CC BY
72
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2010 Биология Вып. 1 (1)
УДК 579.234+579.22
АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ КАТИОННОГО ПЕПТИДА ВАРНЕРИНА ОПОСРЕДОВАНО АКТИВАЦИЕЙ АУТОЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ АТАКУЕМЫХ БАКТЕРИЙ
Л. Б. Филатова, Л. М. Лемкина, Л. И. Кононова, Т. В. Полюдова, В. П. Коробов
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: [email protected]
На бактериях Staphylococcus epidermidis 33 изучены бактериолитические эффекты тритона Х-100, цетавлона и низкомолекулярного амфифильного пептида варнерина. Показано, что наибольшим литическим действием обладают катионный детергент цетавлон и варнерин. Наблюдаемый в присутствии этих соединений бактериолизис обусловлен неспецифической активацией локализованных в клеточных стенках пептидогликангидролаз.
Ключевые слова: низкомолекулярные катионные пептиды, варнерин, бактериолитическое действие, Staphylococcus epidermidis, пептидогликангидролазы, детергентная активность
Введение
Быстрое формирование резистентности и полирезистентности бактерий к антибиотикам определяет необходимость поиска новых соединений этого класса не только среди продуктов химического синтеза, но и функционирующих в природе на всех уровнях организации живых систем. Особое внимание исследователей привлекают убиквитарные низкомолекулярные катионные пептиды (НКП), обеспечивающие эффективную защиту про- и эукариотических организмов от ближайшего бактериального окружения (Кокряков, 1999). Механизмы антибактериального действия НКП во многом определяются высоким положительным зарядом их молекул даже в нейтральных условиях, а также гидрофобными свойствами, благодаря значительному содержанию в них алифатических аминокислот. Выраженная амфифильность способствует проявлению мембранотропных эффектов НКП, важными следствиями которых являются быстрое падение мембранного потенциала и резкое снижение внутриклеточного уровня АТФ ^агсега et а1., 1993). Вместе с тем, обнаружены и литические эффекты этих антибактериальных соединений, которые могут быть связаны с активацией ими аутолизинов клеточных стенок атакуемых бактерий ^егЬаит et а1., 1987). К ауто-литическим ферментам относятся различные гли-кан- и пептидгидролазы, связанные с главным компонентом клеточных стенок бактерий пептидогли-каном ^осктап et а1., 1996; ВаЬа, Schneewind, 1998). Функциональная активность этих ферментов специфически проявляется лишь на конкретных стадиях роста и деления бактериальных клеток
(Vollmer et al., 2008; Bourgeois et al., 2009). Показана и неспецифическая активация аутолизинов внешними факторами, в частности, детергентами, которая приводит к глубоким нарушениям пептидогликано-вого слоя клеточных стенок бактерий и их осмотической гибели (Hinks et al., 1978).
Цель настоящей работы - сравнительный анализ бактериолитических эффектов известных поверхностноактивных соединений тритона Х-100 (октилфе-ноксиполиэтоксиэтанол) и цетавлона (цетилтримети-ламмоний бромид), а также гидрофобного катионного пептида варнерина, выделенного из сред культивирования бактерий Staphylococcus warneri KL-1 (Коробов и др., 2010).
Материалы и методы
Работа проведена на коллекционном штамме Staphylococcus epidermidis 33, полученном в ГНИИСКМБП им. Тарасевича (Москва). Бактериальную культуру выращивали на среде LB до середины логарифмической фазы роста. Бактерии осаждали (10 000 g, 10 мин) на центрифуге 3K30 (Sigma, Германия), дважды отмывали в том же режиме 0.01 М Tris-HCl буфером (рН 7.2) и ресуспендировали в буфере до оптической плотности (OD600), равной 5.0. Для активации неспецифических аутолитических процессов к препаратам бактерий добавляли детергенты тритон Х-100 (конечные концентрации 0.05% и 0.1%), цетавлон (конечные концентрации 0.05% и 0.1%) или низкомолекулярный пептид варнерин (конечная концентрация 8 мг/мл). Инкубацию проб проводили на шейкере Sertomat (Sartorius, Г ермания) при 150 об/мин и 37°С в течение 4 ч с измерением оптической плотности ежечасно на спектрофотометре PD-
© Л. Б. Филатова, Л. М. Лемкина, Л. И. Кононова, Т. В. Полюдова, В. П. Коробов, 2010
32
303 (Ареї, Япония) при 600 нм. По завершению инкубации из всех проб готовили мазки для окрашивания бактерий по методу Грама, используя комплект реагентов “Микро-ГРАМ” и пропись фирмы-изготовителя (НИЦФ, С.-Петербург, Россия). Микро-скопирование окрашенных препаратов проводили на микровизоре проходящего света мVizo-103 (ЛОМО, Россия). Для получения растворимой части бактериальных препаратов аликвоты сред культивирования центрифугировали, как указано выше. В полученных супернатантах изучали содержание и спектр аутоли-тических ферментов, используя ренатурируемый электрофорез в 9% ПААГе (Мапі et аї., 1993), содержащем убитые автоклавированием (0.5 ати, 30 мин) и отмытые дистиллированной водой бактерии & ері-dermidis 33 (1.6 мг сухого веса/мл геля). После окончания процедуры разделения гели отмывали дистиллированной водой в течение 30 мин, помещали в ре-натурирующий буфер (50 мМ MES-NaOH, pH 6.0; тритон Х-100 0.1%) и инкубировали в течение 16 ч при 37°С. После ренатурации гели промывали водой, окрашивали 0.1% метиленовым синим в 0.01% КОН в течение 1 ч и отмывали от красителя водой до проявления прозрачных зон лизиса импрегнированных в гель бактериальных клеток на синем фоне связавших краситель не лизированных бактерий.
Результаты и обсуждение
Динамика лизиса бактериальных суспензий в присутствии детергентов и варнерина представлена на рис. 1. Видно, что наиболее выраженным литиче-ским действием на бактерии epidermidis 33 обла-
дает катионный детергент цетавлон - через 1 ч инкубирования в присутствии 0.1% раствора этого детергента около 90% бактериальных клеток лизиру-ется, а через 4 ч в препаратах лизируются практически все клетки. Снижение концентрации этого сурфактанта до 0.05% значительно сдерживает бакте-риолитический эффект и через 2 ч инкубации лизи-руется лишь половина имеющихся в пробах бактерий. В значительно меньшей степени выражено бак-териолитическое действие нейтрального детергента тритона Х-100. Расчет использованных в этих экспериментах эмульгирующих концентраций обоих поверхностноактивных факторов показал, что мощное литическое действие цетавлона (0.1%) проявляется при 3 ККМ (критическая концентрация мицел-лообразования), в то время как даже при 6 ККМ эффект тритона Х-100 (0.1%) был, по-существу, не сопоставим с бактериолитической активностью цетав-лона. По-видимому, интенсивность бактериолизиса бактерий определяется не только способностью детергентов снижать поверхностное натяжение на границе клеточных поверхностей и среды, но и воздействием на более глубокие структуры бактериальных клеток. Катионные свойства цетавлона, вероятно, способствуют быстрому достижению им отрицательно заряженной плазматической мембраны и ее мицеллизации. Подтверждением этому является выраженный бактериологический эффект катионного гидрофобного пептида варнерина. Как следует из представленных данных, пептид, по существу, имитирует действие цетавлона.
Рис. 1. Динамика лизиса бактерий &. epidermidis 33 под действием низкомолекулярного пептида варнерина и детергентов (тритон Х-100, цетавлон, додецилсульфат натрия):
1 - тритон Х-100 (0.05%); 2 - тритон Х-100 (0.1%); 3 - цетавлон (0.05%); 4 - варнерин (8 мг/мл); 5 - цетавлон (0.1%)
Различия в проявлении эффектов литических факторов хорошо выявляются при микроскопическом изучении бактериальных суспензий через 2 ч инкубации в присутствии детергентов и варнерина (рис. 2). Видно, что действие цетавлона и варнери-на приводит к потере бактериальными клетками
значительных количеств пептидогликана, что выявляется меньшим, нежели в контроле, связыванием красителя. В незначительной степени это характерно и для бактерий, инкубированных с тритоном. Во всех вариантах экспериментов обращает на себя внимание выраженный диспергирующий
3
З4
Л. Б. Филатова, Л. М. Лемкина, Л. И. Кононова, Т. В. Полюдова, В. П. Коробов
эффект детергентов и варнерина, проявляющийся прокрашивающихся генцианвиолетом мощных
относительно равномерным распределением бак- кластеров бактерий в контрольном препарате.
терий на поверхности стекла, в отличие от хорошо
Рис. 2. Препараты бактерий S. epidermidis ЗЗ (окраска по методу Грама), подвергшихся действию низкомолекулярного пептида варнерина и различных детергентов в течение 2 ч (ув. 100*2):
1 - контроль; 2 - варнерин (S мг/мл); 3 - тритон Х-100 (0.05%); 4 - тритон Х-100 (0.1%); 5 - цетавлон (0.05%);
6 - цетавлон (0.1%)
Существенные данные, раскрывающие механизмы действия поверхностноактивных соединений и пептидного антибиотика варнерина, получены при электрофоретическом исследовании супернатантов суспензий бактерий после инкубации с детергентами и пептидом. Как видно из представленной на рис. З энзинограммы, наибольшая активация ауто-лизинов бактерий наблюдается под влиянием цетавлона и варнерина. При анализе состава обнаруженных в лизатах пептидогликангидролаз, обращает на себя внимание наличие в их спектрах как одинаковых, так и активируемых в значительной степени цетавлоном (“низкомолекулярные”) и варнерином (“высокомолекулярные”) фракций. Эти данные во многом раскрывают механизмы литических превращений бактерий (см. рис. 1) в присутствии использованных детергентов и варнерина, в основе которых, на наш взгляд, лежит неспецифическая активация локализованных в клеточных стенках бактерий гидролаз за счёт их “освобождения” из анионных сайтов связывания (Zoll et al., 2010).
1
2 З
Рис. 3. Энзимограмма (негативное изображение) аутолитических ферментов бактерий & epidermidis 33, активирующихся при действии низкомолекулярного пептида варнерина и детергентов:
1 - цетавлон (0.1%); 2 - тритон Х-100 (0.1%); 3 -варнерин (8 мг/мл)
Таким образом, результаты предпринятого анализа бактериолитических эффектов цетавлона и варнерина позволяют констатировать наличие у пептида детергентной активности, как важной составляющей арсенала его антибактериального действия.
Работа поддержана грантами Президента РФ «Ведущие научные школы» НШ-64403.2010.4; Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края № 10-04-96086-р_урал_а; Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Междисциплинарного проекта фундаментальных исследований, выполняемых в учреждениях УрО РАН.
Библиографический список
Кокряков, В.Н. Биология антибиотиков микробного происхождения / В.Н. Коряков // СПб.: Наука, 1999. 164 с.
Коробов, В.П. Выделение и характеристика нового низкомолекулярного антибактериального пептида семейства лантибиотиков / В.П. Коробов, Л.М. Лемкина, Т.В. Полюдова, В.К. Акименко // Микробиология. 2010. Т. 79, № 2. С. 228-238. Baba, T. Targeting of muralytic enzymes to the cell division site of Gram-positive bacteria: repeat domains direct autolysin to the equatorial surface ring of Staphylococcus aureus / T. Baba, O. Schneewind // EMBO J. 1998. Vol. 17. P. 4639-4646.
Bierbaum, G. Autolytic system of Staphylococcus simu-lans 22: influence of cationic peptides on activity of N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase / G. Bierbaum, H.G. Sahl // J. Bacteriol. 1987. Vol. 169. P. 5452-5458.
Bourgeois, I. Characterization of AtlL, a bifunctional autolysin of Staphylococcus lugdunensis with N-acetylglucosaminidase and N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase activities / I. Bourgeois, E. Camiade, R. Biswas [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. 2009. Vol. 290. P. 105-113.
Garcera, M.J. In vitro pore-forming activity of the lan-tibiotic nisin. Role of protonmotive force and lipid composition / M.J. Garcera, M.G. Elferink, A.J. Driessen, W.N. Konings // Eur. J. Biochem. 1993. Vol. 12. P. 417-422.
Heilmann, C. Identification and characterization of a novel autolysin (Aae) with adhesive properties from Staphylococcus epidermidis / C. Heilmann, G. Thumm, G.S. Chhatwal [et al.] // Microbiology. 2003. Vol. 149. P. 2769-2778.
Hinks, E.T. Effects of temperature on the autolytic enzyme system of Streptococcus faecalis / E.T. Hinks, L. Daneo-Moore, S. Braverman // J. Bacteriol. 1978. Vol. 136. P. 491-496.
Mani, N. Isolation and characterization of autolysis-defective mutants of Staphylococcus ureus created by Tn917-lacZ mutagenesis / N. Mani, P. Tobin, R. K. Jayaswal // J. Bacteriol. 1993. Vol. 175. P. 14931499.
Shockman, G.D. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis / G.D. Shockman, L. Daneo-Moore, R. Kariyama, O. Massidda // Microb. Drug. Resist. 1996. Vol. 2. P. 95-98.
Zoll, S. Structural basis of cell wall cleavage by a staphylococcal autolysin / S. Zoll, B. Patzold, M. Schlag [et al.] // PLoS Pathog. 2010. Vol. 6: e1000807.
Vollmer, W. Bacterial peptidoglycan(murein) hydrolases / W. Vollmer, B. Joris, P. Charlier, S. Foster // FEMS Microbiol. Rev. 2008. Vol. 32. P. 259-286.
Поступила в редакцию 30.03.2010
Antibacterial effect of peptide warnerin mediated by activation of autolytic systems in attacked bacteria
L. B. Filatova, engineer
L. M. Lemkina, candidate of medicine, senior scientist L. I. Kononova, engineer
Т. V. Poludova, candidate of biology, senior scientist
V. P. Korobov, candidate of medicine, associate professor, head of laboratory
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected]; (342)2446712
Bacteriolytic effects of Triton X-100, cetavlon, and low-molecular weight amphiphilic peptide warnerin were examined using bacteria S. epidermidis 33. It was demonstrated that highest lytic effect possessed cationic detergent cetavlon and warnerin. Bacteriolysis being observed in presence of those compounds was conditioned by non-specific activation of peptidoglycan hydrolases localized in cell walls.
Key words: low molecular weight cationic peptides; warnerin; bacteriolytic action; Staphylococcus epidermidis; peptidoglycan hydrolases; detergent activity.
Филатова Любовь Борисовна, инженер
Лемкина Лариса Марковна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Кононова Людмила Ивановна, инженер
Полюдова Татьяна Вячеславовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Коробов Владимир Павлович, кандидат медицинских наук, доцент, заведующий лабораторией ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
