CC BY
24
УДК 579.24:552.579
Е. И. Дегтярёва1, Т. А. Петровская2, А. Н. Лебедев3, Д. Д. Зинкевич4
1 Кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии,
УО «Гомельский государственный медицинский университет», г. Гомель, Республика Беларусь 2Старший преподаватель кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, УО «Гомельский государственный медицинский университет», г. Гомель, Республика Беларусь 3' 4Студенты 4 курса лечебного факультета, УО «Гомельский государственный медицинский университет», г. Гомель, Республика Беларусь
АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА ЯНТАРЯ В ОТНОШЕНИИ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА
Выявлена противомикробная активность спиртового и ацетонового экстрактов из необработанного янтаря в отношении таких клинических изолятов Staphylococcus aureus, как БС-1, БС-9, БС-12, БС-19 (МПК от 2500 мкг/мл до 5000 мкг/мл), и водного раствора янтарной кислоты в отношении всех изучаемых клинических изолятов S. aureus и эталонного штамма из американской коллекции типовых культур (МПК- 2500 мкг/мл).
Ключевые слова: янтарь, янтарная кислота, экстракт, противомикробная активность, Staphylococcus aureus
Введение
Тысячелетиями складывались легенды и копились сведения о целебном янтаре, янтарной пудре и масле янтаря. Группа американских ученых провела исследование, доказавшее, что в янтаре содержится природный антибиотик, который успешно справляется с бактериями, устойчивыми к ранее известным антибиотикам.
Янтарь (сукцинит) - минералоид, окаменевшая ископаемая древесная смола, затвердевшая живица древнейших хвойных деревьев позднего мела и палеогена [1].
Янтарь неоднороден по своему составу: сложная смесь углеводородов, смол, янтарной кислоты и масел. В состав янтаря входит более 40 соединений.
Натуральный минерал состоит из нескольких химических веществ: углерода (С), водорода (Н2), кислорода (О2), серы (S). Необработанный камень - это высокомолекулярное соединение, в котором содержатся кислоты органического происхождения, как правило, с примесью серы. Обычно, дается следующая формула янтаря как «минерала» - C10H16O4+(H2S).
В 100 г янтаря находится 81 г углерода, 7,3 г водорода, 6,34 г кислорода, немного серы, азота и минеральных веществ. Количественные соотношения между отдельными элементами в янтаре подвержены колебаниям. Они непостоянны не только для янтаря одного месторождения или проявления, но даже для янтаря одного куска. Непостоянство состава не позволяет относить янтарь к минералам. Термин «янтарь» следует считать собирательным для целого ряда ископаемых смол. Характерным представителем этого ряда является сукцинит. С ним обычно отождествляется высококачественный янтарь [2].
Янтарь никогда не бывает химически чистым. В нем в виде примесей (от следов до 0,5 %) найдено более 30 химических элементов, таких как Y, V, Mn, Cu, Ti, Zr, Al, Si, Mg, Ca, Fe, Nb, P, Pb, Zn, Cr, Ba, Co, Na, Sr, Si, Sn, Mo, Yb.
Наличие их в основном связывают с механическими включениями минералов, преимущественно глин, кальцита, пирита. Главные и постоянные элементы-примеси в янтарях - кальций и железо.
До сих пор полный состав и строение янтаря не известны, в настоящее время они выясняются. Летучая его часть (около 10 % веса) - это ароматические соединения, терпены с 10 атомами углерода и сесквитерпены с 15 атомами углерода в молекуле. Из нелетучего остатка янтаря была выделена сукциноабиетиноловая кислота (С25Н40О4) с двумя ОН-группами (одна карбоксильная). В чистом виде из янтаря выделены абиетиновая кислота и ее изомеры: левопимаровая, палюстри-новая, неоабиетиновая, декстропимаровая и изодекстропимаровая кислоты. Первые четыре кислоты образуют химически родственную группу; они различаются между собой лишь положением двойных связей, которые легко смещаются внутри обоих колец. Абиетиновая кислота наиболее устойчивая. Только из нее обычно состоят древние ископаемые смолы. Новые данные о строении
янтаря, полученные с помощью газовой и тонкослойной хроматографии, показали в его составе следующие кислоты: дегидроабиетиновая, изодекстропимаровая, дегидроизопимаровая, сандарако-пимаровая, диагатеновая и абиетиновая. Они составляют 20-25 % растворимой в органических растворителях части балтийского янтаря. Остаток янтаря, не растворимый ни в одном из известных растворителей, назвали сукцинитом. Данные ИК-спектрометрии показали, что сукцинит содержит лактонные (сложные эфирные) группы и представляет собой сложный эфир [2]. Таким образом, янтарь состоит из трёх групп соединений:
1) летучих ароматических соединений - терпенов с 10 атомами углерода и сесквитерпенов с 15 атомами углерода в молекуле (около 10 % веса);
2) растворимых органических кислот: дегидроабиетиновая, изодекстропимаровая, дегидроизопимаровая, сандаракопимаровая, диагатеновая и абиетиновая и её изомеры: левопимаровая, па-люстриновая, неоабиетиновая, декстропимаровая и изодекстропимаровая кислоты. Они составляют растворимую в органических растворителях часть (20-25 %);
3) нерастворимых полиэфиров этих кислот со спиртами, образовавшимися из этих же кислот, - сукцинит. Содержание янтарной кислоты в сукцините колеблется от 3 до 8 %: наименьшее -в прозрачном сукцините (3,2-4,5 %), наибольшее - в выветренной поверхностной корке (8,2 %) [2].
По данным Ю. С. Шишковой, янтарная кислота оказывает неселективное антимикробное действие в отношении грамположительных, грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов [3].
Проблема устойчивости микроорганизмов к антибиотикам имеет глобальное значение и представляет широкий интерес с молекулярно-генетической, экологической и клинической точек зрения. На данный момент клинически значимые микроорганизмы можно разделить на чувствительные и устойчивые к действию антибиотиков. Резистентность микроорганизмов к антибактериальным средствам может быть врождённой и приобретенной, являться одним из примеров эволюции. Современные методики полногеномного секвенирования и комплексные базы данных нуклеотидных последовательностей дают представление о многогранности механизмов природной устойчивости к антибиотикам и способны дать информацию о генах, кодирующих метаболические ферменты и белки, регулирующие основные процессы физиологии бактерий [4].
Следовательно, лечение заболеваний, вызванных микроорганизмами, устойчивых ко многим антибиотикам, становится все более затрудненным, требуется использование альтернативных лекарственных препаратов [5].
Цель исследования: изучить антимикробные свойства спиртовых и ацетоновых экстрактов, полученных из необработанного балтийского янтаря.
Методы и методология исследования
Экстракция молекул органических кислот из порошка балтийского необработанного янтаря проводилась этиловым 96%-м спиртом и ацетоном. Для этого применили метод мацерации с 24-часовым периодом нагрева экстракционной смеси до температуры +35 °С в шейкере с частотой 120 перемешиваний в минуту. Спиртовые и ацетоновые экстракты через сутки отделяли от янтаря и фильтровали через бактериальные фильтры.
С целью снижения физико-химического воздействия спирта и ацетона на тестируемые микроорганизмы в дальнейшем отфильтрованные экстракты вносили во взвешенные пробирки и помещали в термостат с температурой +35 °С до полного выпаривания растворителя. Полное выпаривание ацетона произошло в течение суток, спирта - в течение трех суток. Проводились повторное взвешивание пробирок и вычисление сухого остатка экстракта [5].
Минимальные подавляющие концентрации (МПК) экстракта определяли методом микроразведений в стерильных полистироловых круглодонных 96-луночных планшетах (Starsedt, Германия) (рисунок 1).
Сухой ацетоновый экстракт растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO), концентрация экстракта в DMSO - 20 мг/мл. ДМСО - апротонный растворитель, в любых пропорциях смешивается с водой [6].
Далее из раствора DMSO готовили двукратные серийные разведения экстракта в питательном бульоне, в диапазоне концентраций от 10000 до 100 мкг/мл.
Рисунок 1. - Планшет серологический 96-луночный
Планшет заполняли следующим образом:
1) заполняем все лунки, кроме 1 ряда бульоном Мюллера - Хинтона по 100 мкл;
2) добавляем 200 мкл рабочего раствора экстракта в 1 ряд;
3) титруем экстракт с 1 по 11 лунки, перенося по 100 мкл из предыдущей лунки в следующую;
4) делаем взвесь микроорганизма с оптической плотностью 0,5 МакФарланд (1,5х108 КОЕ/мл);
5) т.к. нужно в каждую лунку внести по 5х105 микроорганизмов, а оптическая плотность 0,5 МакФарланд составляет 1,5х108, то титруем бактериальную суспензию. Берем 180 мкл физраствора и добавляем 20 мкл взвеси микроорганизмов. Вносим по 5 мкл полученной смеси в каждую лунку. Но начинаем вносить с 12 ряда, чтобы не повышать концентрацию экстракта в лунках.
Таким образом, 12-й ряд лунок не содержал янтарного экстракта и использовался в качестве положительного контроля (контроль роста культуры). На одном планшете в рядах A-G определялась минимальная подавляющая концентрация одновременно для 8 штаммов микроорганизмов.
Для тестирования были использованы суточные культуры 20 клинических изолятов Staphylococcus aureus: БС-1-БС-20. В панель микроорганизмов для тестирования включен эталонный штамм из американской коллекции типовых культур (ATCC) Staphylococcus aureus АТСС 29213.
Планшеты инкубировали в термостате 24 часа при 35 оС. Учет минимальной подавляющей концентрации (МПК) проводили по отсутствию видимого роста микроорганизмов, сравнивая опытные и контрольные лунки, а также лунки с неинокулированной питательной средой в камере для визуального считывания (зеркало+увеличитель) Thermo V4007 (рисунок 2).
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе проведенного исследования были изучены антибактериальные свойства спиртовых и ацетоновых экстрактов, полученных из порошка балтийского необработанного янтаря. Минимальные концентрации ацетоновых и спиртовых экстрактов, подавляющие рост золотистого стафилококка, представлены в таблице 1.
Таблица 1. - Концентрации ацетоновых, спиртовых экстрактов, подавляющие рост тест-микроорганизмов (мкг/мл)
Тест-м/о Ацетоновый экстракт Спиртовой экстракт
МПК (мкг/мл) МПК (мкг/мл)
БС-1 10000 5000
БС-2 10000 10000
БС-3 10000 10000
БС-4 10000 10000
БС-5 10000 10000
БС-6 10000 10000
БС-7 10000 10000
БС-8 10000 10000
БС-9 5000 2500
БС-10 10000 10000
БС-11 10000 10000
БС-12 5000 2500
БС-13 10000 10000
БС-14 10000 10000
БС-15 10000 10000
БС-16 10000 10000
БС-17 10000 10000
БС-18 10000 10000
БС-19 2500 2500
БС-20 10000 10000
АТСС 29213 10000 10000
Из результатов, представленных в таблице 1, видно, что ацетоновые и спиртовые экстракты из порошка балтийского необработанного янтаря обладают антимикробными свойствами в отношении клинических изолятов S. aureus. Так как DMSO имеет собственную антибактериальную активность, то минимальные ингибирующие концентрации экстрактов в отношении тест-культур необходимо учитывать с содержания DMSO не более 5 % в смеси, что соответствует лункам с концентрацией экстракта 5000 мкг/мл и меньше. МПК спиртовых экстрактов в отношении тест-микроорганизмов выше, чем у ацетоновых. Следует отметить, что и спиртовые, и ацетоновые экстракты обладают антимикробными свойствами в отношении одних и тех же клинических изолятов S. aureus (БС-9, БС-12, БС-19) (рисунки 3, 4).
Минимальные ингибирующие концентрации спиртовых и ацетоновых экстрактов находились в диапазоне от 2,5 до 5 мг/мл. Чувствительность стафилококков к экстрактам янтаря характеризовалась штаммовой специфичностью (значения МПК в 2 раза отличаются для различных клинических изолятов S. aureus). По этой причине для получения сопоставимых данных по противомикробной активности в различных исследованиях необходимо включать в панель тестируемых микроорганизмов эталонные штаммы из международных коллекций.
БС-17-21 - спиртовой экстракт Рисунок 3. - Планшеты, заполненные спиртовыми экстрактами из необработанного янтаря
БС-17-21 - ацетоновый экстракт Рисунок 4. - Планшеты, заполненные ацетоновыми экстрактами из необработанного янтаря
96%-й спирт как экстрагент проявил себя лучше, чем ацетон, о чем свидетельствуют значения МПК и более широкий спектр воздействия на клинические изоляты золотистого стафилококка. Ацетон и спирт по всей вероятности экстрагировали из необработанного янтаря смолы и терпены, которые и дали осадок экстракта. Янтарная кислота хорошо растворяется даже в воде, поэтому можно предположить ее нахождение в экстрактах.
По литературным данным, известно, что при использовании сукцинатсодержащих препаратов в комплексном лечении острых инфекционных деструкций легких (37 больных - острый абсцесс легкого и 6 больных - гангрена легкого) отмечено уменьшение признаков гнойной интоксикации, более быстрое купирование синдрома системной воспалительной реакции, сокращение сроков пребывания в стационаре [7].
Применение реамберина у 59 больных с тяжелыми интраабдоминальными инфекциями, осложненными септическим шоком, имело результатом более быстрое (в среднем на 2,5 дня) разрешение воспалительного синдрома по сравнению с группой сравнения, а также привело к снижению летальности (20,7 % против 26,7 % в контрольной группе, р <0,05) [8].
Таким образом, можно предположить, что янтарная кислота обладает бактерицидными свойствами в отношении возбудителей гнойно-септических инфекций. Для изучения антимикробных свойств янтарной кислоты были проведены дополнительные исследования. Для определения минимальных подавляющих концентраций (МПК) водного раствора янтарной кислоты был использован метод двукратных микроразведений. Для тестирования были использованы суточные культуры 20 клинических изолятов Staphylococcus aureus: БС-1-БС-20 и эталонный штамм из американской коллекции типовых культур (ATCC) Staphylococcus aureus АТСС 29213.
Минимальные концентрации янтарной кислоты, подавляющие рост золотистого стафилококка, представлены в таблице 2.
Таблица 2. - Концентрации янтарной кислоты, подавляющие рост тест-микроорганизмов (мкг/мл)
Тест-м/о Водный раствор янтарной кислоты
МПК (мкг/мл)
Staphylococcus aureus БС-1-БС-20 2500
Staphylococcus aureus АТСС 29213 2500
Из результатов, представленных в таблице 2, видно, что водный раствор янтарной кислоты обладает антимикробными свойствами в отношении всех клинических изолятов Staphylococcus aureus и эталонного штамма из американской коллекции типовых культур. Минимальная ингибирующая концентрация водного раствора янтарной кислоты соответствует значению 2,5 мг/мл. Янтарная кислота широко применяется только в нетрадиционной медицине, а в официальной -остается незаслуженно забытой. Необходимо расширять знания о бактерицидных свойствах кислоты и шире применять ее в лечении гнойно-септических заболеваний. Ввиду большой распространенности ГСИ можно рассматривать янтарную кислоту в качестве альтернативного противомикроб-ного препарата для местной терапии стафилококковых инфекций.
Заключение
Анализируя полученные данные, можно заключить, что:
1. Ацетоновые экстракты из порошка балтийского необработанного янтаря обладают антимикробными свойствами в отношении таких клинических изолятов S. Aureus, как БС-9, БС-12, БС-19.
2. Спиртовые экстракты обладают антимикробными свойствами в отношении таких клинических изолятов S. Aureus, как БС-1, БС-9, БС-12, БС-19.
3. Антимикробные свойства спиртовых экстрактов из янтаря выше, чем у ацетоновых.
4. Минимальная ингибирующая концентрация водного раствора янтарной кислоты в отношении S. aureus соответствует значению 2,5 мг/мл.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Perkovsky, E. E. Oldest amber species of Palaeoaphididae (Hemiptera) from Baikura (Taimyr amber) / E. E. Perkovsky, P. Wegierek // Cretaceous Research. - 2017. - Vol. 80. - P. 56-60.
2. Сребродольский, Б. И. Янтарь / Б. И. Сребродольский ; Академия наук СССР. - М. : Наука, 1984. - 112 с. - (Серия «Человек и окружающая среда»).
3. Изучение антимикробной активности некоторых двухосновных карбоновых кислот в сочетании с прополисом / Ю. С. Шишкова [и др.] // Медицинский Альманах. - 2014. - № 1 (31). -С. 99-101.
4. Основные принципы эволюции антибиотикорезистентности у бактерий / Н. В. Давидович [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2020. - Т. 65, № 6. - С. 387-393.
5. Дегтярёва, Е. И. Бактерицидные свойства спиртовых и ацетоновых экстрактов плодовых тел Ganoderma lucidum и Hericium erinaceus / Е. И. Дегтярёва, С. А. Коваленко // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты : материалы XII междунар. науч. конф., посвящ. 55-летию Ин-та микробиологии НАН Беларуси, Минск, 7-11 июня 2021 г. / орг. ком. конф.: Э. И. Коломиец (председатель) [и др.]. - Минск, 2021. - С. 191-193.
6. Антимикробные свойства спиртовых экстрактов Ganoderma lucidum (Curt.) P. Karst / Е. И. Дегтярева [и др.] // Всерос. Конгресс по медицинской микробиологии, эпидемиологии, клинической микологии и иммунологии (XXIV Кашкинские чтения) : сб. тез., Санкт-петербург, 911 июня 2021 г. [Опубл. в журн.] Проблемы медицинской микологии. - 2021. - Т. 23. - № 2. - С. 73.
7. Фуфаев, Е. Е. Реамберин в комплексном лечении острых инфекционных деструкций легких / Е. Е. Фуфаев, А. Н. Тулупов // Вести СПбМА им. И. И. Мечникова. - 2005. - № 1. - С. 137-139.
8. Ржеутская, Р. Е. Мембранотропное и дезинтоксикационное действие реамберина в комплексе интенсивной терапии у больных с тяжелой внебольничной пневмонией / Р. Е. Ржеутская // Вести СПбМА им. И. И. Мечникова. - 2005. - № 2. - С. 112-114.
Поступила в редакцию 24.02.2022
E-mail: elena.degtyaryova@tut.by; tuznik84@mail.ru ; fantomcotic@gmail.com; zinckevich_ksenia@mail.ru
E. I. Degtyareva, T. A. Petrovskaya, A. N. Lebedev, D. D. Zinkevich ANTIMICROBIAL PROPERTIES OF AMBER AGAINST STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Antimicrobial activity of alcohol and acetone extracts from untreated amber was revealed in relation to such clinical isolates of Staphylococcus aureus as: BS-1, BS-9, BS-12, BS-19. (MPC from 2500 mcg/ml to 5000 mcg/ml), and an aqueous solution of succinic acid in relation to all studied clinical isolates of Staphylococcus aureus and a reference strain from the American Type Culture Collection (MPC -2500 mcg/ml).
Keywords: amber, succinic acid, extract, antimicrobial activity, Staphylococcus aureus.
