CC BY
323
Химия растительного сырья. 2012. №1. С. 77-81.
УДК 535.37:541.127:542.943:547.313
АНТИОКСИДАНТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ И ФРАКЦИЙ ИХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
© Т.А. Филиппенко , Н.Ю. Грибова
Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, ул. Героев Обороны, 15, Киев-041, 03041 (Украина), e-mail: [email protected]
Экстракционными методами: циркуляционной экстракцией, классической мацерацией и мацерацией под действием электрического тока - получены водные экстракты из корней девясила и кровохлебки, коры калины и дуба, В оптимальных условиях проведено разделение на фракции экстрагированных веществ, Две фракции фенолов: флавоноиды и смесь фенолкарбоновых и оксикоричных кислот исследованы на антиоксидантную активность в процессе инициированного окисления этилбензола хемилюминесцентным и газоволюметрическим методами,
Ключевые слова: экстракты, фракции фенольных соединений, антиоксиданты,
Введение
Лекарственные растения широко применяются в фармации для получения препаратов, оказывающих комплексное биохимическое воздействие на организм человека [1, 2]. Терапевтические эффекты, наблюдаемые при употреблении лекарственных форм - экстрактов растений, богатых фенолами, обусловлены поступлением в организм человека природных веществ, влияющих на окислительно-восстановительные процессы в клетках, на регенерацию тканей, негативное воздействие факторов окружающей среды, процессы, развивающиеся при инфекционныхзаболеваниях [3]. Известно, что природные фенолы: токоферолы (Е 307), кверцетин (Е 1102), галловая кислота и её производные, широко применяются в качестве антиоксидантов (АО) [4], добавление их в продукты питания повышает пищевую ценность [5, 6].
Несмотря на большое количество работ [7-9] по получению и изучению растительных экстрактов, не установленны условия наиболее полного выделения фенолов из растительного сырья, а также целесообразность фракционирования экстрактов для повышения их биологической активности.
Экспериментальная часть
Объектом исследования (источником антиоксидантов) являлись водные экстракты корня кровохлёбки и девясила, коры дуба и калины, полученные по ранее отработанным методикам [8-10]. Общее количество извлеченных при экстракции веществ характеризовали по величине сухого остатка (Wco,, масс.%), определенного методом гравиметрии [11]. Суммарное количество фенольных соединений (ФС,%) в экстрактах определяли перманганатометрическим методом Левенталя-Найбауэра [11].
Для выделения из экстрактов фракций фенольных соединений использовали метод избирательной жидкость-жидкостной экстракции органическими растворителями: этилацетатом и диэтиловым эфиром [12]. Состав фракций изучался методом УФ-спектроскопии.
Для оценки антиоксидантной активности (АОА) сухие остатки экстрактов или фракций растворяли в этаноле и вводили в окисляющийся субстрат (этилбензол). Исследование АОА проведено в процессе инициированного азодиизобутиронитрилом (АИБН) окисления этилбензола (ЭТБ) при Т=343К методом хемилюминесценции (ХЛ) [13] и газоволюмометрии [13]. В качестве активатора ХЛ использовали 9,10-дибромантрацен (ДВА). Характеристикой АОА экстрактов и фракций является период индукции (г) окисления ЭТБ в их присутствии.
* Автор, с которым следует вести переписку,
Обсуждениерезулътатов
Основываясь на литературных данных [3], в качестве источников фенольных АО выбраны части некоторых лекарственных растений, богатые фенольными соединениями. В полученных разными методами экстрактах (табл. 1) определено общее количество экстрагированных веществ и содержание фенолов. Из данных, приведенных в таблице 1, можно видеть, что все экстракты, полученные мацерацией в электрохимической ячейке с углеродными электродами, находящимися под напряжением 35 В, значительно превосходят как по суммарному содержанию масс.%) биологически активных веществ (БАВ), так и фе-
нольных соединений (ФС, %) экстракты, полученные горячей мацерацией. Метод циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета обеспечивает сравнимые с методом электроэкстракции количества выделенных веществ. В то же время из анализа кривых ХЛ свечения при окислении ЭТБ (рис. 1) можно видеть, что экстракты, полученные разными методами из одного лекарственного сырья, отличаются и по уровню АОА. Антиоксидантное действие экстрактов, полученных методом электроэкстракции, значительно выше, чем экстрактов, полученных другими методами (рис. 1).
В таблице 2 приведены значения периодов индукции окисления, наблюдаемые на кривых ХЛ-свечения при окислении ЭТБ с добавкой 0,01 масс% сухих экстрактов. Независимо от метода извлечения, наиболее эффективны экстракты корня кровохлебки.
Различия в величинах периодов индукции, наблюдаемых при использовании экстрактов, полученных из разных растений одним и тем же методом, связаны с различиями в качественном и количественном составе фенольных соединений, входящих в сырье и, следовательно, в состав экстрактов (табл. 1, 2).
Поскольку методом Левенталя - Найбауэра (ФС,%) определяется общее количество веществ-восстановителей, то для установления причины различий в величинах АОА экстрактов представлялось необходимым определение их компонентного состава.
Таблица 1. Содержание сухого остатка (^ с о., масс.%) и суммы фенольных соединений (Ф.С., %) в экстрактах, полученных разными методами (п = 5, Р = 0,95)
Сырье Химический состав фенольных соединении растения [3] Горячая мацерация Электроэкстракция (Ц=35В) Циркуляционная экстракция
ф.с.,% ^с.0.,% ф.с.,% ^,0.% ф.с.,% ^с.0.,%
Кровхлебка (корень) Фенолкарбоновые кислоты: галовая и ее эфиры, эллаго-
Калина (кора) вая. Сапонины, сонгвисорбин, потерин Фенолы: пирогаллол Дубильные вещества. Фенолкарбоновые кислоты: галовая и ее эфиры, протока-теховая, глутеновая. 10,2±0,1 0,15±0,02 30,8±0,1 1,51±0,03 30,5±0,1 1,79±0,03
Дуб (кора) Флавоноиды: кверцетин, рутин, кемпферол. Дубильные вещества. Кумарины. Хромоны. Фенолкарбоновые кислоты: галовая и ее эфиры, протока-теховая, глутеновая. 8,7±0,1 0,11±0,01 25,2±0,1 1,80±0,04 18,3±0,1 2,11±0,03
Флавоноиды: кверцетин, ру- 18,4±0,1 0,075±0,00 35,1±0,1 0,83±0,02 23,4±0,1 2,10±0,02
Девясил (корень) тин, кемпферол. Фенолы: резорцин, пирогаллол. Дубильные вещества. Кумарины. Катехины. Фенолкарбоновые кислоты: галовая и ее эфиры, протока-теховая, глутеновая. 5
Флавоноиды: кверцетин, рутин, кемпферол. Дубильные вещества Кумарины. Хромоны. 3,7±0,1 0,21±0,01 10,4±0,1 2,14±0,04 27,2±0,1 2,10±0,02
Таблица 2. Периоды индукции (г, мин) инициированного окисления этилбензола ([АИБН]=5-103М, [ДБА]=4-10-4 М, Т=343 К) в присутствии 0,01 масс% экстрактов, полученных разными методами (п=5, Р=0,95).
Растительное сырье Горячая мацерация Электроэкстракция (Ц=35В) Циркуляционная экстракция
Кровохлебка (корень) 1,0±0,1 10,5±0,2 6,4±0,1
Калина (кора) 0,50±0,03 8,1±0,1 5,7±0,1
Дуб (кора) 0,25±0,02 6,5±0,1 4,5±0,1
Девясил (корень) 0,25±0,02 4,2±0,1 3,2±0,1
Рис. 1. Кинетические кривые хемилюминесценция (1/10) при инициированном ([АИБН] =
1,09 10-2 М, [ДБА] = 310-4 М,
Т = 343 К) окислении этилбензола в присутствии 0,01 масс% экстрактов корня кровохлебки, полученных методами:
1 - горячей мацерации;
2 - циркуляционной экстракции;
3 - электроэкстракции
Основываясь на различиях в физико-химических свойствах предполагаемых соединений экстрактов, разделение на фракции экстракта проведено методом жидкость-жидкостной экстракции. Классическая методика этой экстракции предполагает последовательное концентрирование в органическом слое веществ определенных классов из экстракта [9]. Выделение диэтиловым эфиром (ДЭ) фракции «нейтральных» фенолов: катехины и агликоны флавонолов, требует подщелачивания водного экстракта. Последующее под-кисление водного слоя и экстракция этилацетатом (ЭА) «кислых» фенолов не всегда приводит к достаточно полному их выделению, поэтому применяется селективное извлечение из сырья [9]. Фракционирование фенольных соединений по данной методике сложно и длительно во времени (табл. 3).
Так как экстракты, полученные методом электроэкстракции, имеют слабокислую среду (рН~6,0), представлялось логичным отделить в первую очередь «кислые» фенолы: фенолкарбоновые (ФКК) и окси-коричные (ОКК) кислоты (^д=10-4-10-5), а также фенолы и хиноны, растворимые в этилацетате. С целью увеличения специфичности извлечения водный экстракт был предварительно очищен от хлорофилла, тер-пеноидов и липидов экстракцией петролейным эфиром. Показано (рис. 2а), что количество перешедших в этилацетат фенолов зависит от pH водного слоя. Контролируя остаточное количество ФС,% в экстракте, было установлено, что наиболее полно «кислые» фенольные соединения извлекаются этилацетатом из водного экстракта при pH = 3,7 (рис. 2а). Для достижения в системе экстракт - этилацетат максимальной величины градиента концентраций проведено варьирование соотношения объемов растворителей. Из рисунка 2 (Ь) можно видеть что, наименьшее остаточное количество фенолов в водном слое достигнуто после проведения перколяции при соотношении объемов водной и органической фаз 1 : 11.
Таблица 3. Количество фенольных соединений в составе фракций экстракта корня кровохлебки (п = 5, Р = 0,95)
Количество последовательных экстракций Длительность процесса, мин Подщелачивание Без подщелачивания
ДЭ ЭА Водный остаток ДЭ ЭА
Ф.С.,% Ф.С.,% Ф.С.,% Ф.С.,% Ф.С.,%
1 50 4,5±0,2 6,3±0,2 22,1±0,4 0,71±0,05 1,75±0,05
3 150 5,5±0,2 10,8±0,2 12,8±0,3 1,80±0,05 5,2±0,2
7 350 5,5±0,2 18,7±0,3 6,5±0,2 3,5±0,2 9,5±0,2
Рис. 2. Зависимость остаточного количества фенольных соединений в экстрактах: коры калины (1) и корня девясила (2) при варьировании: а) pH экстракта, Ь) объема этилацетата в смеси с 1 мл экстракта
Для подтверждения наличия в экстрактах и их фракциях фенольных соединений был проведен спектрофотометрический анализ, применяемый для идентификации природных фенольных антиоксидантов [8, 14].
В УФ-диапазоне спектра этилацетатных фракций обнаружены максимумы при X = 210-230 нм и при X = 260-290 нм. Первый максимум является откликом сопряженной системы ароматического ядра с карбоксильной группой, второй суммарный пик отвечает содержанию во фракции ароматических колец с электро-нодонорными гидроксигруппами. Вид спектров свидетельствует о присутствии в этилацетатных фракциях как фенолкарбоновых кислот, так и гидроксибензолов и хинонов. Исключение составила фракция, полученная из экстракта корня девясила - вее спектре максимумов, характерных для ФКК, обнаружено не было. Поскольку ФКК являются эффективными АО [15], их отсутствие в этилацетатной фракции экстракта корня девясила обусловливает более низкую, чем у остальных экстрактов, величину АОА (табл. 2).
Выбор оптимальных значений pH водной фазы при выделении фракции флавоноидов диэтиловым эфиром показал, что для наиболее полного их извлечения необходимо создать pH = 7,5. При этом остаточное содержание флавоноидов в водной фазе минимальное. В спектрах фракции диэтилового эфира обнаружены максимумы при 213, 222, 257, 275, 290 и 310 нм, характерные для флавоноидов [8].
Фракции флавоноидов всех экстрактов проявляют очень низкую АОА, периоды индукции на хеми-люминесцентных кривых окисления ЭТБ выражены слабо, поэтому, об антиоксидантных свойствах этой фракции судили по снижению скорости окисления ЭТБ, определенной газоволюмометрическим методом (табл. 4).
Из таблицы 4 видно, что наибольшей антиоксидантной активностью обладает фракция флавоноидов экстракта корня кровохлебки, что связано, по-видимому, с более высоким общим содержанием флавоноидов в данном экстракте.
По результатам хемилюминесцентного анализа процесса окисления ЭТБ в присутствии искусственно составленной смеси полученных фракций (рис. 3) было установлено, что смесь фракций проявляет аддитивное или несколько более выраженное действие, чем каждая из фракций. По сравнению с неразделенным экстрактом смесь является более эффективным АО, поскольку при фракционировании экстракт освобождается от балластных веществ, в том числе прооксидантов, и концентрируется.
Таблица 4. Снижение скорости окисления (Уд/У) ЭТБ в присутствии фракции флавоноидов экстрактов
Снижение скорости Фракция флавоноидов экстракта:
окисления ЭТБ корня кровохлебки корня девясила коры дуба коры калины
Ус/У 3,9 1,8 1,2 2,1
Рис. 3. Кинетические кривые относительной интенсивности хл (1/10) при инициированном (VI =5,4-10-7 м0ЛЬ'Л—1*с—1, Т=343 К) окислении ЭТБ в присутствии (0,05 масс.%) экстракта коры дуба (1) и фракций: диэтилового эфира (2), этилацетата (3) и их смеси (1:1) (4)
Выводы
1. Методом мацерации в электрохимической ячейке с углеродными электродами, находящимися под напряжением 35 Ви методом циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета, получены экстракты из коры калины, коры дуба, корня девясила и корня кровохлебки с высоким содержанием экстрагированных веществ, в том числе фенолов.
2. Все полученные экстракты в той или иной степени обладают антиоксидантной активностью. Наиболее эффективные экстракты-антиоксиданты получены методом электроэкстракции из корня кровохлебки.
3. Фракционирование водных экстрактов лекарственных растений методом жидкость-жидкостной экстракции с применением этилацетата в оптимальных условиях, при pH = 3,7 позволяет получить фракцию кислых фенолов с высокой антиоксидантной активностью. Независимо от природы растительного сырья фракция диэтилового эфира малоэффективна как антиоксидант.
4. Смесь полученных фракций изученных экстрактов проявляет аддитивное антиоксидантное действие и превышает действие неразделенного экстракта.
Список литературы
1. Муравьёв И. А. Технология лекарственных форм. М., 1988. 480 с.
2. Горчакова Н.О., Олійник С.А., Гаркава К.Т., та ін. Антиоксидантні засоби - необхідні компоненти комплексної фармакотерапії // Фітотерапія в Україні. 2000. №1. С. 7-13.
3. Лавренов В.К. Полная энциклопедия лекарственных растений. СПб., 1999. Т. 1. 814 с.
4. Пищевые добавки : энциклопедия. СПб., 2004. 603 с.
5. Shyamala B. N., Naidu M. M., Sulochanamma G., and at. Studies on the Antioxidant Activities of Natural Vanilla Extract and Its Constituent Compounds through in Vitro Models // J. Agric. Food Chem. 2007. N19. Pp. 7738-7743.
6. Тюкавкина H.A., Руленко И.А., Колесник Ю.А. Дигидрокверцетин - новая антиоксидантная и биологически активная пищевая добавка // Вопросы питания. 1997. №6. С. 12-15.
7. Громова H.A. Сравнительное изучение некоторых методов экстрагирования растительного лекарственного сырья. М., 1970. 715 с.
8. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. М., 1977. 239 с.
9. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольних соединений. М., 1974. 95 с.
10. Белая Н.И., Филиппенко Т.А., Белый A.B. и др. Экстрагирование антиоксидантов из листьев толокнянки в электрическом поле // Химико-фармацевтический журнал. 2006. №9. С. 42-45.
11. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. М., 1979. 500 с.
12. Каухова И.Е. Новая методика получения растительных препаратов // Фармация. 2006. №1. С. 37-39.
13. Шляпинтох В.Я., Карпухин О.Н., Постников Л.М. и др. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химическихпроцессов. М., 1966. 91 с.
14. Кочетова М.В., Семенистая Е.Н., Ларионов О.Г., Ревина A.A. Определение биологически активных фенолов и полифенолов в различных объектах методами хроматографии // Успехи химии. 2007. Т. 76, №1. С. 88-100.
15. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты. Реакционная способность и эффективность. М., 1988. 274 с.
Поступило в редакцию 2 марта 2011 г.
После переработки 19 сентября 2011 г.
