CC BY
78
Химия растительного сырья. 2012. №1. С. 211-214.
УДК 615.322:581.6.011.4
АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И СТРЕССПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА АЛЬФРЕДИИ ПОНИКШЕЙ
© Р.Н. Мустафин1, К.Л. Зеленская2, И.В. Шилова2, Н.И. Суслов2, А.А. Бакибаев1
1 Томский политехническийуниверситет, пр. Ленина, 43, Томск, 634050 (Россия), e-mail: rustamustaf@sibmail.com
2НИИ фармакология СО РАМН, пр. Ленина, 3, Томск, 634028 (Россия)
На моделях гиперкапнической, тканевой гипоксии и острого стресса показано, что экстракт альфредии поникшей обладает антигипоксическим и стресспротекторным действием, увеличивая продолжительность жизни животных при гипоксическом воздействии, препятствуя язвообразованию в желудке и гипертрофии надпочечников и нормализуя поведение животных.
Ключевые слова: гипоксия, стресс, альфредия поникшая.
Введение
Альфредия поникшая (Alfredia cernua (L.) Cass.) - многолетнее травянистое растение, семейства сложноцветных (Asteraceae). Это южносибирский вид, заходящий в Среднюю Азию, реликт третичной флоры [1]. Основанное на данных народной медицины фармакологическое исследование извлечений из альфредии выявило ноотропную, антидепресантную, анксиолитическую (противотревожную), антиневро-тическую и нормотимическую активность [2-4]. При этом было установлено [5], что суммарное извлечение, содержащее весь спектр извлеченных соединений, оказывает более выраженное действие в сравнении с соединениями, фракционированными из экстракта. Извлечения из растения проявляют антиоксидантную активность [6]. Экстракты альфредии содержат следующие группы биологически активных веществ: фла-воноиды (кверцетин, кемпферол, таксифолин, апигенин, лютеолин, изокверцитрин, лютеолин-7-глюкозид, рутин), органические кислоты (бензойная, салициловая, ванилиновая, коричная, кофейная, хлорогеновая, хинная), лигнан арктиин, кумарин эскулетин, каротиноиды, полисахариды, простые фенолы, дубильные вещества, тритерпеновые соединения (а- и p-амирин, моретенол, лупеол), Р-ситостерин, аминокислоты [7].
Цель настоящей работы - исследование антигипоксических свойств и стресспротекторного действия экстракта надземной части альфредии поникшей.
Экспериментальная часть
В работе использовали надземную часть альфредии поникшей, собранной в период цветения на экспериментальном участке Сибирского ботанического сада при ТГУ. Высушенное воздушным способом сырье измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 2 мм.
Экстракт альфредии получали следующим образом: измельченное сырье экстрагировали трижды в соотношении сырье - экстрагент 1 : 14 при нагревании с обратным холодильником на водяной бане в течение 30 мин. В качестве экстрагента использовали 95% этанол. Полученные извлечения объединяли и упаривали в вакууме. Полученный густой экстракт представляет собой вязкую темно-коричневую субстанцию со специфическим запахом.
Фармакологические исследования проводили на белых беспородных мышах-самках, выращенных в конвенциональных условиях в лаборатории биомоделей НИИ фармакологии СО РАМН (Томск). Опыты проводили в осенне-зимний и зимне-весенний период. Эвтаназию производили путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом.
Гиперкапническую гипоксию моделировали путем помещения мышей в индивидуальные гермокамеры объемом 0,5 л, где животные находились до гибели [8]. Фиксировали продолжительность прибывания мышей в гермокамере.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Острую тканевую гипоксию моделировали с использованием натрия нитропруссида после курсового введения экстрактов, в последний раз - за 1 ч до внутрибрюшинного введения натрия нитропруссида в дозе 25 мг/кг [9]. Хроническую тканевую гипоксию создавали путем внутрибрюшинного введения натрия нитропруссида в течение 4 дней однократно в дозе 1 мг/кг, на 5-е сутки в дозе 25 мг/кг [10]. В остром контроле животные получали однократно натрия нитропруссид в дозировке 25 мг/кг и воду очищенную. В хроническом контроле животные получали натрия нитропруссид в дозе 1 мг/кг и воду очищенную; на 5-е сутки - натрия нитропруссид в дозе 25 мг/кг. Фиксировали продолжительность жизни мышей, вес селезенки, тимуса, надпочечников, клеточность органов иммунной системы, количество геморрагических деструкций на слизистой оболочке желудка. В качестве препарата сравнения использовали токоферола ацетат. Экстракт альфредии и токоферола ацетат вводили зондом в желудок в дозе 100 мг/кг в течение 5 дней.
Стресспротекторное действие изучали на модели острого иммобилизационного стресса (стресс-подвешивание по Добрякову) [11], после курсового введения экстракта в дозе 100 мг/кг. Животные группы стресс-контроля получали воду очищенную. Исследовали поведение мышей в открытом поле за 24 чи через 10 мин после иммобилизации [12]. После этого животных забивали, подсчитывали количество язв на слизистой оболочке желудка, определяли вес селезенки, тимуса, надпочечников и рассчитывали весовые коэффициенты органов в пересчете на 20 г массы тела.
Полученные данные обрабатывали статистически. О достоверности различий групповых средних судили методом проверки вероятности нулевой гипотезы с использованием 1 критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при доверительной вероятности > 0,95
Обсуждениерезультатов
Введение экстракта альфредии не влияло на продолжительность жизни мышей при гиперкапнической гипоксии (табл. 1).
Определяющий показатель метода - время нахождения животных в гермокамере до агонального судорожного припадка - не отличался от такового у интактных животных. Однако нами было отмечено, что на фоне перенесенной гипо-ксической травмы у животных, получавших экстракт, сохраняются рефлексы, в частности, ориентировочный рефлекс и условный рефлекс пассивного избегания [13]. Это свидетельствует о том, что прием экстракта повышает резистентность мозга к гипоксиче-скому воздействию. Церебропротекторная активность экстракта альфредии может быть вызвана наличием в растении флавоноидов и других фенольных соединений, антиоксидантная и антигипоксантная активность которых связана с подвижными атомами водорода гидроксигрупп [14, 15].
Из результатов, представленных в таблице 2, видно, что при острой тканевой гипоксии введение экстракта альфредии увеличивало время жизни на 50% в сравнении с гипоксическим контролем (р>0,05). Использование токоферола ацетата приводило к увеличению продолжительности жизни животных на 21,5%. По всей видимости, в условиях данной методики антигипоксическое действие обусловлено влиянием флавоноидов экстракта (кверцетин, кемпферол и др.) на функционирование цитохромов и восстановление окислительного метаболизма
Таблица 2. Влияние экстракта альфредии поникшей
на продолжительность жизни мышей при острой и хронической тканевой гипоксии (Х+ш, п=6)
Таблица 1. Влияние экстракта альфредии поникшей на время жизни в камере гермообъема
Группа наблюдения Время жизни, мин
Гипоксический контроль 50,2 ±3,2
Экстракт на 95% этаноле 48,6 ±4,1
клеток. При моделировании хронической тканевой гипоксии достоверных отличий от данных группы гипоксического контроля не наблюдали.
На фоне хронической тканевой гипоксии применение экстракта альфредии снижало количество язв в желудке в 3,5 раза, введение токоферола ацетата - в 3,7 раза в сравнении с группой хронического гипоксического контроля (табл. 3).
Группа наблюдения, доза Продолжительность жизни, мин
Острая тканевая гипоксия
Острый гипоксический контроль 13,0+0,7
Экстракт альфредии 19,5+2,7*
Токоферола ацетат 15,8+2,6
Хроническая тканевая гипоксия
Хронический гипоксический контроль 31,2+3,2
Экстракт альфредии 35,0+2,7
Токоферола ацетат 31,5+2,4
Примечание. * - различия достоверны в сравнении с контролем (р < 0,05)
Таблица 3. Влияние экстракта альфредии на показатели внутренних органов у мышей на фоне
хронической тканевой гипоксии (Х+ш, п=6)
Группа Массовые коэффициенты, г Язвы Общая клеточность, млн/орган
наблюдения Селезенка Тимус Надпочечник селезенки тимуса крови
Интактный контроль 112,2+7,4 30,7+2,0 4,7+0,3 0 229,3+11,1 105,4+6,7 109,3+9,1*
Контроль -гипоксия 90,4+8,4 22,0+1,4# 5,7+0,2# 41,6+7,9# 152,7+9,4# 70,9+6,7# 83,7+5,4#
Экстракт альфредии 110,4+12,0 25,8+0,7* 4,8+0,3* 11,7+2,8* 232,3+8,6* 112,2+10,4* 119,8+7,0*
Токоферола ацетат 85,5+3,4 25,8+2,2 4,9+0,4 11,3+3,2* 211,8+11,3* 74,3+12,7 104,5+5,7*
Примечание. Различия достоверны в сравнении с интакгным контролем; * - гипоксическим контролем (р < 0,05).
Продолжительная тканевая гипоксия существенно влияла на клеточность органов. В группе хронического гипоксического контроля общая клеточность селезенки (ОКС) и тимуса (ОКТ) уменьшались соответственно на 33,4 и 32,7%, общая клеточность крови (ОКК) снижалась на 23%. Экстракт альфредии нормализовал показатели клеточности органов до уровня интактных животных (р<0,05) (табл. 3).
Использование токоферола ацетата приводило к нормализации ОКС и ОКК, но не влияло на ОКТ.
Для церебральной тканевой гипоксии характерна дистрофия внутренних органов [12], что выразилось у животных групп патологического контроля инволюцией и снижением массы тимуса и селезенки и гипертрофией надпочечников.
Введение экстракта альфредии препятствовало изменениям внутренних органов. Экстракт в меньшей степени влиял на изменение массы селезенки, проявляя защитное действие лишь на уровне тенденции, в то время как масса тимуса и надпочечников нормализовалась до уровня интактного контроля (р < 0,05).
При исследовании стресспротекторной активности введение экстракта альфредии поникшей не оказывало существенного влияния на поведение здоровых мышей в открытом поле до иммобилизации. В группе стресс-контроля отмечали увеличение числа актов груминга (р < 0,05). Это объясняется тем, что введение зонда в желудок само по себе является стрессирующим фактором. Примечательно, что у мышей, получавших экстракт, поведение было идентично интакгным животным.
Стресс оказывал выраженное влияние на организм животных (табл. 4). У мышей группы стресс-контроля наблюдали изъязвление слизистой оболочки желудка, среднее количество язв составило 8,5. Масса селезенки уменьшалась на 42%, тимуса - на 25%, надпочечники увеличивались в 1,5 раза.
Введение экстракта альфредии более чем в 5 раз снижало количество геморрагий в желудке и препятствовало атрофии надпочечников (р<0,05), что указывает на стресспротекторное действие экстракта. Массовые показатели тимуса и селезенки в нашем исследовании остались на уровне значений стресс-контроля.
Изучение ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле на фоне перенесенного острого стресса показало, что смещенная активность, характеризующая в условиях данной методики выраженность стресса, увеличивалась у мышей группы стресс-контроля и нормализовалась у животных, получавших экстракт альфредии.
Активация груминга при стрессе у грызунов хорошо известна. В группе стресс-контроля груминг возрос в 5,7 раза в сравнении с интактными животными (табл. 5). Помимо этого, отмечали нарушение нормальной последовательности груминга, характерной для комфортного поведения (пропуск стадий умывания), что свидетельствует о стрессорной природе груминга у животных данной группы. У мышей, получавших экстракт, количество актов груминга достоверно снижалось, а микроструктура груминга (последовательность чередования стадий груминга) была у них идентичной нормальным животным (характерная для комфортного поведения).
Таблица 4. Влияние экстракта альфредии на 95% этаноле на состояние внутренних органов белых мышей
после перенесенного острого иммобилизационного стресса (Стресс по Добрякову) (М±ш; п=6)
Группа наблюдения Язвы Селезенка, мг Тимус, мг Надпочечники, мг
Интактный контроль 0±0 134,7±12,9 35,2±2,3 2,71±0,2
Стресс-контроль 8,5±1,93# 76,9±6,7# 26,3±2,7# 4,04±0,13#
Экстракт альфредии 1,5±0,96* 91±5,1# 22,4±3,0# 3,02±0,15*
Примечание. Различия достоверны в сравнении * с интактным контролем; * - со стресс-контролем (р < 0,05). Массовые показатели приведены в пересчете на 20-граммовую мышь
Таблица 5. Влияние экстракта альфредии поникшей на ориентировочно-исследовательское поведение мышей после перенесенного острого иммобилизационного стресса (Стресс по Добрякову) (М±ш; п=6)
Группа Пересеченные квадраты Норковый рефлекс Вертикальные стойки Груминг Дефекация
Контроль 44,2±4,7 5,6±1,6 31,2±4,4 0,8±0,2 0,6±0,3
Стресс 50,7±12,7 5,8±2,1 25,0±6,3 4,6±1,0# 0
Экстракт альфредии 62,8±12,2 11,2±3,8 32,5±7,9 1,5±0,6* 0
Примечание. * - различия достоверны в сравнении с интактным контролем; * - в сравнении со стресс-контролем
Выводы
1. Экстракт альфредии поникшей проявляет антигипоксическое и стресспротекторное действие, препятствуя язвообразованию в желудке и гипертрофии надпочечников и в меньшей степени влияя на потери в массе и изменения тимуса и селезенки.
2. Антигипоксическое действие экстракта альфредии проявлялось как в непосредственном влиянии на показатели эксперимента, так и на сохранность рефлексов после перенесенной гипоксии. Повышение резистентности мозга к гипоксическому воздействию может быть связано с флавоноидами и другими полифенолами, входящими в состав экстракта.
3. Экстракт альфредии нормализует поведение животных в открытом поле на фоне перенесенного стресса. Стресспротекторное действие, очевидно, обусловлено адаптогенным действием; вероятно также влияние антидепрессантного и анксиолитического эффектов экстракта, так как известно, что тревога и депрессия являются частыми спутниками дезадаптации.
Список литературы
1. Семенова Г. 400 видов флоры Сибири нуждаются в охране // Наука в Сибири. 2006. 6 июля. №26-27 (25612562) С. 7.
2. Мустафин Р.Н., Шилова И.В., Суслов Н.И. Антидепрессантные и анксиолитические свойства экстракта Alfre-dia cernua (Asteraceae) // Растительные. ресурсы. 2011. Т. 47, №3. С. 130-136.
3. Мустафин Р.Н., Шилова И.В. Суслов Н.И., Кувачева Н.В., Амельченко В.П. Ноотропная активность экстрактов из дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т. 150, №9. С. 302-304.
4. Мустафин Р.Н. Влияние экстракта надземной части альфредии поникшей на выработку условного рефлекса // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии : материалы конфер. Томск, 2007. С. 61-62.
5. Мустафин Р.Н., Суслов Н.И., Шилова И.В., Кувачева Н.В. Влияние экстрактов альфредии поникшей на когнитивные функции мозга // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сборник научных трудов. Пятигорск, 2009. Вып. 64. С. 473-474.
6. Шилова И.В., Кувачева Н.В., Короткова Е.И. Краснов Е.А., Никитина О.В., Лукина А.Н., Некратова Н.А., Пяк А.И. Антиоксидантные свойства биологически активных веществ alfredia cernua и A. nivea (Asteraceae) // Растительные. ресурсы. 200В. Т. 44, №8. С. 114-121.
7. Кувачева Н.В. Фармакогностическая характеристика альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass) и разработка на ее основе лекарственного средства : автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Пятигорск, 2010. 25 с.
В. Бобков Ю.Г. Фармакологическая регуляция состояний дезадаптации. М., 1986. 160 с.
9. Караев А.Я., Ковлер М.А., Авакумов В.М. Противогипоксическое действие карнитина хлорида // Фармакология и токсикология. 1991. Т. 54, №5. С. 42-44.
10. Зеленская К.Л., Пашинский В.Г., Поветьева Т.Н., Нестерова Ю.В. Девясил высокий - адаптоген и антигипок-сант. Томск, 2004. 204 с.
11. Добряков Ю.И. Скриниговый метод оценки антистрессорного действия препаратов // Стресс и адаптация: тезисы Всесоюзного симпозиума. Кишинев, 1978. С. 172.
12. Аксиненко С.Г., Поветьева Т.Н., Провалова Н.В., Зеленская К.Л., Нестерова Ю.В., Горбачева А.В., Попова Е.В., Нагорняк Ю.Г., Шилова И.В., Суслов Н.И. Тканевая гипоксия, вызванная нитропруссидом натрия, и ее коррекция растительными средствами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Прил. 1. С. 49-53.
13. Мустафин Р.Н., Суслов Н.И., Шилова И.В., Кувачева Н.В. Влияние экстрактов альфредии поникшей на поведение, память и работоспособность в эксперименте // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. Т. 73, №1. С. 16-19.
14. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестник РАМН. 1998. №7. С. 43-50.
15. Швец П. Свободные радикалы, этиопатогенез и пути терапевтического воздействия // Словакофарма ревю. 1996. №4. С. 75-77.
Поступило в редакцию 26 января 2012 г.
