CC BY
47
АНТИОКСИДАНТНАЯ КОРРЕКЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС, ПЕРЕНЕСШИХ ПРЕНАТАЛЬНУЮ ГИПОКСИЮ
И.С. Добротворская, М.С. Степанова, М.Г. Маклецова,
Т.Н. Фёдорова
ГУ НЦН Неврологии РАМІІ, лаборатория клинической нейрохимии, Волоколамское шоссе, 80, 125367, Москва, Россия
Изучена возможность антиоксидантной коррекции окислительных повреждений головного мозга на 12-дневных крысах, перенесших пренатальную гипоксию. Показано, что карнозин, мексидол и NAAG, вводимые беременным крысам после гипоксического эпизода, способны положительно влиять на состояние головного мозга потомства — сохранять эндогенную антиоксидантную активность мембран мозга и повышать устойчивость нейронов к индуцируемому in vitro окислительному стрессу.
Пренатально перенесенная гипоксия и сопровождающий ее окислительный стресс характеризуются стойкими отдаленными последствиями, причем наиболее уязвимой является центральная нервная система [1]. Ранее нами было показано, что однократное гипоксическое воздействие в период внутриутробного развития (на 10-11-й день беременности) индуцирует выраженный окислительный стресс, проявляющийся в накоплении б ткани мозга гидроперекисей липидов, снижении антиоксидантной активности и, как следствие, в уменьшении устойчивости нейронов к индуцируемому окислительному стрессу. В этих условиях была установлена возможность коррекции гипоксических нарушений природным антиоксидантом карнозином [2]. Полученные данные позволяют предположить возможное участие синтетических и природных модуляторов окислительного стресса в защите мозга от пренатальной гипоксии. В настоящем исследовании проведена сравнительная оценка коррекции окислительных повреждений головного мозга 12-дневных крысят, перенесших пренатальную гипоксию и получавших природный нейропептид карнозин, синтетический антиоксидант мексидол [3] и агонист mGluR2/3 рецепторов N-ацетиласпартил глутамат (NAAG), обладающим по литературным данным нейропротекторными свойствами [4].
Материалы и методы. Острую гипоксическую гипоксию создавали в барокамере проточного типа, понижая в течение 1 мин давление до уровня, соответствующего подъему на высоту 12 ООО м. В опытах использовали крыс линии Вистар, содержащихся в стандартных условиях вивария. Гипоксию вызывали на 10-11-й день беременности, отбирая для последующих экспериментов только низко устойчивых к гипоксии животных [5].
После перенесения гипоксии животных случайным образом разделяли на пять групп, одна из которых служила контролем, а четыре остальные были использованы для оценки защитного действия карнозина, мексидола и NAAG. Лечение животных всех четырех групп начинали после шпоксической атаки. Карнозин и мексидол (оба препарата в дозе 100 мг/кг вес тела) животные получали с питьевой водой ежедневно в течение оставшегося периода беременности (11-13 дней) и последующих 12 дней жизни потомства. NAAG вводили дважды (через один и три часа после перенесенной гштоксической атаки) в дозе 2 мг/кг
веса внугрибрюшинно. Выбор дозы и способа введения препаратов основывался на описанных в литературе примерах использования карнозина [6], мексидола [3] и ЫААО [4] в качестве противоишемических агентов.
Количество животных в потомстве всех пяти групп не различалось статистически достоверно, составляя в контроле 9±1, после перенесенной гипоксии - 8 ± 1 и в группах животных, которым вводили исследуемые препараты — 10 ± 1. Из каждой группы было отобрано по восемь животных, которых декапитировали на 12-й день жизни и использовали их мозг для последующих нейрохимических исследований.
Из серого вещества головного мозга выделяли митохондриальную фракцию [7], в которой измеряли супероксидцисмутазную активность (СОД) по методу Фридовича [8]. В мембранных препаратах серого вещества определяли устойчивость ткани мозга к Ре2+-индуцированному перекисному окислению, измеряя по интенсивности хемшпоминесценции уровень предобразованных гидроперекисей, латентный период возгорания хемилюминесценции, отражающий резистентность ткани мозга к окислению, а также скорость окисления [9].
Из мозжечка экспериментальных животных готовили нейрональную суспензию и исследовали устойчивость нейронов к окислительному стрессу с помощью метода проточной цитометрии [10]. Антиоксидантную способность нейронов определяли по уровшо активных форм кислорода с помощью флуоресцентного зонда карбоксиметокси-2’,7’-дихлордигидрофлуоресцеина (СБСБ), создавая условия окислительного стресса инкубацией клеток с 20 мМ перекиси водорода в течение 20 минут. Для определения количества мертвых нейронов использовали иодистый пропидий (Р1).
Полученные данные подвергали стандартному статистическому анализу, используя программу «Бта^юа 5.0», достоверность получаемых различий оценивали по критериям Крускала-Уоллиса и Данна. Достоверными считали различия при р < 0,05.
Результаты и обсуждение. Супероксиддисмутаза, локализованная в митохондриальной фракции мозга, имеет особо важное значение для устойчивости мозга к активным формам кислорода [11], поскольку является ключевым ферментом антирадикальной защиты. Однако в используемых нами условиях острой гипоксической гипоксии повреждения мозга не сказывались на уровне определяемой нами активности этого фермента: как в группе контроля, так и в группе «гипоксия» величина СОД составляла 3,9 — 4,2 ед/мг белка (рис. 1). Активность СОД во всех экспериментальных группах животных, получавших карнозин, мексидол или ИЛАСт, находилась на том же уровне. Вероятно, что изменения активности этого фермента после гипоксического эпизода, если они и происходили, носили срочный характер и были нивелированы последующим периодом адаптации.
Тем не менее мембранные препараты мозга животных исследуемых групп существенно различались по устойчивости к Ре2+-индуцированному окислению. Из таблицы видно, что у животных, перенесших пренатальную гипоксию, уровень предобразованных гидроперекисей был значительно увеличен, а резистентность ткани мозга к окислению снижена. Этот процесс сопровождался повышением скорости окисления биологического материала. В группе животных, получавших карнозин или мексидол, уровень предобразованных гидроперекисей был существенно ниже, чем в группе «гипоксия», и не отличался от контроля.
Рис. 1. Активность Мп-СОД в митохондриальной фракции мозга экспериментальных животных. Данные представлены в виде М ± СО (среднее ± стандартное отклонение); 1 — контрольная группа (п = 7), 2 — гипоксия (п = 7), 3 — гипоксия + карнозин (п = 7), 4 — гипоксия + мексидол (п = 6),
5 — гипоксия + КА АС (п = 6)
Резистентность к перекисному окислению, отражающая общую эндогенную антиоксидантную активность, в этих группах сохранялась на уровне нормы. Скорость окисления препаратов мозга во всех группах животных, получавших лечение, была достоверно ниже, чем в группе «гипоксия», и приближалась к норме. В группе животных, получавших КААО, уровень предобразованных гидроперекисей был ниже, чем в группе «гипоксия», однако оставался существенно выше по отношению к контрольной іруппе. При этом резистентность к окислению, отражающая общую эндогенную антиоксидантную активность, была выше, чем в группе «гипоксия», хотя и не достигала контрольного уровня.
Таблица
Характеристика Ре2+-индуцироваиной хемнлюминесценцян мембранных препаратов серого вещества мозга исследуемых групп животных. Данные представлены в виде М ± СО (среднее ± стандартное отклонение)
Группы животных Параметры Ре2*-индуцированной хемилюминесценции
гидроперекиси, отн. ед. латентный период, с скорость окисления, отн. ед.
1. Контрольные животные (п = 7) 2. Гипоксия (п = 7) 3. Гипоксия+карнозин (п = 7) 4. Гипоксия+мексидол (п = 6) 5. Гипоксия+ ЫААО (п = 6) 129,3 ± 35,5 252,7 ± 72,5* 115.1 ± 36,5** 119.2 ± 24,4** 186,6 ± 54,9** 102,9 ± 16,8 77,1 ± 16,3* 100,4 ± 13,5** 100,0 ± 8,0** 93,3 ± 17,2 5,05 ± 0,78 6,92 ± 0,53* 4,66 ± 0,29** 6,11 + 0,90** 5,18 + 0,22**
Примечание; * достоверное отличие от контрольной группы (р < 0,05), ** достоверное отличие от группы «гипоксия» (р < 0,05)
Таким образом, несмотря на то, что активность СОД у всех животных к моменту исследования мозга существенно не различается, повреждающее действие гипоксии и протекторный эффект карнозина, мексидола и КААО выявляются при характеристике устойчивости мембран мозга к окислительному стрессу, основанной на хемилюминесцентном подходе. Защитный эффект карнозина и мексидола проявляется в их способности препятствовать нарастанию продуктов перекисного окисления липидов, сохранять на уровне контроля эндогенную антиоксидантную активность и скорость окисления биологического материала.
Описанное в данном экспериментальном исследовании защитное действие карнозина в условиях пренатальной гипоксии полностью согласуется с полу-
ченными ранее результатами [2]. В то же время оказалось, что антиоксидант мексидол, применяемый при лечении ишемических повреждений тканей [3; 12], также эффективен для коррекции гипоксических нарушений мозга. С этой точки зрения, представленные данные позволяют рекомендовать карно-зин и мексидол для коррекции последствий пренатальной гипоксии.
Интересно, что ИААО, не обладающий прямым антиоксидантным действием, но способный защищать нейроны от экзайтотоксического действия глутамата [4], достоверно не влиял на состояние эндогенной антиоксидант-ной защиты, но понижал уровень гидроперекисей в мозге даже при несистематическом введении (табл. 1).
Соответствуют этому выводу и данные, характеризующие устойчивость нейронов к окислительному стрессу, полученные методом проточной цитометрии. С помощью этого метода в группе «гипоксия» был отмечен самый высокий уровень активных форм кислорода (рис. 2). В группах животных, получавших кар-нозин и мскскдол, уровень активных форм кислорода был в три раза ниже, чем в группе «гипоксия», хотя и оставался выше контрольных значений. В условиях окислительного стресса т vitro, вызванного перекисью водорода в нейронах всех исследуемых групп животных наблюдался резкий прирост образования активных форм кислорода, причем в группе «гипоксия» он достигал максимальных значений. В нейронах, выделенных из мозга животных, получавших лечение, уровень активных форм кислорода был в два раза ниже по сравнению с группой «гипоксия», хотя и оставался выше контрольных значений. Несмотря на то что эффективность используемых протекторов нельзя сравнивать вследствие разных доз и способов введения, защитное действие ЫААО выявлялось несколько слабее, чем действие карнозина и мексидола.
1 1
—•—-|ня
г-.-]
контроль
гипоксия гипоксия+карноэин гипоксия+мексидол гипоксия+МААС
Рис. 2. Флуоресценция СБСФ в нейронах исследуемых групп животных (белый столбик - контрольный уровень, закрашеипый столбик — уровень свечения после 20 мин инкубации нейропов с 20 мМ И2О2). Данные представлены в виде М ± СО (среднее ± стандартное отклонение)
Инкубация нейронов с перекисью водорода приводила к возрастанию доли мертвых клеток в суспензии, при этом нейроны мозга животных, перенесших пренатальную гипоксию, оказывались гораздо менее устойчивыми к действию перекиси водорода (рис. 3). Нейроны мозга животных, получавших карнозин и мексидол, характеризовались практически такой же устойчиво-
стыо к создаваемому окислительному стрессу, как и нейроны контрольной группы. КААв гораздо в меньшей степени способствовал повышению устойчивости нейронов к создаваемому окислительному стрессу.
а юо
•Я-
і».
ГИПОКСИЯ
гипоксия+карноаин гипоксия+мексцдол
гипоксия+ЫААО
Рис. 3. Процент увеличения мертвых клеток в нейрональной суспензии исследуемых групп животных
после 20 мин воздействия 20 мМ Н202
Таким образом, мы обнаружили, что карнозин и мексидол оказывают выраженный нейропротекторный эффект в условиях данного эксперимента. ЫААО оказался менее эффективен, хотя в литературе описывалось его нейропротек-торное действие при экспериментальной ишемии головного мозга [4]. Возможно, более низкая эффективность КААв в наших условиях, когда протекторный эффект этого препарата оценивался на потомстве, вызвана недостаточной дозой.
Полученные данные свидетельствуют о протекторном действии исследуемых препаратов, которое выражается в их способности снижать уровень продуктов перекисного окисления липидов и повышать устойчивость нейронов к окислительному стрессу. Таким образом, антиоксидантная терапия, проведенная непосредственно после гипоксической атаки, перенесенной в период внутриутробного развития, способна защитить мозг формирующегося организма от окислительных повреждений. Это делает целесообразным проведение дальнейших исследований для подбора наиболее эффективных доз исследуемых соединений для коррекции окислительных нарушений головного мозга, вызванных пренатальной гипоксией.
Примечание: Работа поддержана грантами РФФИ (06-04-49675 и 07-04-00755) и грантом Федерального агентства по науке и инновациям № 02.512.11,2056.
Авторы приносят благодарность проф. А.А. Болдыреву, заведующему лабораторией нейрохимии ГУ НЦН неврологии РАМН, за полезные дискуссии по теме исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Граф А.В., Маслова М.В., Маклакова А.С., Соколова Н.А., Крушинская Я.В., Гончаренко Е.Н., Кудряшова Н.Ю., Байлсуманов А.А. Биохимические корреляты острой пренатальной гипоксии у беременных самок крыс и их потомства. // Нейрохимия. 2004.-Т. 21. №4. -С. 307-310.
2. Фёдорова Т.Н., Маклецова М.Г., Куликов А.В., Степанова М. С., Болдырев А.А. Кар-нозин защищает от окислительного стресса, вызванного пренатальной гипоксией. //Доклады академии наук. 2006. - Т. 408. №1. - С. 1-4.
3. Гусев ЕЙ., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. - М., 2001. - С. 244-245.
4. Cai Z., Lin S., Rhodes P.G. Neuroprotective effects of N-acetylaspartyl glutamate in a neonatal rat model of hypoxia-ischemia. // Eur. J. Pharmacol., 2002. - V. 22. - 437(3). - P. 139-145.
5. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1997. - Т. 124. №9. - С. 244-253.
6. Федорова Т.Н., Стволинскш С.Л., Доброта Д., Болдырев А.А. Терапевтическое действие карнозина при экспериментальной ишемии мозга // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2002. №1. - С. 41-44.
7. Шапабодов А.Д., Гусева Н.В. Основы мембранного транспорта. Тюмень, 2001. -С.89-90; 125-126.
8. Misra Н., Fridovich I. The role of superoxide anion in the autooxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. //J.Biol.Chem.,1972. - V. 247. — P. 3170-3175.
9. Фёдорова Т.Н., Болдырев A.A., Ганнушкина И.В. Биохимия. 1999. - Т. 64. - С. 94-99.
10. Болдырев А.А. Дискриминация между апоптозом и некрозом нейронов под влиянием окислительного стресса. // Биохимия. 2000. - Т. 65. Вып. 7. - С. 981-990.
11. Matsuo М., Yuan Н., Honda S. Cellular aging and oxidative stress. // Oxidative stress and aging. R.G. Cutler, Ed. - Basel; Boston; Berlin : Birchauser, 1995. - P. 35-43.
12.Левитина E.B. Влияние мексидола на клинико-биохимические проявления перинатальной гипоксии у новорожденных детей // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2001. - Т. 64. №5. - С. 34-36.
ANTIOXIDANT CORRECTION OF BRAIN OXIDATIVE INJURY OF RATS EXPOSED TO THE PRENATAL HYPOXIA
I.S. Dobrotvorskaya, M.S. Stepanova, M.G. Makletsova, T.N. Fedorova
Institute of Neurology of Russian Academy of Medical Sciences Department of Neurochemistry, Volokolamskoye shosse, 80, 125367, Moscow, Russia
The possibility of rat’s brain antioxidant correction of oxidative injury induced by prenatal hypoxia was studied. It was shown that camosine, mexidol and NAAG treatment of pregnant rats after subjection to hypoxia has positive influence on brain status of descendants. The administration of these drugs could prevent oxidative damage of the brain membranes, preserve antioxidant activity and increase brain neurons resistance to oxidative stress in vitro.
