CC BY
37
УДК 577.16
АНТИОКСИДАНТНЫИ ПОТЕНЦИАЛ НЕКОТОРЫХ ПРИРОДНЫХ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ
© 2008 г. В.А. Чистяков, К.В. Азарин, А.В. Усатое
Южный федеральный университет, 344006, Ростов н/Д, ул. Б. Садовая, 105, Научно-исследовательский институт биологии, 344090, Ростов-на-Дону, Стачки, 194/1, а2Ыг@гатЫег. ги
Southern Federal University, 344006, Rostov-on-Don, B. Sadovaya St., 105, Rostov Biology Research and Development Institute, 344090, Rostov-on-Don, Stachka, 194/1, azkir@rambler. ru
Проведен сравнительный анализ антиоксидантной активности аллантоина и мочевой кислоты.. Урат способен более эффективно, чем аллантоин, «перехватывать» супероксид анион, проявляя в то же время меньшую способность инактивировать свободнорадикальные продукты, ответственные за ДНК-повреждающую активность перекиси водорода.
Ключевые слова: антиоксидантная система, свободные радикалы, перекисные соединения, мочевая кислота, супероксид анион, аллантоин.
The comparative analysis of antioxidant activity allantoin and uric acid were carried out in this research. Urat can more effectively than allan-toin «intercept» superoxide anion, but at the same time urat showed less ability to inactivate free radicals responsible for the DNA-destructive activity of hydrogen peroxide.
Keywords: antioxidant system, free radicals, connections, uric acid, superoxide anion, allantoin.
Аэробные условия существования накладывают определенный отпечаток на метаболизм в целом. Основной причиной генотоксического эффекта гипероксии является формирование активных форм кислорода. Активные метаболиты кислорода способны взаимодействовать непосредственно с ДНК, повреждая дезок-сирибозо-фосфатные и ДНК-белковые связи, модифицируя пуриновые и пиримидиновые основания. Многочисленными исследованиями было установлено, что окислительный стресс лежит в основе целого ряда патологических изменений иммунной, сердечно-сосудистой, дыхательной систем организма. Это всё приводит к преждевременному старению тканей и организма в целом. В ходе эволюции была создана сложная многокомпонентная антиоксидантная система, которая препятствует повреждающему действию свободных радикалов и перекисных соединений. Важными звеньями «неферментативной части» антиоксидантной системы, обеспечивающими адаптацию к воздействию разнообразных факторов, являются продукты катаболизма пуринов, в частности аллантоин и мочевая кислота [1, 2]. Ранее сообщалось об обнаружении способности аллантоина и урата подавлять развитие деструктивных процессов, вызываемых активными формами кислорода [1-3]. Изучение влияния аллантоина и урата на активность свободных радикалов в модельных системах дополнит существующие знания об аниокси-дантном потенциале метаболизма. Цель данной работы - исследование антиоксидантного потенциала аллан-тоина и мочевой кислоты при помощи апробированной нами ранее методологии.
Материал и методы исследования
Антиоксидантную активность исследованных соединений in vivo оценивали по способности подав-
лять индуцированный перекисью водорода SOS-ответ клеток E.coli. Репортером SOS ответа служил Lux-оперон. Использовали штамм E.coli С600 (pPLS-1), несущий плазмиду pPLS-1, в которой оперон биолюминесценции находится под контролем SOS-промо-тора [2-4]. Для коррекции результатов использовали штамм C600(pPLS-5), Lux-оперон которого находится под контролем конститутивного промотора [5]. Штаммы E.coli выращивали на среде LBP. В 50 мл среды вносили 0,1 мл ночной культуры E.coli и инкубировали в термостате в течение одного часа при 37 оС. Растворы исследуемых веществ в необходимой концентрации (100 мкл) вводили в аликвоты культуры бактерий за 30 мин до перекиси водорода, которую добавляли до концентрации 3-Ю"6 М. В контрольные варианты добавляли бидистиллят. Измерения интенсивности биолюминесценции культур проводили на люминометре ЛТ-01.
Фактор индукции определяли как отношение интенсивности свечения суспензии штамма pPLS-1, содержащей тестируемое соединение, к интенсивности контрольной пробы. Коэффициент подавления свечения определяли как интенсивность свечения суспензии штамма pPLS-5 с тестируемым соединением к интенсивности свечения контроля. Истинное значение степени индукции рассчитывали как отношение фактора индукции к коэффициенту подавления. Показатель антимутагенного потенциала (А, %) вычисляли по формуле: А=( 1 —1а/1р)-100 %, где 1а - фактор индукции SOS-ответа перекисью водорода в присутствии антиоксиданта; Ip - фактор индукции SOS-ответа перекисью водорода.
Для определения способности исследуемых соединений подавлять генерацию О2 - использовали апробированную нами ранее методику [6]. К 2,9 мл 0,1 М би-
карбонатного буфера (рН 10,2) с 1мМ ЭДТА и 60 мкМ НСТ (нитросиний тетразолий) добавляли 0,1 мл раствора исследуемого вещества в 0,1 М бикарбонатном буфере (опыт), либо 0,1 мл вышеназванного буфера (контроль). Реакцию запускали добавлением 100 мМ раствора солянокислого гидроксиламина в воде до концентрации 1 мМ одновременно в контрольных и опытных пробах. Через 5 мин после запуска реакцию останавливали добавлением равного объема 1 М трис-НС1 буфера рН 7,4, содержащего 1 % тритона Х100. Экстинкцию определяли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 560 нм. Данные по супероксид-устраняющей активности (СУА) аминокислот пред-
ставляли в виде единиц активности супероксиддисму-тазы, рассчитанных согласно Фридовичу [7].
СУА =( Езбок - Е560о)/ Езбсо , где СУА - супероксид-устраняющая активность в
Ек ^
, 560 - экстинция контрольной пробы; Е560о - экстинция опытной пробы.
Результаты и их обсуждение
В табл. 1 показаны результаты влияния урата и ал-лантоина на индуцированный перекисью водорода 808-ответ клеток Е.соИ.
Таблица 1
Индукция SOS-ответа E. coli перекисью водорода в присутствии урата, аллантоина
Концентрация, моль/л Урат Аллантоин
А, % Фактор А, % Фактор
0 0 100 ±1 0 100±9,5
10-11 -7 107 ± 23,2 40 60 ± 6,1
10-10 18 82 ± 5,1 74 26 ± 1,6
10-9 23 77 ± 1,4 73 27 ± 1,4
10-8 62 38 ± 3,4 75 25 ± 1,6
10-' 65 35 ± 4,4 80 20 ±3,1
10-6 40 60 ± 5 84 16± 2,3
10-5 49 52 ± 11,7 85 15 ± 1,5
10-4 66 34 ± 10,2 93 6 ± 2,0
10-3 68 32 ± 6,8 64 36±3,9
Эксперимент показал, что урат проявляет антимутагенную активность практически во всех вариантах опыта. Максимальная активность регистрируется для концентрации 10-3 М.
Максимальная активность аллантоина регистрируется в концентрации 10-4 М. В отличие от урата его активность сохраняется и при малых концентрациях - 10-10 - 10-11М. Максимальное значение антимутагенной активности аллантоина превышает аналогичный показатель для урата в 1,37 раза.
В табл. 2 представлены данные по СУА аллантоина и мочевой кислоты. Для аллантоина увеличение концентрации не приводит к достоверному росту СУА. Тогда как для урата обнаружена явная дозовая зависимость. Максимум СУА урат проявляет в концентрации 10-5 М, что соответствует физиологической концентрации в плазме крови человека. Это указывает на значительную роль мочевой кислоты в качестве клеточного протектора от активных форм кислорода, таких как супероксид-анион.
Как показали результаты проведенных экспериментов, урат способен более эффективно, чем аллан-тоин, «перехватывать» супероксид-анион, проявляя в то же время меньшую способность инактивировать свободнорадикальные продукты, ответственные за ДНК-повреждающую активность перекиси водорода.
Мочевая кислота, как показано выше, является эффективным тушителем гидроксильных и супероксид-радикалов. С повышением концентрации урата вследствие Шх-мутаций [8, 9] связывают увеличение продолжительности жизни у человека и снижение уровня возрастных раковых заболеваний [1]. С другой стороны, в
результате атаки мочевой кислоты свободными радикалами образуется аллантоин, обладающий свойствами антиоксиданта, антимутагена и витамина [2]. Таким образом, неферментативная генерация аллантоина у видов, потерявших уриказную активность, может отражать развитие адаптационной составляющей окислительного стресса. В пользу этого предположения говорят данные по антиоксидантной активности смеси физиологических для плазмы человека концентраций аллантоина и урата -10-6 и 10-5 М соответственно.
Таблица 2
Супероксид-устраняющая активность
Концентрация, моль/л Урат Аллантоин
10-11 0,087 ± 0,011 0,088 ± 0,012
10-ю 0,060 ± 0,019 0,058 ± 0,0035
10-9 0,084 ± 0,012 0,069 ± 0,004
10-8 0,224 ± 0,016 0,089 ± 0,0024
10-7 0,309 ± 0,013 0,129 ± 0,012
10-6 0,339 ± 0,013 0,181 ± 0,011
10-5 0,401 ± 0,010 0,171 ± 0,0025
10-4 0,029 ± 0,007 0,137 ± 0,018
Из табл. 3 видно, что смесь низкомолекулярных продуктов деградации пуринов проявляет in vivo способность подавлять генотоксическое действие перекиси водорода.
Причём, несмотря на то, что содержание аллантоина составляло всего десятую часть от урата, процент уменьшения генотоксической активности перекиси
водорода в присутствии смеси выше, чем только в присутствии мочевой кислоты (табл. 1, 3).
Таблица 3
Индукция SOS-ответа E. coli перекисью водорода в присутствии урата и аллантоина
Концентрация, моль/л А, % Фактор
0 - 128 ± 8,2
10-5+10-6 65 45 ± 4,3
Подобный эффект синергизма при совместном действие антиоксидантов в физиологических концентрациях согласуется с представлениями, что биоанти-оксиданты наиболее эффективны в составе природных смесей. Значение СУА смеси достоверно не отличается от такового для урата - 0,386 ± 0,014. В организме существует целый ряд взаимосвязанных ан-тиоксидантных систем, основная роль которых заключается в поддержании гомеостаза клеток и тканей при разнообразных экстремальных факторах, обладающих прооксидантными свойствами. Поэтому проблема совместного действия антиоксидантов требует дальнейших исследований.
Полученные в этой работе данные позволяют рационально оценить место урата и аллантоина в системе антиоксидантной защиты. Низкомолекулярные антимутагены - это лишь часть системы защиты от ДНК-тропных воздействий. Но эта часть отражает эволюционное развитие метаболизма, сложившегося в аэробных условиях и несущего определенную антиокислительную нагрузку. Совокупность таких антиоксидан-тов, как мочевая кислота и аллантоин, вносит вклад в
Поступила в редакцию_
общий антиоксидантный пул метаболизма, величина которого имеет важнейшее адаптивное значение.
Литература
1. Ames B.N., Cathcart R., Schwiers E., Hochstein P. Uric acid provides an antioxid defense in humans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: a hypothesi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 11. P. 68586862.
2. Гуськов Е.П. и др. Аллантоин как тушитель свободных радикалов // Докл. АН. Серия биохимия, биофизика. 2002. Т. 383. № 2. C. 105-107.
3. Гуськов Е.П. и др. Аллантоин как витамин. // Докл. АН. 2004. № 6. С. 1-6.
4. Птицын Л.Р. Биолюминесцентный анализ SOS-ответа клеток Escherichia coli. II Генетика // Генетика. 1996. № 3. С. 354-358.
5. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Войнова Н.В. Способ определения генотоксичности химических веществ. // Патент РФ № 2179581. 2001.
6. Чистяков В.А. и др. Супероксидустраняющая активность некоторых аминокислот в водных растворах. // Биофизика 2005. Т. 50. № 4. С. 601-605.
7. Imlay J.A., Fridovich I.J. // Biol. Chem. 1991. Vol. 226.
P. 6957-6965.
8. Oda M. et al. Loss of urate oxidase activity in homi-noids and its evolutionary implications // Molecular Biology and Evolution. 2002. Vol. 19. P. 640-653
9. Wu X. et al. Two independent mutational events in the loss of urate oxidase during hominoid evolution. // J. Mol. Evol. 1992. Vol. 34. P. 78-84.
18 декабря 2007 г.
