CC BY
18УДК 57.017.3 : 615.917
Антимутагенные эффекты мелатонина у крыс, отравленных циклофосфамидом
Исследовано влияние синтетического аналога эпифизарного гормона мелатонина в дозах 5-50 мг/кг на частоту встречаемости хромосомных аберраций в клетках костного мозга крыс, отравленных циклофосфамидом в дозе 200 мг/кг. Экспериментально показано, что однократное профилактическое введение мелатонина в дозе 50 мг/кг за 30 мин до циклофосфамида достоверно снижает количество хромосомных аберраций в активно пролифе-рирующих клетках с 9,8±1,2% до 6,7±1,0%. В качестве возможных механизмов цитопротективного действия мелатонина рассматривается его влияние на антиоксидантную активность клеток и тканей, а также на пролиферативную и функциональную клеточную активность. Так, показано, что мелатонин снижает проявление оксидативного стресса, вызванного циклофосфамидом, а также нивелирует торможение миграционной активности лейкоцитов периферической крови человека и пролиферативной активности клеток селезенки у крыс.
Ключевые слова: хромосомные аберрации; мелатонин; циклофосфамид; ок-сидативный стресс; пролиферативная активность
Л.В. Пикалова1,М.Б. Иванов2, В.А. Горбунов1
'ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ, 194044, г. Санкт-Петербург; 2ФГБУН «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства», 192019, г. Санкт-Петербург
Введение. Молекула ДНК - наиболее важная биологическая молекула, повреждение которой при воздействии цитотоксикантов может иметь значимые последствия для организма. В связи с этим одной из проблем современной токсикологии и медицинской защиты является поиск веществ, обладающих способностью защищать генетический аппарат от химически индуцированных повреждений или ускорять репаративные процессы. Одним из таких соединений может стать мелатонин (и/или его синтетические аналоги), который, согласно данным литературы, может активно влиять на мутагенез [1, 2, 3, 4].
В нашем исследовании проведена оценка антимутагенного действия синтетического аналога гипофизарного гормона - мелатонина - на кластогенные эффекты циклофосфамида в миелокариоцитах костного мозга крыс и уточнены возможные механизмы генопротекции.
Материалы и методы исследования. Анализ частоты хромосомных аберраций в миелокариоцитах костного мозга и биохимические исследования выполнены на 310 белых беспородных трехмесячных крысах-самцах массой 180-270 г. Для изучения влияния мелатонина и циклофосфамида на рост клеток в культуре ткани использовали 800 фрагментов селезенки трехмесячных крыс-самцов линии Вистар. Оценка функциональной клеточной активности выполнена на образцах периферической венозной крови 55 мужчин.
В качестве исследуемых веществ использовали мелатонин (НПЦ «Фар-мзащита ФМБА России») и циклофосфамид (эндоксан) фирмы Baxter (Германия).
В исследованиях in vivo препараты вводили внутрибрюшинно: циклофосфамид в дозе 200 мг/кг, мелатонин - в дозах 5, 25 и 50 мг/кг. Животным контрольной группы вводили растворитель - физиологический раствор. В экспериментах in vitro препараты добавляли в культуральную среду: ци-клофосфамид в концентрациях 1,0 мкг/мл, мелатонин - 0,01 нг/мл - 1 мкг/ мл. Выбор доз мелатонина осуществляли исходя из рекомендаций, приведенных в литературных источниках [2, 5].
Выделение клеток костного мозга и приготовление препаратов для ци-тогенетического анализа проводили в соответствии с методическими рекомендациями [6]. Цитогенетический анализ осуществляли по стандартной методике [7], учитывая клетки с одиночными и парными фрагментами хромосом, дицентрическими хромосомами, транслокациями, а также клетки с двумя и более наборами хромосом. Для каждого животного анализировали по 100 метафазных пластинок. Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли по методу М. Uchiyama [8], а концентрацию продуктов рассчитывали по методике В.Б. Гаврилова [9]. Определение концентрации диеновых конъюгат (ДК) в гомогенатах тканей и гемолизате эритроцитов осуществляли по методике И.Д. Стальной [10]. Активность каталазы определяли методом М.А. Королюка [11]. Определение активности супероксид-
дисмутазы (СОД) проводили по рекомендациям В.А. Костюк и соавт. [12]. Активность глутатионпероксидазы (ГП) определяли по методу А.Р. Гаври-ловой [13] с использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бу-тила (ГПТБ).
Органотипическое культивирование тканей осуществляли в стерильных условиях [14]. Оценку миграционной активности лейкоцитов проводили в плоскопараллельных капиллярах по стандартной методике [15].
Полученные результаты обрабатывали статистически с помощью ^критерия Стьюдента. Вероятность ошибки р<0,05 считали достаточной для вывода о статистической значимости различий полученных данных.
Результаты и обсуждение. Проведенные исследования показали, что циклофосфамид в дозе 200 мг/кг вызывает выраженное повреждение генетического аппарата активно пролиферирующих клеток костного мозга крыс. Так, если у интактных животных количество клеток с хромосомными аберрациями составляло в среднем 1,5%, то через 24 ч после введения ци-клофосфамида - порядка 10%. При этом наиболее часто встречались такие нестабильные хромосомные аберрации, как парные фрагменты (в 36 клетках с аберрациями), реже - одиночные фрагменты и полиплоидные клетки (в 8 клетках). В единичных случаях (2-3 клетки) отмечались дицентриче-ские хромосомы и транслокации (табл. 1).
Мелатонин в дозах 5 и 25 мг/кг, введенный за 30 мин до циклофос-фамида, не способствовал снижению частоты аберрантных клеток. Однако отмечалось уменьшение числа одиночных фрагментов, а также имелась тенденция к снижению парных фрагментов (табл. 1).
Наиболее эффективным защитным действием на генетический аппарат клетки мелатонин обладал в дозе 50 мг/кг. Из данных, представленных в табл. 1, следует, что применение мелатонина приводило не только к снижению частоты хромосомных аберраций с 9,8±1,2 до 6,7±1,0%, но и к уменьшению числа аберраций различных типов (одиночных фрагментов - в 1,6 раза, парных фрагментов - в 1,5 раза, полиплоидных клеток - в 2,5 раза).
Таким образом, мелатонин при профилактическом введении оказывал защитное действие на хромосомный аппарат активно пролиферирующих клеток костного мозга крыс, отравленных циклофосфамидом, что, очевидно, может быть связано с увеличением резистентности генетического аппарата данного типа клеток. Механизм этого эффекта окончательно не установлен. В настоящей работе рассмотрены два аспекта этой проблемы - действие гормона на проявления оксидативного стресса, а также способность мелатонина влиять на функциональную и пролиферативную активность лимфоидных клеток и лейкоцитов периферической крови.
Данные, свидетельствующие о развитии у экспериментальных животных оксидативного стресса, вызванного воздействием циклофосфамида в дозе 200 мг/кг, представлены в табл. 2, из которой видно, что после введения крысам циклофосфамида в печени животных отмечалось увеличение
Пикалова Лидия Васильевна (Pikalova Lidiya Vasil'evna), младший научный сотрудник, ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ [email protected]
Иванов Максим Борисович (Ivanov Maxim Borisovich), заместитель директора, ФГБУН «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства», [email protected]
Горбунов Владимир Акимович (Gorbunov Vladimir Akimovich), врач анестезиолог-реаниматолог клиники военно-полевой терапии ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ, [email protected]
26
Токсикологический вестник (121)
количества малонового диальдегида (МДА) более чем в 3 раза по сравне- цитогенетических последствий воздействия на организм факторов химиче-нию с биоконтролем, а также повышение активности супероксиддисмутазы ской природы. (СОД). В эритроцитах циклофосфамид способствовал увеличению содержания диеновых конъюгат (ДК).
Мелатонин, введенный животным за 30 мин до циклофосфамида, способствовал снижению количества ДК в печени на 15% по сравнению с контролем, повышению активности каталазы и глутатионпероксидазы (ГП), а также нормализации активности СОД.
В эритроцитах крыс, отравленных циклофосфамидом, под влиянием мелатонина существенно (на 30-40%) снижалось содержание таких продуктов перекисного окисления липидов, как МДА и ДК. Также отмечалось увеличение активности СОД и каталазы в 1,1-1,2 раза (табл. 2).
Таким образом, представленные данные убедительно показывают, что в генопротективной дозе мелатонин обладает и антиоксидантным действием. Возможно, указанный эффект препарата связан с его способностью улавливать свободные радикалы (в частности, ОН) и образовывать менее токсичные соединения [16, 17].
С целью расширения представления о возможных механизмах формирования возможных антимутагенных эффектов мелатонина было проведено исследование его влияния на пролиферативную активность спленоцитов при воздействии циклофосфамида и на миграционную активность лейкоцитов периферической крови.
Установлено, что циклофосфамид в концентрации 1 мкг/мл вызывал достоверное уменьшение зоны роста эксплантатов селезенки. При этом мелатонин в концентрациях 0,05-100 нг/мл предотвращал индуцированную цитостатиком задержку роста культуральных клеток рост эксплантатов селезенки, а в концентрации 100,0 нг/мл не только нормализовал вызванные циклофосфамидом нарушения клеточной пролиферации, но и способствовал существенному увеличению зоны роста эксплантатов (рис. 1).
В следующей серии экспериментов исследовали влияние мелатонина на миграционную активность лейкоцитов периферической крови человека.
Установлено, что циклофосфамид в концентрации 1 мкг/мл вызывал достоверное уменьшение индекса миграционной активности лейкоцитов периферической крови. На этом фоне мелатонин, начиная с концентрации 0,1 нг/мл и выше, вызывал увеличение индекса миграционной активности лейкоцитов. Максимальное значение миграционной активности зафиксировано при добавлении мелатонина в концентрации 1,0 нг/мл и составило 108,9±2,1% (рис. 2).
Таким образом, в опытах in vitro установлено, что мелатонин стимулировал пролиферацию клеток селезенки, подавленную циклофосфамидом, а также нивелировал торможение миграционной активности лейкоцитов периферической крови человека.
Проведенные исследования убедительно показывают, что мелатонин при однократном профилактическом применении обладает антимутагенными свойствами при кластогенных воздействиях, усиливая антиоксидантную, пролифератив-ную и миграционную активность клеток.
Заключение. Хотя полученные данные не дают полного ответа на вопросы о механизмах генопротективного действия мелатонина, они свидетельствуют о перспективности использования синтетического аналога эпифи-зарного гормона мелатонина для профилактики развития неблагоприятных
Таблица 1
Влияние профилактического введения мелатонина на частоту возникновения и типы хромосомных аберраций, индуцированных циклофосфамидом (200,0 мг/кг), в клетках костного мозга крыс
(М±m, п=30)
Показатель Группы опытов
циклофосфамид (контроль) Мелатонин
5 мг/кг 25 мг/кг 50 мг/кг
Частота аберрантных клеток, % 9,8±1,2 9,2±1,1 9,3±1,4 6,7±1,0*
Одиночные фрагменты 8,0±1,2 3,0±0,9* 4,0±0,9* 5,0±1,0
Парные фрагменты 36,0±2,0 25,0±2,1* 30,0±2,2 29,0±2,4*
Дицентрические хромосомы 2,0±0,8 2,0±0,5 2,0±0,6 1,0±0,4
Транслокации 3,0±0,7 2,0±0,5 2,0±0,6 2,0±0,6
Полиплоидные клетки 8,0±1,2 6,0±1,3 6,0±1,3 3,0±0,7*
* Отличие (по t-критерию Стьюдента) от группы «Контроль» достоверно, р<0,05.
27
Таблица 2
Влияние мелатонина в дозе 50 мг/кг на показатели продуктов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в тканях печени и эритроцитах крыс при остром отравлении
циклофосфамидом (200 мг/кг) (M±m, n=50)
Показатель Группа исследования
Биоконтроль Циклофосфамид (контроль) Мелатонин
Печень МДА, нмоль/г ткани 108,09±17,91 362,97±91,57* 382,91±151,45*
ДК, нмоль/г ткани 39,72±2,193 43,43±2,74 36,75±3,50А
СОД, УЕ/мг белка ткани 5230,3±432,8 6526,8±316,7* 5547,9±358,7А
Каталаза, моль/мин г белка ткани 47,24±1,67 43,12±3,9 50,92±2,53А
ГП, нмоль/мин г белка ткани 0,489±0,053 0,558±0,086 0,78±0,126*А
Эритроциты МДА, нмоль/г НЬ 3,58±0,18 3,23±0,33 2,02±0,17*А
ДК, нмоль/г НЬ 290,66±6,52 326,94±16,14* 222,59±19,03А
СОД, УЕ/г НЬ 3786,51±98,98 3674,42±231,89 4371,69±358,82*А
Каталаза, моль/мин г НЬ 78,87±5,47 74,93±3,94 82,18±2,4А
ГП, мкмоль/мин г НЬ 0,7±0,02 1,2±0,06 1,1±0,02
* Отличие (по t-критерию Стьюдента) от группы «Биоконтроль» достоверно, р<0,05. А Отличие (по t-критерию Стьюдента) от группы «Контроль (циклофосфамид)», р<0,05.
28
Токсикологический вестник (121)
Рис. 1. Влияние мелатонина (нг/мл) на выраженность ингибирования роста эксплантатов селезенки крыс, индуцированных циклофосфамидом (1 мкг/мл). По оси абсцисс - концентрации мелатонина. По оси ординат - изменения уровня миграционной активности лейкоцитов (% от группы «Контроль»). *Отличие (по t-критерию Стьюдента) от группы «Контроль» достоверно, р<0,05.
120 110 100 % 90 БО 70 60
т
X
т
рм
m »
и контроль □циклофосфамид. 1
M ЕСГ:МЛ
и концентрации мвлатгнина
ОД 1 10 1DD 1
мг/мл нг/мл i-t/vùï нг/мл мкг/мл
Рис. 2. Влияние мелатонина на миграционную активность лейкоцитов периферической крови человека в присутствии циклофосфамида в концентрации 1 мкг/мл. По оси абсцисс -концентрации мелатонина. По оси ординат - изменения площади зоны роста эксплантата (% от группы «Контроль»). *Отличие (по t-критерию Стьюдента) от группы «Контроль» достоверно, р<0,05.
29
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Пикалова Л.В., Легеза В.И., Иванов М.Б. Жаков-ко Е.Б. Экспериментальное исследование цитопро-тективного действия мелатонина при радиационном воздействии. Бюлл. эксп. биол. и мед. 2011; 152 (7): 83-6.
2. Vijayalaxmi, RetterR.J., Tan D-X., Herman T.S., Thomas C.R. Melatonin as a radioprotective agent: a review. Intern. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004; 59 (3): 639-53.
3. ReiterR.J., Korkmaz A., Ma S., Rosales-Corral S., Tan D-X. Melatonin protection from chronic, low-level ionizing radiation. Mutat. Res. 2012; 1: 7-14.
4. Sarabia L., Maurer I., Bustos-Obergon E. Melatonin prevents damage elicited by the organophosphorous pesticide diazinin on mouse sperm DNA. Eco-toxicol. Environ. Saf. 2009; 72 (2): 663-8.
5. Cuzzocrea S., Tan D.X., Costantino G., et al. The protective role of endogenous melatonin in carageen-an-induced pleurisy in the rat. FASEB J. 1999; 13: 1930-38.
6. Preston R.J., Dean B.J., Galloway S., Holden H., McFee A.F., Shelby M. Mammalian in vivo cytogenet-ic assays. Analysis of chromosome aberration in bone marrow cells. Mutat. Res. 1987; 189 (2): 157-65.
7. Scott D., DanfordN.D., Dean B.J, Kirkland D.J. Chromosome aberration assay in mammalian cells in vitro. Report of the UKEMS Sub-Committee on
Guidelines for Mutagenicity Testing. Ed. Dean B.J. United Kingdom Environmental Mutagen Society, Swnsea, 1983: 43-64.
8. MicharaM., UchiyamaM. Determination of malo-naldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Anal. Biochem. 1978; 86 (1): 271-78.
9. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой. Вопр. мед. химии. 1987; 33 (1): 118-22.
10. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщен-ных высших жирных кислот. Современные методы в биохимии. М.; 1977.
11. Королюк М.А., Иванова Л.И.. Майорова И.Г.. Токарев В.Е. и др. Метод определения активности каталазы. Лаб. дело. 1988; 1: 16-9.
12. Костюк В.А., Потапович А.И.. КовалеваЖ.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцитина. Вопр. мед. химии. 1990; 36 (2): 88-91.
13. Гаврилова А.Р., Хмара Н.Ф. Определение активности глутатионпероксидазы эритроцитов при насыщающих концентрациях субстратов. Лаб. дело. 1986; 12: 721-24.
14. Чалисова Н.И.. Хавинсон В.Х., Пеннияйнен В.А.,
Григорьев Е.И. Влияние полипептидных фракций тимуса на развитие органотипической культуры вилочковой железы и селезенки крысы. "Цитология. 1999; 41 (10): 889-94.
15. Фримель Г.,_ред. Иммунологические методы. М.: Медицина; 1987.
16. Galano A. On the direct scavenging activity of melatonin towards hydroxyl and a series peroxyl radicals. Phys. Chem. Chem. Phys. 2011; 13(15): 7178-88.
17. Pieri C., Marra M., Moroni F., Recchioni R., Marcheselli F. Melatonin: a peroxyl radical scavenger more effective than vitamin E. Life Sci. 1994; 55(15): PL271-6.
L.V. Pikalova1, M.B. Ivanov2, V.A Gorbunov1. Antimutagenic effects of melathonin in rats poisoned with cyclophosphamide
'S.M. Kirov Military-Medical Academy, RF Ministry of Defense, 194044, St.Petersburg, Russian Federation
2Federal State Budgetary Institution «Research Institute of Toxicology», Federal Medical -Biological Agency, 192019, St.Petersburg, Russian Federation
The impact of the synthetic analogue of melathonin epiphyseal hormone in doses of 5 to 50 mg/kg on the incidence of chromosome aberrations in bone marrow cells of rats poisoned with cyclophosphamide in a dose of 200 mg/kg was investigated. It was experimentally shown that a single prophylactic administration of melathonin 30 minutes before cyclophosphamide uptake authentically lowers the number of aberrations in actively proliferating cells from 9.8±1.2% to 6.7±1.0%. As possible mechanisms of the melathnin cytoprotective action, is considered its influence on antioxidant activity of cells and tissues and on proliferative and functional activity of cells. For example, it was shown that melathonin reduces the manifestation of oxidative stresses caused by cyclophosphamide and also evens retardation of the leukocytes migration activity in human peripheral blood and proliferative activity of lien cells in rats.
Key words: chromosome aberrations; melathonin; cyclophosphamide; oxidative stress; proliferative activity.
Материал поступил в редакцию 28.06.2013 г.
30
