CC BY-ND
19
20
ЗНиСО pm №12 (213)
АНТИРЕТРОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ СПЕЦИФИЧНЫХ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ СОЕДИНЕНИЙ
Л.Б. Калнина1, М.С. Бочкова1, С.Л. Гроховский2, М.В. Таблер3, Г.В. Гурский2
ANTIRETROVIRAL ACTIVITY OF AGENTS ON BASE OF SPECIFIC DNA-BINDING COMPOUNDS
L.B. Kalnina, M.S. Bochkova, S.L. Grokhovsky, M.V. Tabler, G.V. Gursky
'ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России, 2Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, 3ФГУЗ «Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора
Изучены антиретровирусные свойства димерных аналогов пирролкарбосамид-ного антибиотика нетропсина в культуре клеток человека, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Установлена способность этих соединений защищать клетки от цитопатического действия ВИЧ и снижать уровень антигена вируса в культуральной жидкости.
Ключевые слова: ДНК-связывающие соединения, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), клетки человека, антиретровирусные препараты.
The antiretroviral activity of dimeric analogs of antibiotic netropsin was studied in human cells infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV). The capacity of these compounds to protect cells from cytopathogenic action of HIV and to reduce the viral antigen level in tissue fluid was observed.
Keywords: Bis-linked netropsin derivatives, Human Immunodeficiency Virus (HIV), human cells, antiretroviral drugs.
Проблема лечения ВИЧ-инфицированных лиц остается одной из актуальнейших проблем современной медицины. Сотни тысяч человек в России заражены этим вирусом, и это количество растет каждый день. Лечение таких больных является сложной задачей. Трудно воздействовать на вирус, находящийся внутри клетки, и при этом не повредить саму клетку.
Другая проблема — постоянные мутации ВИЧ, приводящие к появления резистентных к действию лекарств штаммов вируса [1—3]. Еще одна проблема — это токсичность лекарств. Поэтому необходим поиск новых
соединений, активных в отношении ВИЧ и в тоже время малотоксичных.
Современные способы лечения инфекции, вызываемой ВИЧ-1, основаны на использовании в качестве лекарственных средств аналогов нуклеозидов, которые после трифосфо-рилирования являются ингибиторами активности обратной транскриптазы ретровируса [1—3]. После создания азидотимидина усилия большинства лабораторий были направлены на создание новых нуклеозидных аналогов — ингибиторов вирусной ДНК-полимеразы и обратной транскриптазы ретровируса, спо-
4ШШ, №12 (213) ЗНиСО
21
собных подавлять репродукцию вариантов вируса, устойчивых к действию азотимидина и его аналогов.
В последние годы были созданы ненуклео-зидные лекарственные агенты, мишенью действия которых являются обратная транскрип-таза, интеграза и протеаза ВИЧ [1—3]. Однако из-за высокой изменчивости ретровируса все эти лекарственные средства не избавляют пациентов от возможности возникновения новых вариантов вируса с лекарственной устойчивостью. В этой связи значительный интерес представляет создание противовирусных агентов на основе ДНК-связывающих соединений или соединений, взаимодействующих с гибридом ДНК—РНК и подавляющих синтез вирусной ДНК с помощью обратной транс-криптазы. В качестве мишеней для действия этих соединений могут служить связывающие места для активаторов транскрипции в ЕГЯ ретровируса, связывающие места для интегра-зы ВИЧ и участок в геноме ВИЧ, содержаший полипуриновую последовательность и примыкающий к ней кластер из пяти остатков ура-цила. Этот участок гибрида ДНК—РНК играет важную роль в жизненном цикле вируса, так как содержит место инициации синтеза плюс-нити вирусной ДНК. Ранее мы обнаружили, что некоторые димерные аналоги нетропсина избирательно связываются с этим участком ДНК и могут служить в качестве ингибиторов процесса инициации синтеза плюс-нити вирусной ДНК.
Наиболее адекватным способом оценки противовирусной активности препаратов в отношении ВИЧ является модель клеток человека, зараженных вирусом. В связи с этим целью работы являлось изучение активности новых специфичных ДНК-связывающих соединений в культуре клеток человека, инфицированной вирусом иммунодефицита человека.
Материалы и методы.
Клетки. Использовали перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4 из коллекции НИИ вирусологии им. Д.И. Ива-
новского РАМН, а также лимфоциты периферической крови, которые выделяли по описанной ранее методике (2, 3). Клетки культивировали в среде ЯРМ1 1640 с 10 % сыворотки эмбрионов коров, 100 мкг/мл гентамицина. Жизнеспособность определяли окраской 0,4 % раствором трипанового синего и с помощью окраски тетразолиевым красителем (метод МТТ) со спектрофотометрией (2, 3).
Вирусы. В качестве источника вируса использовали штаммы ВИЧ-1 из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и штамм ВИЧ-1ВЯи, любезно предо-ставленый проф. Л. Монтанье (Институт Па-стера, Франция). В качестве антиретрови-русного референс-препарата использовали ретровир (азидотимидин) (нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы ВИЧ) (Глак-соСмитКляйн).
ДНК-связывающие соединения. Исследовалась цититоксичность и противовирусная активность следующих соединений (табл. 1).
Здесь Аре- остаток 1-^пропил-4-амино-пиррол-2- карбоновой кислоты. Р1^Н3)2-остаток цис-диамино-платиновой группы. Химическая структура соединений подтверждены данными ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии. Р1-Ы8-№ и Р1;*-Ы8-№ содержат цис-диаминоплатиную группу в соединительной цепи между двумя мономерными фрагментами. Синтез и ДНК-связывающая активность этих соединений описаны в работах [4—5]. Отличия мономерных фрагментов Р1-Ы8-№ (или Р1*-Ы8-№) от нетропсина состоят в замене С-концевой амидиновой группы не-тропсина на остаток третичного амина, замене присутствующего в нетропсине остатка гуани-дилуксусной кислоты на остаток глицина, а также в замене ^метилпиррольных циклов на ^пропилпиррольные циклы. Концентрации Р1-Ы8-№ и Р1*-Ы8-№ определялись спек-трофотометрически, используя коэффициент молярной экстинкции при 297 нм, равный 42000 М-1 см-1. Что касается Lys-bis-Nt и G1y3-
Таблица 1
Н-а1у2-Аре2-КЫ-(СЫ2)3-КМе2 (Н-01у2-№)
КМе2-(СН2)3-КН-Аре2-а1у-Р1(КН3)2-а1у-Аре2-КН-(СЫ2)3-КМе2 (Р1^-№)
КМе2-(СН2)3-КН-Аре2-а1у-а1у-Р1(КН3)2-а1у-а1у-Аре2-КН-(СН2)3-КМе2 (Р1*^-№)
Н-1уз-а1у-Арс9-КН-(СН,)-КН-Арс9-а1у-1^-Н (Lys-bis-Nt)
1^-01у2-Аре2-а1у3-Аре2-КН-(СН2)3-КМе2 (01у3^-№)
22
ЗНиСО pm №12 (213)
Таблица 2. Противовирусная активность ДНК-связывающих соединений в культуре лифобластоидных клеток человека, инфицированных вирусом иммунодефицита человека
Соединение СТ50 ЭК50
Концентрация, мкМ
HGly2-Nt >005 >500
Pt-bis-Nt >500 300
Pt*-bis-Nt 257 100
Lys-bis-Nt 265 100
Gly3-bis-Nt >500 261
Примечание. СТ50 — концентрация , в присутствии которой погибает 50 % клеток при продолжительности инкубации 72 ч. ЭКэд — концентрация соединения, ингибирующая развитие вирус - индуцированного цитопатического действия в клетках на 50 %. Приведены средние значения СТ50 и ЭК50 для двух независимых экспериментов. Стандартные отклонения не превосходили 20 % от среднего значения.
bis-Nt, то их свойства и ДНК-связывающая активность описаны в работах [6]. Димерные аналоги нетропсина связываются в узкой бороздке ДНК с кластерами AT-пар оснований и занимают при связывании примерно один виток спирали ДНК [6].
Исследование цитотоксического действия аналогов нетропсина.
К клеткам добавляли исследуемый аналог нетропсина в различных концентрациях. Инкубировали клетки при 37 °С в атмосфере с 5 %-го СО2 и 98 %-й влажности 3—5 дней. Учет результатов: определение жизнеспособности и количества клеток при помощи красителя.
Исследование противовирусного действия аналогов нетропсина.
Исследование противовирусной активности препаратов в отношении ВИЧ проводили на модели клеток в пластиковой 24-луночной панели (Costar, США), инфицированных вирусом (множественность инфекции 0,01 ТЦИД50/клетка). Культуры клеток инкубировали при 37 °С в атмосфере с 5 %-го СО2 и 98 %-й влажности 5 дней. Учет результатов: световая микроскопия — исследование цито-патического эффекта вируса (ЦПЭ) и вирус-индуцируемого образования синцитий (синцитий — конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).
Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкре-стовой системе знаками + или — соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю.
++++ — 100 %-я гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение;
+++ — 75 %-я гибель клеток в каждой из четырех лунок;
++ — 50 %-я гибель клеток в каждой из четырех лунок;
+ — 25 %-я гибель клеток в каждой из четырех лунок,
+— — начало дегенерации,
— — отсутствие цитодеструкции.
Степень защиты клеток от цитодеструк-тивного действия вируса определяли по формуле:
А - В
% защиты =
К - В
х 100, где
А — число жизнеспособных клеток в опытной группе;
В — то же в инфицированной культуре (контроль вируса);
К — то же в неинфицированной культуре (контроль к леток).
Методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих иммунофер-ментных наборов фирм Биорад, Органон Техника (Нидерланды), проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости согласно инструкции изготовителя учитывали с помощью фотометра «МиШ8сап» при длине волны 492 нм. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ «Вю81а1».
4ШМ №12 (213) ЗНиСО
23
Результаты и обсуждение.
Полученные данные (табл. 2) показали, что все исследованные димерные аналоги нетропсина имели противовирусную активность и обладали относительно невысокой цитотоксичностью: Величины СТ50 — концентрация, в присутствии которой погибает 50 % клеток при продолжительности инкубации 72 ч, превосходили 250—500 мкМ, в то время как ЭК50 — эффективная концентрация, ингибирующая репродукцию вируса на 50 %, находилась в пределах 100—150 мкМ. Обнаружены также и более активные соединения, этого класса, свойства которых будут описаны отдельно. Таким образом, ковалентно связанные димерные аналоги нетропсина представляются перспективным классом гетероциклических соединений для создания новых типов лекарственных препаратов для подавления репродукции ВИЧ.
Работа выполнена при финансовой поддержке Государственного контракта № 02.512.12.2055 и Программы РАН по молекулярной и клеточной биологии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. De Clercq E., New Approaches toward Anti-HIV
Chemotherapy. J. Med. Chem. 2005, 49, 1297—1313.
2. Носик Д.Н., Калнина Л.Б., Злобин А.Ю., и др.
//Характеристика штаммов вируса иммуно-
дефицита человека, выделенных от ВИЧ-инфицированных лиц на территории СССР. Вопросы вирусологии. 1992. № 1. C. 24—27.
3. Носик Д.Н., Носик Н.Н. ВИЧ-инфекция: профессиональный риск и экстренная профилактика. М.: Издательство НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2004. С. 55.
4. Гроховский С.Л., Готтих Б.П., Жузе А.Л. Лиганды, обладающие сродством к определенным последовательностям пар оснований ДНК. IX. Синтез аналогов нетропсина и дистамицина А, содержащих остаток сарколизина или атом платины(11). Биоорган. химия 1992. Т. 18, C. 570—583.
5. Суровая А.Н., Гроховский С.Л., Бажулина Н.П., Гурский Г.В. ДНК-связывающая активность бис-нетропсинов, содержаших цис-диаминоплатиновую группу между двумя нетроп-синовыми фрагментами //Биофизика. 2008. Т. 53. C. 744—753.
6. Андронова В.Л., Гроховский С.Л., Суровая А.Н., Гурский Г.В., Галегов Г.А. Антивирусная и цито-токсическая активности производных нетроп-сина в культуре клеток Vero, инфицированных вирусами осповакцины и герпеса простого первого типа, Докл. Акад. Наук (Биохимия, биофизика, молекулярная биология). 2008. Т 422 , C. 688—693.
Контактная информация.
Калнина Людмила Борисовна, тел.: 8-499-190-28-43
Contact information.
Kalnina Ludmila Borisovna, phone: 8-499-190-28-43
