препаратов сравнения на время кровотечения из хвостовой вены мышей было показано, что в контрольной группе животных данный параметр составил 349,3 с, что совпадает с данными полученными другими исследователями [26]. В таблице 3 отображены результаты изучения влияния тестируемого образца РУ-1144, АСК и клопидогрела на время кровотечения из хвостовой вены мышей.
Так, соединение РУ-1144 приводило к достоверному относительно группы контрольных мышей увеличению времени кровотечения на 27,5%, в то время как АСК и клопидогрел пролонгировали время кровотечения в два раза активнее - на 67,2 и 62,0%, соответственно (табл. 3.). Таким образом, соединение РУ-1144 в меньшей степени оказывало влияние на данный показатель, чем референсные препараты.
ОБСУЖДЕНИЕ
В инициации процессов развития артериального тромбоза значительную роль играют сложные ме-диаторные взаимодействия между тромбоцитами с вовлечением различных факторов агрегации. Предварительные исследования антиагрегантной активности соединения РУ-1144 в сопоставлении с кло-пидогрелом и ацетилсалициловой кислотой, как в условиях in vitro, так и in vivo, позволили определить ингибирующие концентрации(1С50) и эффективные дозы (ED50) данных соединений (табл. 4).
Как показано в табл. 4, при исследовании in vitro, соединение РУ-1144 в 21,8 раза превосходит по активности АСК, а в условияхт vivo- в 1,5 раза, при этом уступая в 1,3 раза клопидогрелу. По литературным данным, при тромботическом поражении сосудистой стенки аппликацией 50%-м хлоридом железа (III) происходит непосредственное взаимодействие железа с перекисью водорода, образование гидрок-сил-анионов и изменение фосфолипидного состава мембран тромбоцитов. Вышеуказанные процессы повышают функциональную активность тромбоцитов [21-23, 29]. Кроме того, в крови накапливается
окисленный фибриноген, который активирует процесс тромбообразования. Пероксидация липидов в мембранах эндотелиоцитов приводит к системным нарушениям функций эндотелия и повышает его проницаемость. Данная модель тромбоза позволяет изучать влияние соединений на скорость формирования артериального (белого) тромба, состоящего в основном из тромбоцитов. Именно, поэтому данная модель была выбрана для изучения соединения РУ-1144, сочетающего два вида активности: антагре-гантную и антиоксидантную.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что соединение РУ-1144 проявляет выраженную антитромботическую активность, превышающую таковую у препаратов сравнения что обусловлено его способностью ингибировать процессы агрегации тромбоцитов и перекисного окисления липидов и тем самым препятствовать возникновению артериального тромбоза в сонной артерии крыс.
Метод «Global Thrombosis Test», позволяет проводить исследования не только антитромботической, но и тромболитической активности соединений. В условиях повышенной турбулентности тока крови в тест-системе Горога соединение РУ-1144 показало способность увеличивать время образования тромба по сравнению со значениями в группе контрольных животных и недостоверное превосходство активности по сравнению с ацетилсалициловой кислотой, однако при этом недостоверно уступая клопидогре-лу. Время лизиса под действием тестируемого образца не изменялось, что позволяет сделать вывод об отсутствии у соединения РУ-1144 фибринолитиче-ской активности.
Известно, что при проведении длительной терапии антиагрегантными препаратами наблюдается развитие такого побочного эффекта, как кровотечения. Наиболее часто развиваются кровотечения, которые наблюдаются в системе желудочно-кишечного тракта, а также не редки проявления внутричерепных кровоизлияний, вследствие чего происходит увеличение риска ишемических событий [25-28].
Исследование показало, что соединение РУ-1144 увеличивает время кровотечения из хвостовой вены мышей, однако в отличие от АСК и клопидогрела данный эффект выражен в меньшей степени, что позволяет сделать предположение о низкой вероятности возникновения побочного эффекта в виде кровотечения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На модели артериального тромбоза сонной артерии крыс, индуцированного 50%-ным раствором хлоридом железа (III) соединение под лабораторным шифром РУ-1144 оказывает выраженное антитромботическое действие, превосходя антиагрегантные препараты - ацетилсалициловую кислоту и клопи-
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
догрел в 3,52 и 3,49 раза соответственно, а антиок-сидантное средство ЭМГПС в 2,87 раза. В условиях повышенной турбулентности тока крови в тест-системе Горога тестируемый образец РУ-1144 показал способность увеличивать время образования тромба, сравнимое с ацетилсалициловой кислотой и клопи-догрелом, при этом не оказывая влияние на время
его лизиса. При исследовании соединения РУ-1144 в тесте «время кровотечения» была показана способность тестируемого образца пролонгировать данный показатель, что характерно для группы антиагреган-тов, но при этом, в сравнении с ацетилсалициловой кислотой и клопидогрелом, в меньшей степени удлинять данное время.
ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА
Данное исследование не имело какой-либо финансовой поддержки от сторонних организаций.
АВТОРСКИЙ ВКЛАД
Все авторы в равной степени внесли свой вклад в исследовательскую работу.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Papapanagiotou A., Siasos G., Gargalionis A., Papavassiliou A.G. et al. The Role of Platelets in Cardiovascular Disease: Molecular Mechanisms // Curr Pharm Des. - 2016. -V. 22, N 29. - P. 4493-4505. DOI: 10.2174/138161282266 6160607064118
2. Mozaffarian D., Benjamin E.J., Go A.S., Arnett D.K., Blaha M.J., et al. Heart disease and stroke statistics (a report from the American Heart Association) // Circulation. - 2016. -N 133. - P. 38-60. DOI: 10.1161/CIR.0000000000000485
3. Reed G.W., Rossi J.E., Cannon C.P. Acute myocardial infarction in women // Lancet. - 2017. - V. 14, N 389. -P. 197-210. DOI: 10.1016/S0140-6736(16)00267-1
4. Grove E.L., Wurtz M., Thomas M.R., Kristensen S.D. Antiplatelet therapy in acute coronary syndromes // Expert. Opin. Pharmacother. - 2015. - V. 16, N 14. - P. 2133-2147. DOI: 10.1517/14656566.2015.1079619
5. Shaturny! V.I., Shakhidzhanov S.S., Sveshnikova A.N., Pan-teleev M.A. Activators, receptors and signal transduction pathways of blood platelets. Biomed Khim. - 2014. - V. 60, N 2. - P. 182-200. DOI: 10.18097/pbmc20146002182
6. Ambrosio D., Tritto I., GoIino P. Reactive oxygen metabolites and arterial thrombosis. Cardiovascular Research. - 1998. - V. 34. - P. 4445-4524. DOI: 10.1016/s0008-6363(97)00101-6
7. Aboonabia A., Singh I. The effectiveness of antioxidant therapy in aspirin resistance, diabetes population for prevention of thrombosis // Biomedicine & Pharmacotherapy. - 2016. V. 83. - Р. 277-282. DOI: 10.1016/j.bio-pha.2016.06.044
8. Чещевик В.Т., Жерносеков Д.Д. Тромбоцитарная агрегация. Механизм участия адгезивных молекул и митохондрий // Вестник Полесского государственного университета. - 2017. - № 2. - С. 51-61
9. Roka-Moya Y.M. et al. Novel aspects of platelet aggregation // Biopolym. cell. - 2014. - Vol. 30, N 1. - P. 10-15. DOI: http: // dx.doi.org/10.7124/bc.000874
10. Гордеев И.Г., Бекчиу Е.А., Люсов В.А., Волов Н.А., Ильина Е.Е., и др. Оценка влияния миокардиальных цито-протекторов на процессы перекисного окисления ли-пидов у больных стабильной стенокардией до и после хирургической реваскуляризации миокарда // Российский кардиологический журнал. - 2005. - №3 (53). -С. 41-46.
11. Спасов А.А., Кучерявенко А.Ф., Сиротенко В.С., Гайду-
кова К.А., Морковник А.С., Анисимова В.А., Диваева Л.Н., Кузьменко Т.А. Антитромботическая активность нового производного диазепинобензимидазола соединения ДАБ-15 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2016. - Т. 162, № 11. -С. 585-588.
12. Спасов А.А., Кучерявенко А.Ф., Косолапов В.А., Анисимова В.А. Антитромбогенная активность антиоксидант-ных соединений // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 155, № 6. -С. 740-742.
13. Kosolapov V.A., Spasov A.A., Аnisimova VA, Zhukovska-ya O.N. Condensed Benzimidazoles Are a Novel Scaffold for Antioxidant Agents' Search and Development // Antioxidants. - 2019. - P. 245-253. DOI: 10.5772/inte-chopen.82817
14. Spasov A.A., Nedogoda V.V., Konan K., Kucheryavenko A.F. Mechanism of reduction of platelet sensitivity to medicines in response to low-energy laser radiation of blood // Hematology and transfusiology. - 2001. - Т. 46, N 2. С. 36-39.
15. Макаров В.А., Спасов А.А., Плотников М.Б., Белозерская Г.Г., Васильева Т.М. и др. Методические рекомендации по изучению лекарственных средств, влияющих на гемостаз. В кн: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. - Москва, 2012. - С. 453-479.
16. Житникова Л.М. АСК в профилактике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний: клинические рекомендации для практикующих врачей // РМЖ. Кардиология. - 2012. - №14. - C. 708-713.
17. Kurz K.D., Main B.W., Sandusky G.E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride // Thromb. Res. - 1990. - N 15. - P. 269-280. DOI: 10.1016/0049-3848(90)90106-m
18. Yamamoto J., Inoue N. et al. Global Thrombosis Test (GTT) can detect major determinants of haemostasis including platelet reactivity, endogenous fibrinolytic and thrombin generating potential // Thrombosis Research. - 2014. -V. 133. - P. 919-926. DOI: 10.1016/j.thromres.2014.02.018
19. Greene T.K., Schiviz A. et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model // J. Thromb. Haemost. -2010. - V. 8, N 12. - P. 2820-2822. DOI: 10.1111/j.1538-7836.2010.04084.x
PHARMACY & DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-78-85
PHARMACOLOGY
20. Haber F., Weiss J. On the catalysis of hydroperoxide // Naturwissenschaften. - 1932. - V. 20. - P. 948-950.
21. Freedman J. E. Oxidative Stress and Platelets // Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. - 2008. - N 28. - P. 11-16. DOI: 10.1161/ATVBAHA.107.159178. Epub 2008 Jan 3.
22. Sies H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine // Redox Biol. - 2015. - N 4. - P. 180-183. DOI: 10.1016/j.redox.2015.01.002
23. Dogne J.M., Hanson J., Leval X. et al. Pharmacological characterization of N-tert-Butyl-N-[2-(4-methylphenylamino)-5-nitrobenzenesulfonyl]urea (BM-5730, a novel Thromboxane A2 receptor antagonist and thromboxane synthase inhibitor in a rat model of arterial thrombosis and its effects on bleeding time // J. of Pharmacol. And Exp. Therap. - 2004. - N 309. -P. 498-505. DOI: 10.1124/jpet.103.063610
24. Buccheri S., Capodanno D., James S., Angiolillo D.J. Bleeding after antiplatelet therapy for the treatment of acute coronary syndromes: a review of the evidence and evolving paradigms // Expert Opin Drug Saf. - 2019. -N 25. - P. 1-19. DOI: 10.1080/14740338.2019.1680637
25. Qiu L., Han J.X., See A.A.Q., King N.K.K. Effects of anticoagulant and antiplatelet agents in severe traumatic brain injury in an asian population - A matched case-control study // J Clin Neurosci. - 2019. - P. 61-66. DOI: 10.1016/j.jocn.2019.08.087.
26. Спасов А.А., Кучерявенко А.Ф., Тянь М., Анисимо-ва В.А. Антитромботическая активность соединения
РУ-891 // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2013. - Т. 76. - № 6. - С. 25-26. DOI: https: // DOI.org/10.30906/0869-2092-2013-76-6-25-26
27. Spronk H. M. H., Padro T., Siland J. E. Atherothrombosis and Thromboembolism: Position Paper from the Second Maastricht Consensus Conference on Thrombosis // Thromb Haemost. - 2018. - V. 118, N 2. - Р. 229-250. DOI: 10.1160/TH17-07-0492
28. Dadjou Y., Safavi S., Javad K. Risks and Benefits of Dual Antiplatelet Therapy Beyond 12 Months After Coronary Stenting // Medicine (Baltimore). - 2016. - V. 95, N 22. -P. 1-7. DOI: 10.1097/MD.0000000000003663
29. Шахмарданова С.А., Гулевская О.Н., Селецкая В.В., Зеленская А.В. и др. Антиоксиданты: классификация, фармакотерапевтические свойства, использование в практической медицине // Журнал фундаментальной медицины и биологии. - 2016. - N 3. - С. 4-12.
30. Bath P.M., May J., Heptinstall S. Clinical utility of remote platelet function measurement using P-selectin: assessment of aspirin, clopidogrel, and prasugrel and bleeding disorders // Platelets. - 2018. - N 29(5). -P. 425-430. DOI: 10.1080/09537104.2018.1445839
31. Spasov A.A., Kucheryavenko A.F., Gaidukova K.A., Kosolapov V.A., Zhukovskaya O.N. Antiplatelet activity of new derivatives of benzimidazole containing sterically hindered phenolic group in their structure // Research Results in Pharmacology. - V. 6, N 1. - P. 1-9. DOI: 10.3897/rrpharmacology.6.50373
Спасов Александр Алексеевич - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии и биоинформатики ВолгГМУ. ORCID ID: 0000-0002-7185-4826. E-mail: aspasov@mail.ru
Кучерявенко Аида Фатиховна - доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры фармакологии и биоинформатики ВолгГМУ. ORCID ID: 00000003-1406-6919. E-mail: aidakuchryavenko@yandex.ru Гайдукова Ксения Андреевна - ассистент кафедры фармакологии и биоинформатики
ВолгГМУ. ORCID ID: 0000-0003-4376-6332. E-mail: ksenijagajjdukva@rambler.ru
Черников Максим Валентинович - доктор медицинских наук, заведующий кафедрой биологии и физиологии ПМФИ. ORCID ID:0000-0001-8340-1296. E-mail: pharmax@list.ru
Жуковская Ольга Николаевна - кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории органического синтеза НИИ физической и органической химии Южного федерального университета. ORCID ID: 00000003-0865-6656. E-mail: zhukowskaia.ol@yandex.ru
