CC BY
6
УДК 615.2: 632.938 © 2018 Князева О. А. и соавторы
Антииммуносупрессивное действие глюконатов 3Д-металлов при экспериментальном иммунодефиците
Ольга Александровна Князева1*, Сабина Ильясовна Уразаева1, Ирина Григорьевна Конкина2, Лилиана Минкаировна Саптарова1, Луиза Мавлетовна Газдалиева1, Юрий Ильич Муринов2
башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа, Россия; Уфимский институт химии Российской академии наук, г. Уфа, Россия
Реферат doi: 10.17816/KMJ2018-255
Цель. Оценка влияния глюконатов 3d-металлов на комплемент-фиксирующую функцию иммуноглобулинов G и функциональную активность комплемента.
Методы. Исследование проведено in vivo на 2,5-3-месячных белых лабораторных мышах массой тела 25-28 г с вторичным иммунодефицитом, который индуцировали с помощью однократного внутрибрюшинного введения циклофосфамида, а также in vitro в тест-системе с использованием сенсибилизированных эритроцитов барана. Иммунологические исследования были проведены у интактных животных, а также до и после введения глюконатов Mn, Co, Cu, Zn мышам с индуцированным иммунодефицитом. Содержание иммуноглобулинов G и их комплексов с субкомпонентом первого компонента комплемента C1q определяли в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с помощью специфических моноклональных антител. Результаты. Показано, что 2-недельное пероральное введение глюконатов 3d-металлов (Mn, Co, Cu, Zn) в дозе 1/10 LD50 иммунодефицитным мышам вызывает значительное повышение уровня иммуноглобулинов G и их комплексов с C1q. Наибольшее повышение концентрации отмечено при введении глюконата цинка. Также с помощью сенсибилизированных эритроцитов барана in vitro было показано, что глюконаты кобальта и (в меньшей степени) марганца увеличивают функциональную активность C1q.
Вывод. Глюконаты 3d-металлов (Mn, Co, Cu, Zn) обладают иммунокорригирующими свойствами: повышают содержание иммуноглобулинов G и их комплексов с C1q, значительно снижающееся в результате действия циклофосфамида; глюконаты кобальта и марганца оказывают стимулирующее действие на функциональную активность комплемента по классическому пути, что свидетельствует о различных механизмах иммунокор-ригирующего действия исследуемых глюконатов металлов и требует дальнейшего изучения. Ключевые слова: глюконаты 3d-металлов, циклофосфамид, IgG, C1q, комплексы C1q-IgG.
Antiimmunosuppressive action of 3d-metal gluconates in experimental immunodeficiency
O.A. Knyazeva1, S.I. Urazaeva1, I.G. Konkina2, L.M. Saptarova1, L.M. Gazdalieva1, Yu.I. Murinov2 'Bashkir State Medical University, Ufa, Russia;
2Ufa Institute of Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Ufa, Russia
Aim. Evaluation of the effect of 3d-metal gluconates on complement-fixing function of immunoglobulin G and functional activity of complement.
Methods. The study was conducted in vivo on 2.5-3 month-old white laboratory mice weighing 25-28 g with secondary immunodeficiency, which was induced by a single intraperitoneal injection of cyclophosphamide, as well as in vitro in a test system using sensitized sheep erythrocytes. Immunological studies were performed in intact animals, and before and after the administration of Mn, Co, Cu, and Zn gluconates to mice with induced immunodeficiency. The content of immunoglobulin G and its complexes with subcomponent of the complement first component C1q was determined in serum by ELISA using specific monoclonal antibodies.
Results. Two-week oral administration of 3d-metal gluconates (Mn, Co, Cu, Zn) in a dose of 1/10 LD50 to immunodeficient mice was shown to cause a significant increase in the level of immunoglobulin G and its complexes with C1q. The greatest increase in concentration was observed with the introduction of zinc gluconate. Also by means of sensitized sheep erythrocytes in vitro, cobalt and, to a lesser extent, manganese gluconates were shown to increase the functional activity of C1q.
Conclusion. 3d-metal gluconates (Mn, Co, Cu, Zn) demonstrate immunocorrecting properties: increase the content of immunoglobulin G and its complexes with C1q, significantly decreasing as a result of cyclophosphamide effect; cobalt and manganese gluconates have a stimulating effect on the functional activity of complement by its classical pathway, which indicates different mechanisms of immunocorrection action of studied metal gluconates and requires further studies.
Keywords: 3d-metal gluconates, cyclophosphamide, IgG, C1q, C1q-IgG complexes.
Адрес для переписки: olga_knyazeva@list.ru
Поступила 15.11.2017; принята в печать 16.01.2018.
Иммуносупрессивное действие химио-терапевтических препаратов — весьма существенный негативный фактор, снижающий эффективность их применения. В связи с этим изучение действия иммуно-модуляторов различной природы при восстановлении резистентности организма после приёма экзотоксикантов является актуальной задачей медицины и биохимии.
Одним из широко применяемых в онкологии препаратов служит цитостатик ал-килирующего действия циклофосфамид, представляющий собой фосфорилирован-ное циклическое производное иприта [1, 2]. Известно, что при его попадании в организм млекопитающих развивается выраженная супрессия пролиферации В-лимфоцитов и, как следствие, снижение уровня иммуноглобулинов, а также нарушения в системе комплемента, который служит важным звеном врождённого гуморального иммунитета [3, 4].
В качестве корректоров иммунных нарушений в данной работе были рассмотрены глюконаты 3d-элементов, обладающие способностью корректировать иммунные нарушения [5]. Соединения 3d-металлов характеризуются многообразием направлений взаимодействия с биологическими мишенями [6]. Введение этих металлов в организм в виде неорганических солей проявляется выраженной токсичностью [7-10], поскольку они воспринимаются иммунной системой слизистой оболочки тонкой кишки как гаптены, активирующие моноцитарно-ма-крофагальную систему по механизму незавершённого фагоцитоза [11]. В результате происходит индуцирование перекисных процессов, которые приводят к повреждению клеточных мембран. Однако в составе координационных соединений с рядом хе-латирующих лигандов 3d-элементы в значительной степени теряют токсичность и способны проявлять иммунокорригирую-щие свойства [6, 12, 13].
В этом плане представляет интерес изучение комплексных соединений 3d-метал-лов с полиоксикислотами, в частности с D-глюконовой кислотой. Было показано, что эти соединения имеют более низкую токсичность по сравнению с неорганическими соединениями [12]. Возможно, хела-тирующий эффект D-глюконовой кислоты препятствует реализации индуцирования перекисных процессов, и 3d-элементы могут формировать стабильный биодоступный пул, не оказывающий выраженного цито-токсического действия.
Инициация классического пути системы комплемента начинается с взаимодействия субкомпонента первого фактора комплемента С^, который находится в сыворотке крови в виде мультимолекулярно-го комплекса С^-2С1г-2С^ с активатором, которым является главным образом иммуноглобулин G (IgG) в составе комплекса антиген-антитело. Комплексы C1q-IgG-ан-тиген формируются постоянно в результате иммунного ответа организма, так как они запускают каскад биохимических реакций системы комплемента по классическому пути и стимулируют активацию натуральных киллеров, привлекающих фагоциты и лимфоциты [14].
Целью настоящей работы было изучение влияния глюконатов 3d-металлов на комплемент-фиксирующую функцию IgG и функциональную активность комплемента.
Эксперимент проведён на 2,5-3-месячных белых беспородных мышах с массой тела 25-28 г, самцах. Иммунодефицит индуцировали путём однократного вну-трибрюшинного введения цитостатика ци-клофосфамида (эндоксана; Бакстер АГ, Швейцария) в дозе 50 мг/кг. Контролем служили две группы: интактные и имму-нодефицитные животные («без лечения»), которым вводили дистиллированную воду.
Влияние глюконатов Мп, Со, Си, 2п, синтезированных по методике, описанной в [12], изучали в сравнении с двумя группами: (1) введение препарата ликопид — [4-0-(2-ацетиламино-2-де-зокси-р^-глюкопиранозил)^-ацетил-мурамил]^-аланил^-а-глутамиламид, который относится к фармакотерапевти-ческой группе иммуностимулирующих средств, являясь синтетическим аналогом бактериальных гликопептидов, и (2) глюко-ната кальция (CaGl).
Дозы обоих препаратов рассчитывали по инструкциям: ликопид — 0,17 мг/кг (0,14-0,28 мг/кг), глюконат кальция — 50 мг/кг (28-71 мг/кг). Пероральное введение всех препаратов начинали через 24 ч после инъекции циклофосфамида и далее ежедневно в течение 2 нед в дозе 1/10 полулетальной дозы (LD50) [12]. На 15-е сутки у животных забирали кровь и отделяли сыворотку, в которой методом иммунофер-ментного анализа с помощью специфических мышиных моноклональных антител против С^ и поликлональных кроличьих антител против IgG мыши, конъюгиро-ванных с пероксидазой (ГНЦ НИИ ОЧБ,
Санкт-Петербург), определяли уровень IgG и комплексов C1q-IgG.
Оценку влияния глюконатов металлов на функциональную активность комплемента по классическому пути выполняли с использованием сенсибилизированных гемолитической сывороткой (ФГУП НПО «Микроген» МЗ России) эритроцитов барана. В качестве источника комплемента использовали донорскую сыворотку в разведении от 1:2 до 1:128. Глюконаты 3d-металлов в изотоническом растворе натрия хлорида (10-2 М) по 50 мкл вносили в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 30 мин при 4 °C. После этого добавляли сенсибилизированные эритроциты барана в вероналовом буферном растворе (по 50 мкл) и инкубировали при 37 °C в течение часа.
Оптическую плотность надосадочной жидкости, перенесённой в новый планшет, измеряли в той же последовательности при длине волны 450 нм (иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, США). Фиксацию комплемента (С%) сенсибилизированными эритроцитами в присутствии глюконатов металлов рассчитывали по формуле:
С%=(Е -Е )/Е х100%,
v о к о ^
где Ео — оптическая плотность в присутствии препарата; Ек — оптическая плотность контрольной пробы.
Манипуляции с лабораторными мышами проводили в соответствии с положением Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, которое соответствует положениям, принятым в Российской Федерации (МЗ РФ от 19 июня 2003 г. №267).
Результаты статистически обрабатывали с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 10,0. Для описания количественных признаков в малых выборках применяли медиану (Ме) и интерквартильный размах (Qj-Q3). Для расчёта статистической значимости различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни для двух независимых групп. Статистически значимыми считали значения при р <0,05.
Представленные результаты исследования (табл. 1, 2) показывают, что введение циклофосфамида вызывает у мышей снижение уровня IgG на 53%, а комплексов C1q-IgG — на 31,5% относительно группы интактных мышей, что указывает на побочное действие цитостатика, который
вызывает изменения в системе лимфопоэ-за, вследствие чего происходит угнетение синтеза IgG. С другой стороны, препарат в результате своего цитотоксического действия неселективно угнетает митотиче-скую активность клеток различных тканей, способствуя их дискомплексации, дистрофическим и дегенеративным изменениям, приводящим к гибели по пути некроза, или же потенцируя апоптоз. Образующиеся вследствие этого «осколки» и метаболиты распада, которые не могут полностью инактивироваться угнетённой макрофа-гально-фагоцитарной системой, связываются с Fc-фрагментами IgG, конкурируя с С^, тем самым снижая долю связывания СЦ с IgG. Кроме того причиной снижения образования комплексов может быть гепа-тотоксическое действие циклофосфамида, которое обусловливает недостаточный синтез компонентов комплемента или их некомпетентность [1].
Введение глюконатов 3d-металлов в течение 2 нед приводило к существенному повышению концентрации IgG в сыворотке крови (см. табл. 1) по сравнению с животными контрольной группы «без лечения» (р <0,05). При введении глюконата цинка зарегистрировано наибольшее повышение концентрации IgG — на 31%, далее в порядке убывания следуют кобальт — на 25%, медь — на 22%. В меньшей степени эффект проявлялся под действием глюконата марганца — на 17%.
Аналогичная картина отмечена и в содержании комплексов C1q-IgG (см. табл. 2). Здесь выраженное увеличение было отмечено в группах мышей, получавших глюко-нат цинка (на 28,5%), глюконат марганца (на 25%) и глюконат меди (на 20%), в меньшей степени — при введении глюконата кобальта (на 18,5%). Не исключено, что такое действие глюконатов 3d-металлов может быть связано со стимулированием дополнительного синтеза IgG, а также, возможно, с конкурирующим взаимодействием этих соединений с метаболитами распада, смещающим равновесие реакции С^ с IgG в сторону увеличения доли образования комплексов.
Поскольку в группе животных, получавших глюконат кальция, зафиксировано лишь незначительное повышение уровня ДО (на 0,4%) и комплексов С^-ДО (на 3%) относительно группы «без лечения», можно предположить, что определяющее влияние на изменение приведённых показателей оказывают 3d-элементы.
© 17. «Казанский мед. ж.», №2
257
« I
х Я
к я к
и
«
о К
К
к и о Л И
1) &
о Л о
И
О ад
О и о К К
н ^
ю о н и о к
Л
к и
И
о
Л
^
Й к
И
о н н Й н
И
о
[3 к о И
5 1) к
к «
к
н
т
я а а
ч
«о я Н
8 — ИД + ZnGl (п=12) 1,16±0,14 1Д8 [1Д7-1Д4] 353 000 000 000 °„°„°„ о" о" о" 11= 11= 11= &Р л
7 — ИД + CuGl (п=12) 5 о" -Н 2 О^ 1;04 [0а92-1=12] 262 060 000 оп оп оп о" о" о" 11= 11= 11= &р ¿р
6 — ИД + CoGl (п=12) 6 о" -Н 7 О^ 1;09 [0;98-1;21] 696 о 2 о о § о о § о о °° о о° о"
1 5 — ИД + МгЮ1 (п=12) о" -Н 4 о" 0;96 [0;89-0;99] ^ £ ^ о^о °„0 0„ О 0"0 "-Ял.
о ад 4 — ИД + CaGl (п=12) О^ о" -Н о" 2 о" [0;63-0;78] 90 £ т §° Ч го"
3 — ИД + ликопид (п=12) 2 о" -Н 4 00 о" 0;86 [0/74-0;93] 3 0 "0 о" 11= РР
2 — ИД без лечения (п=12) О^ о" -н чо о" 0/71 [0;63-0;76] 3 0 0 0 сэ о" 11= &р
1 — интактные (п=12) 3 гч о" -Н 8 1;51 [1;34-1/72] 1
Статистический показатель Ме 7 а л
8 — ИД + ZnGl (п=12) 6 "3 3 "9 1"95 [1;94-1;44] 353 000 000 000 Оп СЭ Оп о" о" о" 11= 11= 11 = ¿Г &Р &р
7 — ИД + CuGl (п=12) 9 0" -н 6 "7 1/77 [1;65-1;87] 501 О ^Г "-1 000 О^ ГЧ Оп о" о" о" 11= 11= 11 = рР &Р &Р
6 — ИД + CoGl (п=12) 3 "2 0" -н 9 "6 1/74 [1;6-1;83] 00 |> ^ 355 ото °„ 0„ о" о" о" 11= 11= 11 = рр ор ор
ии стик э 5 — ИД + MnGl (п=12) 0 "2 0" -н 6 "8 1"87 [1/73-2;02] ■-Н ^ <4 080 о м о Оп Оп сэ о" о" о" 11= 11= 11 = ¿р ¿Г ор
д. е О 1 ст1 О 4 — ИД + CaGl (п=12) 8 0" -н "41 1"43 [1;31-1;53] 6 ¿рА
3 — ИД + ликопид (п=12) 4 "2 0" -н 5 "6 1"66 [1;54-1/77] 3 9 0 сэ о" 11 = Ор
2 — ИД без лечения (п=12) 0 "2 0" -н 4 "3 1"37 [1Д8-1Д2] 2 0 0 О^ о" 11 =
1 — интактные (п=12) "31 0" -н 9 "9 <4 [1/72-2Д4] 1
Статистический показатель 0 Ме 7 а л
н к я к
и
«
о К
К
О к к
н ^
ю о
5
о к
О
ад
и К
и к £
Таблица 3. Влияние глюконатов 3d-металлов на фиксацию комплемента в тесте с сенсибилизированными эритроцитами барана
Показатель Контроль (п=12) CaGl (п=12) (п=12) CoGl (п=12) CuGl (п=12) ZnGl (п=12)
Е 450 0;92±0;09 0"95±0"1 1Д3±0Д3 1;89±0Д 0;85±0;09 0;91±0;09
Фиксация комплемента (С%); % 0 3;2±0;3 18"6±1"9 51;3±5Д -8;2±0;9 1"1±0"12
Из указанных в таблицах данных также видно, что глюконаты 3d-металлов превосходят по корректирующему действию препарат сравнения ликопид (p <0,05).
Результаты определения влияния глюконатов 3d-металлов на функциональную активность субкомпонента C1q по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана представлены в табл. 3. Из них видно, что способностью активировать комплемент обладают CoGl и (в меньшей степени) MnGl. Узнавание C1q субкомпонентом активаторов патологического процесса — ключевое событие в запуске каскада реакций классического пути комплемента, приводящего к образованию мембраноатакующего комплекса и уничтожению опознанных клеток.
ВЫВОДЫ
1. Глюконаты 3d-металлов (Mn, Co, Cu, Zn) обладают иммунокорригирующими свойствами: повышают содержание иммуноглобулинов G и их комплексов с субкомпонентом первого фактора комплемента C1q, значительно снижающееся в результате действия циклофосфамида.
2. Глюконаты кобальта и марганца оказывают стимулирующее действие на функциональную активность комплемента по классическому пути, что свидетельствует о различных механизмах иммунокорригиру-ющего действия исследуемых глюконатов металлов и требует дальнейшего изучения.
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.
ЛИТЕРАТУРА
1. Anwer F., Yun S., Nair A. et al. Severe refractory immune thrombocytopenia successfully treated with high-dose pulse Cyclophosphamide and Eltrombopag. Case Reports in Hematology. 2015; 2015: 583451. DOI: 10.1155/2015/583451.
2. Huang R., Zhang J., Liu Y. et al. Immunomodulatory effects of polysaccharopeptide in immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide. Mol. Med. Rep. 2013; 8 (2): 669-675. DOI: 10.3892/mmr.2013.1542.
3. Лебединская Е.А., Тройнич Я.Н., Малыки-на А.Е., Годовалов А.П. Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов периферической крови здоровых доноров под действием циклофосфа-на. Вестн. уральской мед. академ. науки. 2011; 2/2: 3637. [Lebedinskaya E.A., Troynich Ya.N., Malykina A.E., Godovalov A.P. Change in phagocytic activity of neutrophils and monocytes of peripheral blood of healthy donors under the influence of cyclophosphamide. Vestnik ural'skoy meditsinskoy akademicheskoy nauki. 2011; 2/2: 36-37. (In Russ.)]
4. Hodge J.W., Garnett C.T., Farsaci B. et al. Chemotherapy-induced immunogenic modulation of tumor cells enhances killing by cytotoxic T lymphocytes
and is distinct from immunogenic cell death Chemotherapy-induced immunogenic modulation of tumor cells enhances killing by cytotoxic T lymphocytes and is distinct from immunogenic cell death. Int. J. Cancer. 2013; 133 (3): 624-636. DOI: 10.1002/ijc.28070.
5. Князева О. А., Усачёв С.А., Уразаева С.И. Роль соединений глюконовой кислоты с 3d-металлами в коррекции индуцированного иммунодефицита у мышей. Ж. научн. статей «Здоровье и образование в XXI веке». 2016; 18 (4): 88-93. [Knyazeva O.A., Usachev S.A., Urazaeva S.I. The role of gluconic acid compounds with 3d metals in the correction induced immunodeficiency in mice. Zhurnal nauchnykh statey Zdorov'e i obrazovanie v XXI veke. 2016; 18 (4): 88-93. (In Russ.)]
6. Кудрин А.В., Громова О.А. Микроэлементы в иммунологии и онкологии. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2007; 544 с. [Kudrin A.V., Gromova O.A. Mikroelementy v immunologii i onkologii. (Microelements in immunology and oncology.) Moscow: GEOTAR-Media. 2007; 544 р. (In Russ.)]
7. Лебедева С.А., Бабаниязова З.Х., Радионов И.А., Скальный А.А. Металлокомплексы цинка и кобальта в восстановительном лечении гипоксических состояний. Вестн. восстановительн. мед. 2013; (2): 6769. [Lebedeva S.A., Babaniyazova Z.H., Radionov I.A., Skal'nyy A.A. Metal complexes of zinc and cobalt in the rehabilitative treatment of hypoxic conditions. Vestnik vosstanovitel'noy meditsiny. 2013; (2): 67-69. (In Russ.)]
8. Скальная М.Г., Скальный А.В. Микроэлементы: биологическая роль и значение для медицинской практики. Сообщение 1. Медь. Вопр. биол., мед. и фармацевтич. химии. 2015; (1): 15-31. [Skal'naya M.G., Skal'nyy A.V. Trace elements: the biological role and significance for medical practice. Communication 1. Copper. Voprosy biologicheskoy, meditsinskoy i farmatsevticheskoy khimii. 2015; (1): 15-31. (In Russ.)]
9. Calabro A.R., Gazarian D.I., Barile F.A. Effect of metals on p-actin and total protein synthesis in cultured human intestinal epithelial cells. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2011; 63 (1): 47-58. DOI: 10.1016/j. vascn.2010.04.012.
10. Yu S., Wang X.-H., Chen Y.-G. et al. In vitro and in vivo evaluation of effects of Mg-6Zn alloy on tight junction of intestinal epithelial cell. Transactions of Nonferrous Metals Society of China. 2015; 25 (11): 37603766. DOI: 10.1016/S1003-6326(15)64014-6.
11. Саптарова Л.М., Камилов Ф.Х., Князева О.А., Когина Э.Н. Накопление тяжёлых металлов в печени крыс в процессе хронической интоксикации мед-но-цинковой колчеданной рудой. Вестн. Башкирского ун-та. 2017; 22 (1): 90-91. [Saptarova L.M., Kamilov F.Kh., Knyazeva O.A., Kogina E.N. Accumulation ofheavy metals in the liver of rats in the process of chronic intoxication by copper-zinc sulfade ore. VestnikBashkirskogo universiteta. 2017; 22 (1): 90-91. (In Russ.)]
12. Конкина И.Г., Иванов С.П., Князева О.А. и др. Физико-химические свойства и фармакологическая активность глюконатов Mn, Fe, Co, Cu и Zn. Хим.-фар-мацевтич. ж. 2002; 36 (1): 18-21. [Konkina I.G., Ivanov S.P., Knyazeva O.A. et al. Physico-chemical properties and pharmacological activity of Mn, Fe, Co, Cu and Zn gluconates. Khimiko-farmatsevticheskiy zhurnal. 2002; 36 (1): 18-21. (In Russ.)]
13. Tripathi K. Can metal ions be incorporated into drugs? Asian J. Research Chem. 2009; 2 (1): 14-18.
14. Черемных Е.Г., Иванов П.А., Фактор М.И. и др. Новый метод оценки функциональной активности системы комплемента. Мед. иммунол. 2015; 5: 479-488. [Cheremnykh E.G., Ivanov P. A., Faktor M.I. et al. A new method to assess functional activity of serum complement system. Meditsinskaya immunologiya. 2015; 5: 479-488. (In Russ.)] DOI: 10.15789/1563-0625-2015-5-479-488.
