CC BY
499
УДК 663.95:541.87 АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ НАСТОЕВ ЧАЯ
© А.А. Федосеева , О. С. Лебедкова, Л.В. Каниболоцкая, А.Н. Шендрик
Донецкий национальный университет, ул. Университетская, 24, Донецк,
83055, (Украина) E-mail: [email protected]
Исследованы антирадикальная и антиоксидантная активности экстрактов различных сортов чая. Для изученных образцов была различными методами определена концентрация полифенолов. Показано, что наиболее специфичным к фенольным соединениям чая является спектрофотометрический метод с использованием реактива Фолина-Чикольте. Выявлена корреляционная связь между содержанием полифенолов и антирадикальной активностью экстрактов. Не установлено существенных отличий в содержании полифенолов, антиоксидантной и антирадикальной активности для образцов чая из различных регионов.
Ключевые слова: чай, полифенолы, антирадикальная активность, антиоксидантная активность, ДФПГ, Твин-80. Введение
Свободные радикалы, непрерывно генерирующиеся в онтогенезе всех живых организмов, вследствие своей высокой реакционной способности являются потенциально опасными. Чрезмерная активация свободнорадикальных процессов влечет за собой каскад нежелательных реакций, лежащих в основе целого ряда заболеваний и патологических состояний, таких как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, онкологические заболевания, лучевая болезнь и др. Вещества, обладающие антирадикальной активностью, традиционно используются в лечении и профилактике так называемых свободнорадикальных патологий. Среди традиционных продуктов питания, характеризующихся антирадикальной активностью, особое место занимает чай. Этот популярный напиток давно зарекомендовал себя как хороший антиоксидант [1], что привело к появлению широкого спектра фармакологических, косметических препаратов и разнообразных биологических добавок на основе экстрактов чая (чаще всего зеленого). Предполагается, что такие препараты препятствуют оксидативному стрессу благодаря фенольным соединениям, входящим в состав таннино-катехиновой смеси чая (фенолкарбоновым кислотам, низкомолекулярным катехинам, таннинам и т.д.) [2, 3]. Однако вопрос о взаимосвязи между содержанием полифенолов в чайном экстракте и его антиоксидантной (в том числе и антирадикальной) активностью остается дискуссионным. В работах [4-6] для экстрактов чая обнаружена четкая корелляционная связь между содержанием полифенолов и антиоксидантной активностью. В то же время в целом ряде работ указанной корреляции не наблюдается, так, например, в [7] была исследована антирадикальная активность нескольких сортов зеленого, желтого, черного, а также обжаренного чая в реакции с дифенилпикрилгидразилом. Показано, что хотя содержание полифенолов падает в ряду зеленый чай - желтый чай - черный чай - обжаренный чай, антирадикальная активность обжаренного чая выше, чем у желтых и черных сортов. В [8] исследовалась антирадикальная активность различных сортов чая в реакции с катион-радикалом ABTS-+ (2,2'-азино-ди[3-этилбензтиазолин-6-сульфонат]), оказалось, что в реакции с ABTS-+ экстракты зеленого чая проявляют гораздо меньшую антирадикальную активность в сравнении с экстрактами черного чая, хотя и содержат гораздо больше полифенолов.
Целью нашей работы - определение общего содержания полифенолов в настоях чая с различным типом ферментации (зеленый, желтый, красный, черный, пу-эр) из разных ареалов произрастания (Шри-Ланка, Индия, Кения, Китай, Тайвань, Индонезия) и установление корреляционной зависимости между этим параметром и антирадикальной активностью, определенной равновесным методом в реакции со стабильным радикалом дифенилпикрилгидразилом, а также антиоксидантной активностью в реакции окисления Твина-80.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Были исследованы 19 образцов чая различных сортов и регионов произрастания (табл.). Каждый опыт повторяли трижды, доверительный интервал вычисляли по стандартной процедуре с использованием коэффициента Стьюдента (доверительная вероятность составляла 0,95).
Все исследуемые чаи растирали до порошкообразного состояния, после чего экстрагировали 0,5 г чая, 25 мл бидистиллированной воды, нагретой до 100 °С. Через 5 мин настои фильтровали. В полученных экстрактах определяли содержание полифенолов следующими методами: согласно ГОСТ 19885-74 [9] (метод Левенталя, основанный на окислении таннина чая перманганатом калия с использованием индигокармина в качестве индикатора), методом Дейса [10] (методом гравиметрического определения продуктов взаимодействия с избытком формальдегида) и спектрофотометрически с использованием реактива Фолина-Чикольте [11]. В качестве стандарта в случае спектрофотометрии использовали раствор галловой кислоты в дистиллированной воде. Галловую кислоту (Мегск) предварительно очищали перекристаллизацией из воды.
Для определения антирадикальной активности экстрактов (АРА) использовали реакцию со стабильным свободным радикалом дифенилпикрилкидразилом (ДФПГ) (Sigma-Aldrich) [12]. Для приготовления рабочих растворов применяли 96% этиловый спирт. Первоначальная концентрация ДФПГ в реакционной смеси составляла 7-10-5 моль/л. Степень обесцвечивания раствора ДФПГ при добавлении экстрактов определяли спектрофотометрически при 517 нм. Для каждого образца строилась зависимость концентрации непрореагировавшего ДФПГ от объема добавленного экстракта. Из полученных линейных зависимостей определяли объем настоя, необходимый для 50% деградации ДФПГ. Затем антирадикальную активность - как количество вещества ДФПГ, вступающее в реакцию с 1 мл экстракта [13] по формуле:
АрА=^0о/о(ДФПГ)^
настоя?
где V 50%(дФПГ) - количество вещества ДФПГ, составляющее 50% от исходного; Унастоя - объем настоя, определенный вышеописанным способом.
Антиоксидантная активность чайных экстрактов (АОА) была исследована в реакции окисления полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата (Твин-80) (Мегск) кислородом воздуха [14, 15]. Ранее было показано, что данная система моделирует перекисное окисление липидов плазмы крови [16]. В склянки объемом 200 мл вносили реакционную смесь следующего состава: 2 мл 1% водного раствора Твина-80, 0,2 мл 1 • 10-3 моль/л раствора сернокислого железа, 0,2 мл 1-10-2 моль/л аскорбиновой кислоты, 0,2 мл раствора испытуемого в качестве антиоксиданта экстракта. В контрольный раствор вместо испытуемого вещества вносили 0,2 мл воды. Смесь тщательно перемешивали, закрывали герметично пробкой и ставили в термостат при 313 К на 48 ч. По прошествии этого времени из реакционной смеси отбирали 2 мл, приливали 1 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты, смесь перемешивали и выдерживали в течение 1 ч. Затем раствор отфильтровывали через бумажный фильтр («синяя лента») и к фильтрату приливали 2 мл 0,25% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты. Смесь встряхивали и выдерживали 15 мин при 373К, затем охлаждали и проводили фотоколориметрическое определение концентрации окрашенного в розовый цвет триметинового комплекса продуктов окисления с 2-тиобарбитуровой кислотой при 532 нм в контрольных и опытных образцах.
Антиоксидантную активность (АОА) водных экстрактов образцов чая оценивали по интенсивности торможения накопления продуктов перекисного окисления. АОА рассчитывали по формуле:
В - В
АОА = -к------г- -100%
В
к
где Бк, Боп - оптическая плотность в контрольном и опытном образцах соответственно.
Обсуждение результатов
Поскольку таннино-катехиновая смесь представляет собой довольно сложную, многокомпонентную систему, указанные три метода позволяли оценить лишь общее содержание фенольных компонентов. Как видно из таблицы, концентрации таннинов, полученные для каждого образца тремя способами, в большинстве случаев совпадают в пределах погрешности. Значительно отличается точность измерения содержания таннинов.
Наименее точным оказался весовой метод определения таннинов. К существенным недостаткам данного метода следует отнести также увеличение погрешности метода с уменьшением концентрации таннинов, на-
личие в растворе низкомолекулярных продуктов, влияющих на результат измерения; кроме того для проведения реакции используются значительные количества токсичного формальдегида.
Сравнительно хорошую точность и воспроизводимость показал наиболее часто используемый в чаеперерабатывающей промышленности классический метод Левенталя, заключающийся в титровании экстракта чая перманганатом калия в присутствии индигокармина в качестве индикатора (результаты приведены в табл.). Однако и этот метод имеет ряд недостатков: субъективность определения конца титрования по появлению золотисто-желтой окраски; сильная зависимость результатов от интенсивности перемешивания титруемого раствора и от освещения; зависимость расхода перманганата калия от скорости титрования; неприемлемость применения единого пересчетного коэффициента для различного чайного сырья и готовой продукции (показано, что в зависимости от исследуемых объектов он может составлять от 0,00416 до 0,00735 [17]).
В последнее время наиболее широкое применение находит спектрофотометрическое определение соединений фенольного ряда [18]. Метод основан на окислительно-восстановительной реакции, в ходе которой восстанавливается фосфорно-молибденовая кислота. Интенсивность появляющейся синей окраски зависит от концентрации восстановителя. На практике чаще всего используют смесь фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой кислот, называемую реактивом Фолина-Чикольте. Известно, что с реактивом Фолина-Чикольте кроме компонентов таннино-катехиновой смеси могут реагировать присутствующие в экстракте восстанавливающие сахара, аскорбиновая кислота, белки и аминокислоты (цистеин и тирозин) [19]. Однако в большинстве случаев для этого требуются дополнительные условия или реагенты (так, аскорбиновая кислота и восстанавливающие сахара способны реагировать с фосфорномолибденовой кислотой только при нагревании). Кроме того, содержание фенольных соединений в настое значительно больше, чем других компонентов, способных в указанных условиях реагировать с реактивом Фолина. Поэтому данный метод позволяет получать более достоверные результаты. Как видно из таблицы, данные, полученные спектрофотометрически (С (GAE), %), характеризуются наименьшей погрешностью.
Итак, из рассмотренных трех альтернативных методик определения содержания фенольных соединений в образцах чая наиболее чувствительной и специфичной именно к фенольным компонентам настоя является спектрофотометрия. Поэтому в дальнейшем для анализа данных были использованы значения концентрации таннинов, определенные спектрофотометрически.
Для оценки антирадикальной активности чайных экстрактов использовалась реакция с ДФПГ. Данная методика исследования применяется для оценки антирадикальной активности как растительного сырья [13], так и экстрактов лекарственных растений. Можно отметить, что все исследованные сорта чая проявляют высокую антирадикальную активность (табл.). Наибольшей АРА среди зеленых сортов чая обладает образец 7 (марка Золотой Дракон, страна произрастания Китай, фирма производитель «Мономах»), среди черных сортов образец 10 (Дарджелинг, Индия «Wittard of Chelsea»). Между содержанием таннинов (определенным в реакции с реактивом Фолина-Чикольте) и АРА для исследованных образцов наблюдается удовлетворительная линейная корреляция (коэффициент корреляции r = 0,755, критерий значимости Р=0,001). Анализируя полученные данные, можно отметить, что исследованные зеленые сорта чая более богаты фенольными соединениями (среднее содержание полифенолов в экстрактах зеленых сортов чая составляет 0,288 ± 0,004%, в экстрактах черных сортов чая - 0,18±0,01%), что обеспечивает их большую АРА (среднее значение АРА для экстрактов зеленых сортов чая составляет 1,67±0,32, для экстрактов черных сортов чая -
1,19±0,18). Однако, как оказалось, некоторые сорта черного чая (например упомянутый выше образец 10) также богаты полифенолами и проявляют значительную АРА, сравнимую с зелеными сортами. Следует отметить, что методы определения общего содержания полифенолов в экстрактах чая давно разработаны и повсеместно используются для оценки качества сырья в пищевой промышленности. И поскольку антиради-кальная активность определяется содержанием полифенолов, это существенно облегчает выбор образцов чая с наибольшей антирадикальной активностью для пищевой и фармакологической промышленности.
В ходе изучения антиоксидантной активности в реакции окисления Твина-80 показано, что все исследованные сорта чая проявляют ингибирующее действие при окислении твина-80) (табл.). АОА исследованных экстрактов варьируется в пределах от 19% (образец 9) до 70% (образец 19). Достоверной корреляции между содержанием таннинов и АОА для исследованных образцов не наблюдается.
Не обнаружено для исследованных образцов также корреляции между АРА и АОА. Отметим, что для исследованных экстрактов не выявлено также достоверных отличий АОА зеленых и черных сортов чая. Так, средняя АОА экстрактов зеленых сортов чая составляет 42±7%, черных сортов чая - 43±8%.
Отдельно отметим, что нами не установлено зависимости между антиоксидантной и антирадикальной активностью и ареалом произрастания чая. Большее влияние на эти величины имеет сортность чая, тип его ферментации, особенности химического строения таннино-катехиновой смеси.
3.5 п
r = 0.755
л
4 о
5 ч < %
1.5
0.5
0.1 0.2 0.3 0.4
С (GAE), %
Рис. 1. Зависимость АРА от массовой доли полифенолов, определенной спектрофотометрически с использованием реактива Фолина-Чикольте
Общее содержание полифенолов и антирадикальная активность водных экстрактов различных сортов чая (*тип ферментации: ж - желтый, з - зеленый, к - красный, ч - черный)
Содержание таннинов, %
№ * Название (страна), производитель по Левенталю по Дейсу в реакции с реактивом Фолина АРА, дмоль/мл
1 ж Туманы Хуанг Шаня (Китай), «Чайна країна» 0,30±0,01 0,38±0,15 0,215±0,007 1,2±0,3
2 з Хэйлис (Цейлон) «Редженси Ти Лтд.» 0,36±0,01 0,47±0,24 0,249±0,003 1,1±0,1
3 з Лазурная россыпь (Китай) «Чайна країна» 0,241±0,004 0,29±0,08 0,179±0,003 1,24±0,07
4 з Эдвин (Цейлон) «Маброк Ті Лтд.» 0,100±0,008 0,235±0,005 1,4±0,7
5 з Greenfield Flying Dragon (Цейлон) «Орими Трейд» 0,35±0,01 0,300±0,005 1,6±0,2
6 з Принцесса Ява (Китай) «Орими Трейд» 0,14±0,01 0,213±0,001 1,6±0,4
7 з Золотой Дракон (Китай) «Мономах» 0,270±0,005 0,339±0,001 3,1±0,6
8 к Формоза Оолонг (Тайвань) «Nadin tea» 0,17±0,01 0,170±0,006 1,30±0,07
9 к Pu-Erh (Китай) «Экопродукт» 0,030±0,005 0,118±0,004 0,90±0,06
10 ч Дарджелинг (Индия) «Wittard of Chelsea» 0,289±0,004 0,36±0,15 0,223±0,004 1,71±0,02
11 ч Акбар (Цейлон) «Акбар» 0,121±0,007 0,35±0,19 0,109±0,005 1,09±0,07
12 ч Солнечная долина (Китай) «Чайна країна» 0,10±0,01 0,19±0,16 0,099±0,001 0,8±0,1
13 ч Ахмад (Цейлон) «Ахмад ти» 0,11±0,01 0,205±0,002 1,3±0,4
14 ч Батик (Цейлон) «СолоМія» 0,130±0,008 0,228±0,004 1,2±0,2
15 ч Эдвин (Цейлон) «Маброк Ті Лтд.» 0,140±0,005 0,211 ±0,003 1,2±0,1
16 ч Greenfield Golden Ceylon (Цейлон) «Орими Трейд» 0,16±0,02 0,144 ±0,002 1,02±0,09
17 ч Мономах (Цейлон) «Мономах» 0,210±0,005 0,167±0,002 1,11±0,18
18 ч Greenfield Kenyan Sunrise (Кения) «Орими Трейд» 0,170±0,005 0,142±0,005 1,17±0,12
19 ч Брук Бонд (Индия, Кения, Индонезия) «Юнилевер СНГ» 0,16±0,02 0,228±0,004 1,21±0,71
АОА,
%
26±9
37±7
48±9
37±2
48±4
37±14
46±6
21±15
19±4
48±19
24±10
46±9
48±3
53±10
21±5
56±9
39±3
26±5
70±2
0
Выводы
Таким образом, были рассмотрены три альтернативные методики определения содержания фенольных соединений в образцах чая. Показано, что наиболее чувствительной и специфичной к фенольным компонентам настоя является спектрофотометрическое определение по реакции с реактивом Фолина-Чикольте. Определена антирадикальная и антиоксидантная активность настоев чая. Выявлена корреляционная связь между содержанием полифенолов и антирадикальной активностью экстрактов. Не установлено существенных отличий в содержании полифенолов, антиоксидантной и антирадикальной активности для образцов чая из различных регионов.
Список литературы
1. Hodgson J.M., Puddey I.B., Croft K.D., Burke V. Acute effects of ingestion of black and green tea on lipoprotein oxidation // American Journal of Clinical Nutrition. 2000. V. 71. Р.1103-1107.
2. Yokozawa T., Cho E., Нага Y. Antioxidative activity of green tea treated with radical initiator 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride // I Agric. Food Chem. 2000. V. 48. P. 5068-5073.
3. Yokozawa T., Erbo D., Nakagawa T., Kashiwagi H., Nakagawa H., Takeuchi S., H. Y. Chung. In vitro and in vivo studies on the radical-scavenging activity of tea // Journal of agricultural and food chemistry. 1998. V. 46. №6. Р. 2143-2150.
4. Apak R., Guflu K., Ozyurek M., Karademir S. E., Erfa E. The cupric ion reducing antioxidant capacity and polypheno-lic content of some herbal teas // International Journal of Food Sciences and Nutrition. 2006. V. 57. №5. Р. 292-304.
5. Xu B.J., Yuan S.H., Chang S.K. Comparative Analyses of Phenolic Composition, Antioxidant Capacity, and Color of Cool Season Legumes and Other Selected Food Legumes // J Food Science. 2007. V. 72. №2. P. 167.
6. Amarowicz R., Troszyska A., Baryko-Pikielna N. Polyphenolics extracts from legume seeds: correlation between total antioxidant activity, total phenolics content, tannins content and astringency // Journal of Food Lipids. 2004. V. 11. №4. P. 278.
7. Satoh E., Tohyama N., Nishimura M. Comparison of the antioxidant activity of roasted tea with green, oolong, and black teas // International Journal of Food Sciences and Nutrition. 2005. V. 56. №8. _P. 551-559.
8. Gramza A., Pawlak-Lemaсska K., Korczak J., Wsowicz E., Rudzinska M. Tea extracts as free radical scavengers // Polish Journal of Environmental Studies. 2005. V. 14. №6. Р. 861-867.
9. ГОСТ 19885-74 Чай. Методы определения содержания таннина и кофеина. М., 1974. 5 с.
10. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. М., 1977. 158 с.
11. Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventos R.M. Analisis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocoalteu reagent // Methods in Enzymology. 1999. V. 299. Р. 152-178.
12. Molyneux P. The use of the stable free radical diphenilpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity // Songklanakarin J. Sci. Technol. 2004. V. 26. №2. P. 211-219.
13. Лапинский А.Г., Горбачев В.В. Антирадикальная активность экстрактов из некоторых дикоросов северного охотоморья // Химико-фармацефтический журнал. 2006. Т. 40. №6. С. 27-29.
14. Antolovich M., Prenzler P.D., Patsalides E. Methods for testing antioxidant activity // Analyst. 2002. V. 127. Р. 183-198.
15. Благородов С.Г., Шепелев А.П., Дмитриева Н.А. Определение антиокислительной активности химических соединений // Химико-фармацефтический журнал. 1987. Т. 21. №3. С. 292-296.
16. Опейда И.А., Шендрик А.Н., Качурин И.О. и др. Кинетика поглощения кислорода и хемилюминесценции при окислении липидов в присутствии ионов Fe2+ // Кинетика и катализ. 1994. Т. 35. №1. С. 38-44.
17. Цоциашвили И.И., Бокучава М.А. Химия и технология чая. М., 1989. 391 с.
18. Orthofer R., Lamuela-Raventos R.M. Analysis of total phenolics by means of Folin-Ciocalte reagent // Methods in Enzymology, Oxidants and Antioxidants. 1999. Part A. Р. 152-178.
19. Коренман И.М. Методы определения органических соединений. Фотометрический анализ. М., 1970. 334 с.
Поступило в редакцию 21 ноября 2007 г.
После переработки 4 апреля 2008 г.
