CC BY
106
Вопросы общей патологии
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ СОКА ГРИБА ШИИТАКЕ (LENTINUS EDODES) ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ
Кузнецов О.Ю.1, доктор медицинских наук,
Милькова Е.В.2, кандидат медицинских наук,
Соснина А.Е.3, кандидат медицинских наук,
Баланцева Е.В.4, кандидат химических наук
1 ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия Росздрава», 153012, Иваново, просп. Ф. Энгельса, д. 8
2 МУЗ «Первая городская больница», 156005, Кострома, ул. Советская, д. 77
3 ООО «ЛДЦ МИЛЕНАРИС», 153035, Иваново, ул. Лежневская, д. 114
4 Институт химии растворов РАН, 153045, Иваново, ул. Академическая, д. 1
* Ответственный за переписку (corresponding author): тел.: (4932) 32-73-90
РЕЗЮМЕ Определена устойчивость сока высшего гриба шиитаке (Lentinus edodes), а также его антимикробная активность при длительном хранении. Основываясь на полученных данных, можно констатировать, что сок данного гриба - это перспективная лекарственная форма, обладающая избирательной активностью в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий из состава микрофлоры человека.
Ключевые слова: гриб шиитаке (Lentinus edodes), антимикробное действие, патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, индигенная микрофлора.
Издавна в Китае и Японии было известно об антимикробном действии гриба шиитаке О-епйпиэ ес1ос1е5). Порошок из шиитаке использовали как средство, предохраняющее продукты от порчи. Однако эмпирические знания многих поколений людей о свойствах данного гриба только в последние двадцать лет стали получать научное подтверждение.
В настоящее время доказана антиканцерогенная, иммуномодулирующая и вирицидная активность ряда веществ, выделенных из гриба шиитаке и среды его культивирования [3, 4, 5]. Однако данные об антимикробной активности немногочисленны и разноречивы, оценка влияния касается лишь единичных микроорганизмов и не затрагивает представителей отдельного биотопа, связанных общей средой обитания.
Цель работы - определение устойчивости сока гриба Lentinus edodes как лекарственного средства, оценка его антимикотической и антибактериальной активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обнаруживаемых при значительных дисбиотических изменениях, а также в отношении представителей индигенной микрофлоры слизистых оболочек.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объект исследования - Lentinus edodes (Shiitake) -штамм F 280, получен в дар от Tim Straub (компания «Pillsbary», Minnesota, USA). Гриб выращен в экологически чистых лабораторных условиях на субстрате из дубовых опилок с добавлением ячменя по технологии интенсивного выращивания
Kuznetsov O.Yu., Milkova E.V., Sosnina A.E., Balantseva E.V.
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF LENTINUS EDODES SUCCUS IN PROLONGED CONSERVATION
ABSTRACT Authors determined the stability of Lentinus edodes succus and its antimicrobial activity in prolonged conservation. The obtained results allowed to ascertain the fact that the succus of this fungus was the perspective medicinal form which had selective activity with respect to pathogenic and relatively pathogenic bacteria of human microflora structure.
Kev words: Lentinus edodes, antimicrobial activity, pathogenic and relatively pathogenic microorganisms, indigenic microflora.
плодовых тел грибов (патент № 38528 от 17 февраля 2004 г.) [1].
В процессе роста мицелия гриба на этапе зарастания субстрата, были образованы плодоносящие блоки. Блоки помещали на выгонку плодовых тел в соответствующие оптимальным жизненным потребностям условия по влажности, температуре (26°С) и вентиляции. После появления зачатков плодовых тел и прохождения этапа образования примордиев, грибам давали время полностью сформироваться и раскрыть шляпки. При этом шляпки плодовых тел достигали размеров в среднем 15-18 см. Блоки давали три генерации плодовых тел с интервалом в 14 дней (рис. 1).
Сформировавшиеся плодовые тела срезали, измельчали в гомогенизаторе до кашицеобразного состояния, выжимали сок. Сок стерилизовали механическим способом, пропуская через бактериальный фильтр (каолиновые свечи Шамбер-лена) с размером пор 1,2 мкм. В работе использовали свежий сок, сок трехмесячной выдержки при температуре от 0 до +3°С, сок трехгодичной выдержки.
Сок наносился на поверхность агара в стерильных условиях в концентрации 5 % от объема питательной среды. Антимикробная активность сока базидиомицета определялась по изменению колониеобразующей способности следующихмикро-организмов: Escherichia coli М-17 из препарата «Колибактерин сухой» («Биомед», Москва, серия С2-2 К19), Escherichia coli 0-114, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Candida albikans, Bifidodacterium spp., Lactobacterium spp., выделенные из препаратов «Лактобактерин» и «Бифи-
думбактерин». В эксперименте использовали суточную культуру исследуемых микроорганизмов. Культуру бактерий вносили в объеме 0,1 мл с единым количеством клеток исходного инокулята из девятикратного разведения на поверхность затвердевшего агара в чашке Петри и распределяли по поверхности. В качестве контроля служили чашки с неизмененной питательной средой. Основная среда, использованная в экспериментах -мясопептонный агар, для культивирования лактобактерий - МРС-среда, бифидобактерий -тио-гликолевая среда, грибов рода Candida - среда Сабуро. Сок вносился в толщу жидких сред с последующим равномерным перемешиванием.
Дополнительно для сравнения колониеобразующей активности штаммов использовали показатель колонизационной активности (ПКА), который способен охарактеризовать биологическую активность исследуемого микроорганизма в ходе его развития в определенных условиях среды обитания. Колонизационная активность - это вероятная способность микроорганизмов закрепляться в структуре биоценозов определенной экосистемы, противодействуя негативным воздействиям абиотических факторов, других биологических агентов, дестабилизирующих потоков веществ, информации и энергии, свойственных данной экосистеме. ПКА-десятичный логарифм отношения колонизационной активности оцениваемого штамма микроорганизма.
ПКА = 1дКОЕ2/ КОЕ.,, где КОЕ1 и КОЕ2 - количество колоний микроорганизма при разных условиях культивирования.
С целью определения стабильности сока гриба шиитаке было выполнено измерение его элек-
Вид сбоку Вид сверху
Рис. 1. Плодовые тела гриба шиитаке (Ьеп^гшБ ес1ос1е5) на субстратном блоке
тронного спектра поглощения (ЭСП). ЭСП сока гриба был снят на приборе Specord М40.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По данным исследования (табл. 1), при нанесении сока гриба шиитаке на поверхность плотной питательной среды наблюдалось достоверное снижение числа колоний Candida albicans (р < 0,005). Ингибирующее действие сока проявлялось не только уменьшением количества колоний Candida albicans в опыте относительно контроля, но и значительным уменьшением их диаметра. В контроле диаметр колоний составил 2,8 ± 0,45 мм, в опыте - 1,1 ± 0,03 мм (р < 0,05).
Внесение сока гриба Lentinus edodes в питательные среды культивирования бактериальных культур показало, что присутствие в среде исследуемого субстрата приводило к снижению числа колониеобразующих единиц Escherichia coli 0-114, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis.
В отношении представителей рода Escherichia обнаруживалась избирательность действия грибного сока. При ингибировании роста энтеропато-
генной кишечной палочки 0-114 внесение сока гриба шиитаке в среду культивирования непатогенной Escherichia coli М-17 приводило к резкому росту количества колоний (табл. 2).
Эти данные легли в основу патента на способ получения препарата колибактерин с повышенной жизнеспособностью клеток [2].
Внесение сока гриба шиитаке в стандартную питательную среду культивирования анаэробов в концентрации 5% не нарушало рост Bifidobacterium sp., оцениваемый по наличию типичных колоний в виде опрокинутых гвоздиков. Не происходило изменений и в характере роста лактобактерий.
Степень влияния среды обитания на жизнедеятельность микроорганизмов определяли по ПКА.
Достижение популяцией значения ПКА, равного +1 или -1, свидетельствует о сильнейшем воздействии внешних факторов на развитие составляющих ее клеток. Внешние факторы могут быть как пусковыми для активизации развития и/или разделения потенциально подготовленных к делению клеток с многочисленными нуклеои-дами, так и участвующими непосредственно в
Таблица 1. Оценка антимикробного действия сока гриба шиитаке на плотной питательной среде
Вид микроорганизма Число колоний микроорганизмов, КОЕ * 109/мл
Контроль (стандартная среда) М ± m (п = 16) Среда с соком гриба шиитаке М ± m (п = 16) Р ПКА
Candida albicans 9,5 + 2, 4 0,57 + 0,3 р < 0,005 -1,22
Escherichia coli 0-114 410, 64 + 4,12 313,60 + 6,74 р < 0,001 -0,11
Staphylococcus aureus 209,30 + 6,56 167,30 + 2,99 р < 0,001 -0,09
Streptococcus faecalis 341, 04 + 20,50 66,50 + 25,43 р < 0,0005 -0,71
Примечание: р - достоверность различий показателей между контролем и опытом.
Таблица 2. Сравнительная оценка колониеобразующей способности Escherichia coli М-17
Вариант опыта Число колоний микроорганизмов, КОЕ/мл Р ПКА
Опыт М + m (п = 12) Контроль М + m (п = 12)
Посев из разведения 108 7,58 + 1,16 1,25 + 0,29 р < 0,005 0,78
Посев из разведения 10'6 828 + 79,3 44,7 + 4,16 р < 0,001 1,26
Примечание: р - достоверность различий показателей между контролем и опытом.
метаболизме клеток популяции. Так или иначе, установление значений ПКА выше 0 может рассматриваться как положительное воздействие абиотических или биологических факторов внешней среды на тестируемый микроорганизм при постановке экспериментов с чистой культурой, а менее 0 - как ингибирование. Причем степень такого рода воздействия будет тем выше, чем более ПКА отличается от 0.
Установление ПКА для микроорганизмов, способных вызвать заболевания у человека, свидетельствует о том, что внесение сока шиитаке на питательную среду ингибирует развитие этих микроорганизмов (табл. 1). При анализе значений ПКА обнаружено, что влияние сока шиитаке не определяется особенностями строения клеточной стенки тестированных микроорганизмов.
Более углубленное изучение биологически активных веществ сока гриба шиитаке имеет большое значение, поскольку открывает перспективы для получения новых фармакологических препаратов с антимикробным действием. Вследствие этого достаточно важным вопросом является исследование стабильности состава получаемого сока.
Оценка стабильности сока шиитаке при его длительном хранении дала следующие результаты (рис. 2). В ближней к ультрафиолетовой (до 350 нм) области спектра наблюдается интенсивное поглощение света экстрактом даже при десятикратном его разбавлении, вследствие чего раствор имеет темно-коричневый цвет.
В области 250-650 нм в спектре наблюдается резкое снижение интенсивности. Только в ближней к инфракрасной области спектра проявляются два малоинтенсивных узких пика при 726 и 850 нм.
В течение двух месяцев характер ЭСП исследуемого экстракта не меняется, что свидетельствует о постоянстве химического состава и концентраций содержащихся в растворе хромофорных соединений. В ЭСП сока гриба после хранения в течении года в постоянных условиях (+4°С) длинноволновые полосы при 726 и 850 нм исчезают.
Это свидетельствует о нарушении хромофорной системы одного из окрашенныхкомпонентов сока, которое, в соответствии с соотношением интенсивностей полос поглощения, содержится в минимальных количествах в сравнении с другими компонентами сока гриба. Учитывая их исключительно малую интенсивность, можно утверждать о крайне незначительных изменениях светопоглощающих свойств изучаемого
длина волны, нм
Рис. 2. Электронный спектр поглощения сока гриба Shiitake при его хранении течение 2 месяцев
сока гриба Shiitake и, как следствие, стабильности его состава в течение длительного времени.
ВЫВОДЫ
1. Биокомпоненты гриба Lentinus edodes, в частности сок, обладают выраженным антибактериальным действием на тестируемые патогенные и условно-патогенные микроорганизмы.
2. Сок гриба шиитаке уникален еще и потому, что одновременно сочетает в себе антибактериальные и противогрибковые свойства, при этом не нарушая жизнедеятельность нормальной микрофлоры человека. Ни один, даже современный, антибиотик не сочетает антимикробные свойства и свойства пробиотика.
3. In vitro сок гриба Lentinus edodes в концентрации 5% от объема питательной среды обладает выраженным антимикробным действием в отношении Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli 0-114.
4. Сок гриба шиитаке в концентрации 5% от объема питательной среды стимулирует рост Escherichia coli М-17.
5. Бифидобактерии и лактобактерии проявляют резистентность к воздействию сока гриба ши-итаке в концентрации 5% от объема питательной среды.
6. Даже при длительном хранении активные компоненты сока гриба Ьепйпиэ ес1ос1е5 не разрушаются, что позволяет использовать его в практической медицине.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пат. 38528 РФ МПК7 А 61 К 35/74. Емкость для выращивания мицелия высших грибов и их плодовых тел.
2. Пат. № 2174842 РФ МПК7 А 01 G 1/04. Способ получения препарата-эубиотика колибактерин.
3. Kurashige S., Akuzawa Y., Endo F. Effects of Lentinus edodes administration on cancer outbreak // Journal Immunology. - 1997. - № 19 (2). P. 175-183.
4. Suzuki H., Iryama K., Yoshida O., Yamazaki S., Yamamoto N., Toda S. Structural characterization of
the immunoactive and antiviral water-solubilized lignin in an extract of the culture medium of Lentinus edodes mycelia (LEM) // Agric. Biol. Chemistry. - 1990. -№ 54(2). P. 479-487.
5. Yamamoto Y., Shirono H., Kono K., Ohashi Y. Immunopotentive activity of the water-soluble lignin rich fraction prepared from LEM - the extract of the solid culture medium of Lentinus edodes mycelia // Biotechnology Biochemistry. - 1997. - № 61 (11). -P. 1909-1912.
Поступила 20.01.2010 г.
