CC BY
32
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.248-022.7-097-078.33
Е. И. Руднева1, И. В. Маянская2, А. Н. Маянский1
антитела к рибосомальным белкам респираторных бактерий в сыворотке крови у здоровых доноров и детей с различными хроническими заболеваниями
1Кафедра микробиологии и иммунологии ГБОУ ВПО НижГМА Минздравсоцразвития России (603005, г Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, 10/1); Труппа клинической иммунологии ФгБУ Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Минздравсоцразвития России (603095, г. Нижний Новгород, ул. Семашко, 22)
Бактерии респираторного тракта являются одним из главных факторов, с которыми связано хроническое течение бронхиальной астмы. Представлены результаты изучения титров антител (Ат) к рибосомальным белкам бактерий, входящих в состав препарата «Рибомунил» (Н. influenzae, S. pneumoniae, S. pyogenes, K. pneumoniae). Сыворотки, полученные от здоровых взрослых доноров и здоровых детей (11-14 лет), содержали IgG-АТ к рибомунилу в разведении от 1:0 до 1:1600 (взрослые) и от 1:10 до 1:320 (дети). Среди взрослых были те, кто имел нулевые показатели АТ. АТ к рибомунилу включали IgM- и IgA-изотипы, тогда как все АТ в пуповинной крови от здоровых новорожденных принадлежали к IgG-изотипу. Не обнаружено статистически значимых различий между содержанием АТ у здоровых детей и детей с хроническими воспалительными заболеваниями органов пищеварения и атопическим дерматитом. Напротив, у детей, больных бронхиальной астмой, выявлено 16-кратное увеличение титров АТ к рибомунилу. При муковисцидозе легких титры АТ были повышены в 2 раза по сравнению с аналогичным показателем у здоровых детей. Высказано предположение, согласно которому одной из причин повышенных показателей антирибосомальных АТ является хроническая бактериальная инфекция, протекающая в респираторном тракте больных бронхиальной астмой.
Ключевые слова: бронхиальная астма, антитела к рибосомальным белкам бактерий E.I., Rudneva, I.VMayanskaya, T.A. Blinova, A.N.
MAYANSKY ANTIBODIES TO RIBOSOMAL PROTEINS OF RESPIRATORY BACTERIA IN BLOOD SERUM OF HEALTHY DONORS AND CHILDREN WITH DIFFERENT DISEASES
Bacteria of respiratory tract belong to one of the main factors which influence the chronic form of bronchial asthma. In this article are presented data of antibody titres to ribosomal antigens included into the preparation «Ribomunil». Blood sera received from healthy adult donors and healthy children (11-14 years) contained IgG antibodies to bacterial ribomunil in titers of 0 to 1:1280 (adults; Me=1:40) and 1:10 to 1:320 (children; Me=1:80). There were some adults that had zero indexes of antibodies. Antiribomunil antibodies included the immunoglobulins of IgM and IgA isotypes while all antibodies contained in the umbilical cord blood of healthy newborn belonged to IgG isotype. There was no statistically significant difference between antibody concentration of healthy children and children suffering from chronic inflammation of intestinal organs or atopic dermatitis. On the contrary, the children with bronchial asthma had the 16-fold increase of antibody titres. The children with pulmonary cystic fibrosis had the 2-fold higher titres comparing with healthy children. It is supposed that one of the main causes of higher results of antiribosome antibodies is the chronic bacterial infection running in respiratory tract of the bronchial asthma patients.
Key words: bronchial asthma, antibodies to ribosomal bacterial antigens
Инфекции респираторного тракта всегда ассоциировались с развитием бронхиальной астмы [1, 2, 6, 15]. Главную роль сегодня отводят респираторным вирусам, прежде всего риновирусам [6, 16, 20]. Меньше внимания уделяют бактериям, колонизирующим дыхательные органы. Между тем они участвуют в формировании хронического воспаления в бронхах - главного патогенетического звена, от которого зависит персистентное течение бронхиальной астмы [2, 8, 21]. К таким бактериям относятся Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catharralis, Streptococcus pyogenes, которые постоянно контактируют с людьми и колонизируют респираторный тракт с раннего детства [9, 10]. Показано, что бактериальная колонизация в годовалом возрасте сопровождается повышенной заболеваемостью бронхиальной астмой в последующие годы [9].
Рибомунил - препарат, содержащий рибосомальные белки четырех видов бактерий: H. influenzae, S. pneumoniae, S. pyogenes, K. pneumoniae. Для внутриклеточных белков характерен антигенный консерватизм, поэтому их можно рассма-
Руднева Екатерина Ивановна - ассистент каф., тел. 8(915)940-27-23, e-mail: [email protected]
тривать как стандартные антигены, которые будут действовать постоянно на человеческий организм [3]. Это объясняет то, что в данной работе в качестве стандарта использовали обычный (нормальный) иммуноглобулин человека.
Материалы и методы. Обследованы 71 взрослый донор крови (сыворотки получены из Областного центра крови им. Н. Я. Климовой, Нижний Новгород), 35 здоровых детей (возраст 11-14 лет; сыворотки получены из Научного центра здоровья детей РАМН, Москва), 140 больных детей (возраст от 6 мес до 17 лет) с различными диагнозами: бронхиальной астмой (n = 34), муковисцидозом (n = 18), хроническими заболеваниями толстой кишки (n = 30), целиакией и хроническим энтеритом (n = 34), хроническим гастродуоденитом (n = 14), атопическим дерматитом (n = 10), хроническим гепатитом (n = 31; гепатит B и C, аутоиммунный гепатит). Детей с бронхиальной астмой обследовали в Областной детской клинической больнице (Нижний Новгород), больные с остальными диагнозами находились на лечении в НИИ детской гастроэнтерологии (Нижний Новгород). Клиническое наблюдение за детьми и постановку диагноза выполняли в соответствии со стандартами оказания высокотехнологичной медицинской помощи, утвержденными приказами Минздравсоцразвития РФ. Прием рибомунила исключали на основании анамнеза,
- 260 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
взятого у родителей. Дополнительно изучили 25 образцов сыворотки пуповинной крови от здоровых новорожденных (сыворотки получены из Научного центра здоровья детей РАМН, Москва).
Уровень антител (АТ) определяли методом иммуноферментного анализа. Использовали полистироловые 96-луночные микропланшеты (НИИ «Медполимер», Москва) и конъюгаты против IgA, IgM («Medac», Германия), IgG (ООО «Сорбент», Подольск). В качестве контроля использовали препарат нормального иммуноглобулина человека (Областной центр крови им. Н. Я. Климовой, Нижний Новгород). Ри-бомунил взвешивали в фосфатном буфере (pH 9,5) из расчета 1 мг/мл, солюбилизировали ультразвуком 2 мин при частоте 22 кГц. Для реакции препарат разводили фосфатным буфером (pH 9,5) до концентрации 10 мкг/мл. Антигены рибо-мунила сорбировали в микропланшетах в течение 1 ч при 37°C. После отмывания фосфатно-солевым раствором с твином (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород) от несвязавшихся молекул контрольный образец и исследуемые сыворотки вносили в ячейки. Планшеты инкубировали 30 мин при 37°C. После отмывания вносили конъюгаты, специфичные к исследуемому иммуноглобулину. Планшеты повторно инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Несвязавшиеся реагенты удаляли отмыванием, после чего вносили субстратную смесь для пероксидазы. После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре реакцию останавливали внесением 100 мкл 2 М серной кислоты. Учет результатов проводили на микропланшетном фотометре Multiskan EX при длине волны 450 нм. Титр АТ определяли по максимальному разведению, в котором регистрировали показатели > 0,2.
Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ STATISTICA 6.1, Prism 5 и Microsoft Excel 2007. Результаты представлены в виде медианы признака (Me) и M ± m, где M - среднее арифметическое, m - стандартная ошибка среднего. Достоверность различий определяли по А-критерию Манна-Уитни, различия считали достоверными при вероятности ошибки p < 0,05.
Результаты и обсуждение. Нормальный иммуноглобулин давал реакции в разведении 1:1280. Реакции были специфичны, так как блокировались при истощении иммуноглобулина рибомунилом (одну часть препарата добавляли к двум частям неразведенного иммуноглобулина и выдерживали 60 мин при 37°C). Для взрослых доноров разброс АТ к рибомунилу составлял от 0 до 1:1600 (Me 1:40), для здоровых детей - от 1:10 до 1:320 (Me 1:80). Более высокие показатели медианы у детей были связаны со значительным количеством сывороток, полученных от взрослых доноров с нулевыми показателями (11 среди 71 взрослого донора). Это говорит о том, что дети-школьники, находясь в тесном контакте, обмениваются своей респираторной микрофлорой, а следовательно, чаще заражаются (в том числе субклинически) бактериями, входящими в состав рибомунила. Иммунный ответ зависит не только от генетического фона, но и от интенсивности инфекции, а также от количества повторностей, которые обеспечивают контакт с данным антигеном. Чем выше эти показатели, тем интенсивнее будет иммунная реакция, в том числе образование АТ.
Следует заметить, что нулевые и низкие значения были характерны для всех четырех видов бактерий, входящих в состав рибомунила. Это наблюдали, несмотря на то, что вся популяция (взрослые и дети) контактировала с компонентами, включенными в состав рибомунила. Неизвестно, относились ли они только к общему (сывороточному) иммунитету или были типичны и для местного (мукозального) иммунитета. Сывороточные АТ дают возможность судить о системном иммунитете, который действует главным образом на уровне бронхов и легких, тогда как мукозальные АТ проявляют свой эффект, действуя преимущественно в верхних дыхательных путях [5].
Высокий уровень
Средний уровень
О
•• Низкий уровень
оооооооо
о 1
Здоровые Дети с бронхиальной дети астмой
Рис. 1. Уровень титров IgG-АТ к рибомунилу у здоровых детей и детей с бронхиальной астмой.
Низкие значения титров АТ должны означать, что противобактериальный иммунитет имеет какие-то дополнительные механизмы, которые защищают слизистые оболочки от инвазии потенциально патогенных бактерий. Ими могут быть усиленный мукоцилиальный транспорт, биоцидные и биостатические компоненты секретов, конституционные рецепторы фагоцитов и другие факторы врожденного (неспецифического) иммунитета [7]. Такие механизмы зависят от генетического фона и исключают необходимость в индукции адаптивного иммунитета. Ранее мы также наблюдали нулевое содержание АТ к общим антигенам энтеробактерий, стрептококка. стафилококка и нейссерий у здоровых доноров (неопубликованные данные).
Одним из осложнений респираторных инфекций является бронхиальная астма. Бронхиальная астма - этиологически и патогенетически сложное заболевание, в котором участвуют многие инфекционные и неинфекционные агенты [2, 6, 12, 14, 17, 23, 25]. Приступы бронхиальной астмы могут зависеть от респираторных аллергенов, но способны развиваться и на безаллергенном фоне [21]. В настоящее время считается, что респираторные вирусы играют основную роль в развитии и стабилизации хронического воспаления, составляющего сущность бронхиальной астмы [6, 16, 20, 22]. Бактерии, которые некогда считались главной причиной безаллергенной формы эндогенной астмы, уступили место вирусам. Тем не менее и сегодня признают, что бактериальные инфекции могут быть пусковыми агентами, обостряя хроническое воспаление, либо являются одним из факторов, которые служат предвестником бронхиальной астмы, прокладывая путь другим раздражителям [10, 15, 18]. Содержание АТ к рибому-нилу у детей с бронхиальной астмой было в 16 раз выше, чем у здоровых (Me 1:1280 против Me 1:80; p = 0,000000). Низкие показатели (< 1:500) отметили у 9 (26,5%) из 34 астматиков, средний уровень (от 1:500 до 1:1000) имел 1 (2,9%) больной, высокое содержание АТ (> 1:1000) зафиксировали в 24 (70,6%) сыворотках. Для группы здоровых детей те же показатели составляли 100, 0 и 0% (рис. 1). Это говорит о том, что больные бронхиальной астмой должны иметь в респираторном тракте персистентную (биопленочную) инфекцию, связанную с одним или несколькими видами бактерий, представленными в рибомуниле. Высвобождение планктонных бактерий способствует их контакту с иммунными клетками, индуцируя или поддерживая образование АТ. Об этом же говорило повышенное содержание АТ у детей, больных му-ковисцидозной хронической пневмонией, для которых биопленочная инфекция является типичной [19]. Вместе с тем содержание АТ при муковисцидозе было значительно ниже,
- 261 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
1800-т 16001400120010008006004002000 --200
I—р—I L-i-l - I т I
'SsfSS/S у
<Ъ*° <0<?
ёГ J?
jT ^
Ж У"
у у у
9г лог
-^S
Медиана ] 25-75%
~ Минимум-максимум
Рис. 2. Содержание (титр) IgG-АТ к рибомунилу у здоровых (взрослые и дети) и больных детей.
чем при бронхиальной астме (Me 1:160 против Me 1:1280; p = 0,000054). Это подтверждает то, что рибомульные бактерии не являются главным фактором биопленочного процесса при муковисцидозе [19]. Следует добавить, что при анализе уровня АТ у детей с воспалительными заболеваниями толстой кишки, хроническим энтеритом и целиакией, атопическим дерматитом, хроническим гастродуоденитом и хроническими гепатитами не выявили различий с аналогичным показателем у здоровых детей (см. таблицу; рис. 2).
Из данных литературы известно, что у здоровых детей и детей с бронхиальной астмой удается выявить IgG1-AT, IgG4-AT и IgE-АТ к поверхностным консервативным антигенам H. influenzae и S. pneumoniae [10, 15], причем таких АТ было больше у здоровых детей, чем у детей-астматиков [11]. Это заставляет предположить, что динамика иммуногенеза отличается для наружных и внутренних (рибосомальных) белков. Бактерии, входящие в состав рибомунила, постоянно
Содержание IgG-АТ к рибомунилу у здоровых (взрослые и дети) и больных детей
Группа обследованных Коли- чество наблюде- ний M ± m Me 25% 75%
Здоровые дети 35 99,7 ± 13,2 80 40 160
Здоровые взрослые 71 205,6 ± 45,5 40 20 160
Бронхиальная астма 10 962,4 ± 86,8 1280 160 1280
Муковисцидоз 34 326,3 ± 88,2 160 40 320
Воспалительные заболевания кишечника 19 290,3 ± 74,7 80 20 320
Хронический энтерит и целиакия 32 177,8 ± 43,2 80 40 170
Хронический гастродуоденит 36 162,9 ± 86,9 60 40 160
Атопический дерматит 14 185,0 ± 82,1 30 10 320
Хронический гепатит 29 190,0 ± 62,2 40 20 160
700-, 6005004003002001000 --100-
■ Медиана
—| l=l 25-75%
Т___________щ_ | Минимум-
максимум
IgG IgM IgA
Рис. 3. Содержание (титр) IgG-AT, IgM- AT, IgA-АТ к рибомунилу в сыворотках пуповинной крови здоровых новорожденных.
контактируют с людьми, обеспечивая периодическое инфицирование человеческой популяции [26]. Более того, в настоящее время доказана бактериальная контаминация бронхиального тракта здоровых людей, который раньше считали стерильным [13]. О том, что индукция антителогенеза происходит постоянно, говорят данные нашего изучения разных изотипов рибомунильных АТ (IgM и IgG) у здоровых доноров, которые имели не только IgG-АТ, но и IgM и IgA-АТ, что доказывает хронический контакт с рибомунильными антигенами [5]. Между тем при анализе пуповинной крови, полученной от здоровых новорожденных, получили обычную картину: ни в одном из образцов не удалось выявить IgM- и IgA-изотипы АТ к рибомунилу, несмотря на то что все они содержали то или иное количество материнских антирибому-нильных IgG-АТ (Me 1:40; рис. 3).
Бактериальные инфекции могут повышать чувствительность респираторного эпителия к вирусам, аллергенам и другим (неспецифическим) раздражителям дыхательного тракта [18]. Высказано предположение, согласно которому антибактериальные АТ защищают слизистые оболочки бронхов от бактериальной инвазии, препятствуя реакциям на пусковые агенты бронхиальной астмы [15]. В таком случае можно допустить, что лечебное действие рибомунила будет подобно эффекту рибосо-мальных вакцин, которые повышают устойчивость к бактериям [24]. Однако заметим, что антибиотики и профилактические прививки против бактерий, входящих в состав рибомунила, не защищают от обострений бронхиальной астмы [18].
Неизвестно, какой из бактериальных видов обеспечивал наибольший вклад рибомунила в образование АТ у здоровых и больных людей. Мы можем судить об этом только на основании собственного опыта изучения содержания АТ к внутриклеточным белкам представителей облигатной и факультативной микрофлоры человека [4]. Согласно этим данным, на первом месте должны стоять рибосомальные белки пиогенно-го стрептококка и пневмококка. Именно от них могут зависеть качественный спектр и общее содержание АТ к рибомунилу.
выводы. 1. Сыворотки, полученные от здоровых людей, содержали IgG-АТ к рибомунилу в разведении от 1:0 до 1:1600 (взрослые) и от 1:10 до 1:320 (дети). Среди взрослых были индивиды, которые имели нулевые показатели антири-бомунильных АТ.
2. Все АТ в пуповинной крови от здоровых новорожденных принадлежали к IgG-изотипу.
3. Не обнаружено разницы между содержанием АТ к ри-бомунилу у здоровых детей и детей с хроническими воспалительными заболеваниями органов пищеварения и атопическим дерматитом. У детей, больных муковисцидозом, титры антирибомунильных АТ были повышены в 2 раза по сравнению с таковыми в контрольной группе.
- 262 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
4. У детей, больных бронхиальной астмой, выявлено 16-кратное увеличение титров АТ к рибомунилу по сравнению с аналогичным показателем у здоровых детей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адо А. Д., Адрианова Н. В. Бронхиальная астма. Частная аллергология (ред. А. Д. Адо). М., 1976. - С. 57-209.
2. Балаболкин И. И. Бронхиальная астма. Аллергические болезни у детей (ред. М. Я. Студеникин, И. И. Балаболкин). М., 1998. - С. 188-213.
3. Маянский А. Н., Алатырцева И. Е., Молчанова И. В. Аллергенные фракции бактерий семейства кишечных. Сообщение V Уровень «нормальных» антител к человека к внутриклеточным белковым антигенам энтеробактерий // Журн. ми-кробиол. - 1974. - № 3. - С. 44-49.
4. Маянский А. Н., Молчанова И. В., Исхакова С. Х. и др. Иммунологическая реактивность к продуктам нормальной микрофлоры. Антитела к общим видоспецифическим антигенам пневмококка в спектре противобактериальных антител человека // Журн. микробиол. - 1982. - № 9. - С. 86-90.
5. Маянский А. Н. Патогенетическая микробиология. - Н. Новгород, 2006. - С. 387-405.
6. Хаитов М. Р. Роль респираторных вирусов в патогенезе бронхиальной астмы // Иммунология. - 2003. - Т. 22, № 1. -С. 58-65.
7. Abraham C., Medzhitov R Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease // Gsstroenterology. - 2011. - Vol. 140. - P. 1729-1737.
8. Agrawal D. K., Shao Z. Pathogenesis of allergic airway inflammation // Curr. Allergy Asthma Rep. - 2010. - Vol. 10, N
1. - P. 39-48.
9. Bisgaard H., Hermansen M. N., Buchvald F. et al. Childhood asthma after bacterial colonization of the airway in neonates // N. Engl. J. Med. - 2007. - Vol. 357. - P. 1487-1495.
10. Hales B. J., Pearce L. J., KuselM.M.H. et al. Differences in the antibody response to a micosal bacterial antigen between allergic and non-allergic subjects smoke-free legislation reduces exposure in children. Thorax. - 2008. - Vol. 63. - P. 221-227.
11. Hales B. J., Lee Y. C., Eliot C. E. et al. Antibacterial antibody responses associated with the development of asthma in house dust mite-sensitised and non-sensitised children // Thorax. -2011. - Vol. 10. - P. 1136-1141.
12. Hammad H., Lambrecht B. H. Dendritic cells and airway epithelial cells at the interface between innate and adaptive
immune responses // Allergy. - 2011. - Vol. 66. - P. 579-587.
13. Hilty M., Burke C., Pedro H. et al. Disordered microbial communities in asthmatic airways // Plow ONE. - 2010. - Vol. 5, N 1. - P. 8578-8586.
14. Holgate S. T. The sentinel role if the airway epithelium in asthma pathogenesis // Immunological Reviews. - 2011. - Vol. 242. - P. 205-219.
15. Hollams E. M., Hales B. J., Bachert C. et al. Th2-associated immunity to bacteria in teenagers and susceptibility to asthma // European Respiratory J. 2010. - Vol. 36, N 3. - P. 509-516.
16. Jackson D. J., Gangnon R. E. Evans M. D. et al. Wheezing rhinovirus illnesses in early life predictasthma development in high-risk children // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2008. - Vol. 178. - P. 667-672.
17. Kim H. Y., DeKruyff R. H., Umetsu D. T. The many paths to asthma: phenotype shaped by innate and adaptive immunity // Nat Immunol. - 2010. - Vol. 11, N 7. - P. 577-584.
18. KorppyM. Bacterial infections and pediatric asthma // Immunol. Allergy Clin. N. Am. - 2010. - Vol. 30, N 4. - P. 565-574.
19. Lee B., Schjerling C. K., Kirkby N. et al. Mucoid Pseudomonas aeruginosa isolates maintain the biofilm formation capacity and the gene expression profiles during the chronic lung infections of CF patients // APMIS. - 2011. - Vol. 119. - P. 263-274.
20. Message S. D., Laza-Stanca V., MalliaP. et al. Rhinovirus-induced lower respiratory illness in increased in asthma and related to virus load and Th1/2 cytokine and IL-10 production // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 2008. - Vol. 105. - P. 13562-13567.
21. Murphy D. M., O’Byrne P. M. Recent advances in the pathophysiology of asthma // CHEST. - 2010. - Vol. 137, N 6. -P. 1417-1426.
22. Papadopoulos N. J., Stanciu L. A., Papi A. et al. A defective type 1 response to rhinovirus in atopic asthma // Thorax. - 2002. -Vol. 57. - P. 328-332.
23. Proud D., Leigh R. Epithelial cells and airway diseases // Immunological reviews. - 2011. - Vol. 242. - P. 186-204.
24. Stanislavsky E. S. Pseudomonas aeruginosa antigens as potential vaccines // FEMS Microbiol. Rev. - 1997. - Vol. 21, N 3. - P. 243-277.
25. Umetsu D. T., DeKruyff R. H. Current perspectives: focused commentary: key cells in asthma // J. Allergy Clin. Immunol. -2010. - Vol. 125, N 5. - P. 975-979.
26. Weinberger M. Respiratory infections and asthma: current treatment strategies // Drug Discov. Today. - 2004. - N 9. - P. 831837.
Поступила 07.03.12
- 263 -
