CC BY
67
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ
© РАЗУВАЕВА Я.Г., НИКОЛАЕВ С.М., ЗАНДАНОВ А.О., ЦЫРЕМПИ-ЛОВ С.В., ГУЛЕВИЧ А.А., АЮШЕЕВА В.В.
АНТИАМНЕСТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСНЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ ИЗ АРСЕНАЛА ТРАДИЦИОННОЙ МЕДИЦИНЫ
Я.Г. Разуваева, С.М. Николаев, А.О. Занданов, С.В. Цыремпилов, А. А. Гулевич, В.В. Аюшеева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, директор -д.б.н., проф. Л.Л. Убугунов; Бурятский государственный университет, ректор
- член.-корр., С.В. Калмыков; Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор - д.м.н., проф. В.В. Шпрах.
Резюме. В опытах на белых крысах линии Wistar установлено антиамне-стическое действие комплексных растительных средств - ноофита и нейрофита на фоне амнезии, вызванной максимальным электросудорожным шоком и гипоксией. Показано, что исследуемые фитосборы удлиняют латентный период захода животных в темный отсек установки в тесте условного рефлекса пассивного избегания во все сроки исследований (через 1 час, 24 часа и 7 суток). Реализации ноотропного действия исследуемых средств способствует их мембраностабилизирующая и антиоксидантная активность.
Ключевые слова: комплексные растительные средства нейрофит, но-офит, антиамнестическое действие, мембраностабилизирующая и антиоксидантная активность.
Разуваева Янина Геннадьевна - к.б. н., научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН (г. Улан-Удэ); е-mail: tatur75@ mail.ru, тел. (3012)433713.
Николаев Сергей Матвеевич - д. м. н., проф., зав. лабораторией экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН (г. Улан-Удэ); e-mail: smnikolaev@ mail.ru), тел. (3012)433463.
Занданов Александр Октябревич - к. м. н., доц., зав. кафедрой терапии медицинского факультета БГУ (г. Улан-Удэ); тел. (3012)445503).
Профилактика нарушений высших интегративных функций мозга, процессов обучения и памяти представляет актуальную проблему медицинской науки и практического здравоохранения. Это становится очевидным в связи с ростом цереброваскулярных заболеваний, черепно-мозговых травм, увеличением неблагоприятных социальных и экологических факторов, приводящих к стрессу, хроническому утомлению и утрате умственной работоспособности населения [2, 6]. В связи с этим одной из главных задач данного направления является разработка и внедрение новых профилактических и лечебновосстановительных технологий при начальных формах нарушений высших функций мозга. В медикаментозном лечении нарушений когнитивных функций основное значение получили ноотропы. Однако, несмотря на разнообразие средств с ноотропным типом действия наблюдаются их недостаточная эффективность, токсическое воздействие и побочные реакции.
Особый интерес в лечении функциональных нарушений нервной системы представляют лекарственные средства растительного происхождения [1, 9], обладающие выраженным фармакотерапевтическим действием, широким спектром биологической активности и низкой токсичностью. Так, в народной и традиционной медицине для лечения заболеваний нервной системы издавна применяются такие растения, как шлемник байкальский, валериана лекар-
ственная, пион уклоняющийся, женьшень, аралия маньчжурская, лимонник китайский и другие виды [4].
В связи с этим, целью нашего исследования явилось определение антиам-нестического действия двух многокомпонентных растительных сборов, разработанных на основе тибетских прописей, условно названных нейрофит и ноофит.
В состав нейрофита входят: корни Valeriana officinalis L., Paeonia anomala L., Scutellaria baicalensis Georgi, трава Leonurus cardiaca L., плоды Rosa и Crataegus. В состав ноофита - корни Scutellaria baicalensis Georgi, Valeriana officinalis L., Phaponticum carthamoides WILLD, трава Mentha x piperita L., Polygonum aviculare L., Achillea millefolium L. и листья Urtica dioica L.
Материалы и методы
Исследования in vivo проводились на 73 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой тела 180-200 г, in vitro - с использованием суспензии желточных липопротеинов и эритроцитов донорской крови человека.
Исследования на животных проводились в два этапа. В обеих сериях эксперимента крысы были разделены на 4 группы. Первую и вторую опытные группы составляли животные, которым соответственно вводили per os но-офит и нейрофит в форме отвара, приготовленного по ГФ СССР XI издания (1990), в объеме 10 мл/кг массы животного в течение пяти дней до начала экспериментов. Животным интактных и контрольных групп вводили воду очищенную в эквивалентном объеме по аналогичной схеме. В обеих сериях эксперимента у животных контрольной и опытных групп моделировали амнезию [3].
Влияние исследуемых лекарственных средств на нарушения когнитивных функций у белых крыс изучали по сохранности условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) в условиях моделирования амнезии, которую вызывали воздействием максимального электросудорожного шока и нормобарической гипоксией с гиперкапнией [3]. Выработку УРПИ проводили в двухсекционной камере, состоящей из светлого («безопасного») и темного
(«опасного») отсеков, соединенных дверцей. Во время обучения крысу помещали в светлый отсек камеры. Через некоторое время после начала сеанса обучения, называемое латентным периодом, все животные предпочитали темный отсек (норковый рефлекс) и проводили в нем большую часть времени. При повторном помещении крыс в экспериментальную установку после захода в темный отсек, животные подвергались двухкратному электрокож-ному раздражению переменным током (20-30 мА , 1с, 50 Гц), силу которого подбирали индивидуально. В первой серии эксперимента амнезию УРПИ вызывали нанесением максимального электросудорожного шока (МЭШ) через электроды, наложенные на поверхность ушных раковин (10-100 мА, 200-500 мсек.), непосредственно после выработки условного рефлекса [3]. Во второй серии экспериментов амнезию УРПИ вызывали острой нормобарической гипоксией с гиперкапнией, для чего животных после выработки рефлекса помещали в герметический сосуд емкостью 1 литр, где они находились до появления судорог и первого агонального дыхания [3]. У животных интактной группы нарушение УРПИ не вызывали. В обоих экспериментах регистрировали время перехода в темную половину установки (латентный период) до обучения и через 1 час, 24 часа и 7 суток после нанесения амнезирующего фактора.
Кинетику перекисного окисления липидов оценивали с помощью метода индуцированной хемилюминесценции [7] с использованием в качестве субстрата окисления суспензии желточных липопротеинов. В качестве индуктора хемилюминесценции использовали Бе804, ее интенсивность измерялась на хемилюминометре “РХЬ-01” (Россия). Концентрации ноофита и нейрофита в инкубационной среде составляли от 0,01 до 0,3 г/л. Для оценки влияния изучаемых средств на кинетику индуцированной хемилюминесценции определяли амплитуду «быстрой вспышки», скорость возрастания интенсивности хемилюминесценции на начальной стадии «медленной вспышки», а также проводили расчет антиокислительной активности.
Мембраностабилизирующую активность ноофита и нейрофита определяли in vitro по степени торможения перекисного и осмотического гемолиза отмытых эритроцитов человека [8]. Инкубационная среда состояла из донорских отмытых эритроцитов и фосфатного буфера (рН=7,4). Перекисный гемолиз вызывали добавлением в инкубационную среду реактива «Фентона»: FeS04x7Н20 - 0,02 мг/мл; Н202 - 0,02 мг/мл (в пересчете на 100% раствор перекиси). Компоненты, входящие в состав реактива «Фентона», были использованы в минимальных концентрациях, вызывающих полный лизис 1% суспензии эритроцитов. Для получения осмотического гемолиза к суспензии эритроцитов добавляли равный объем дистиллированной воды. Инкубацию проводили в течение двух часов при комнатной температуре. Степень гемолиза измеряли на 1% суспензии отмытых человеческих эритроцитов по поглощению надосадочной жидкости на спектрофотометре при длине волны 540 нм. Действие исследуемых средств на гемолиз оценивали по сравнению с контролем (без его добавления в инкубационную среду). Исследования проводили в трехкратной повторности.
При статистической обработке экспериментальных данных вычислялась средняя арифметическая (М), ошибка средней арифметической (±m), непараметрический критерий Манна-Уитни (t) и достоверность различий (Р). Различие считали достоверным при вероятности 95% (р £ 0,05) [10].
Результаты и обсуждение Наиболее часто используемым стандартным методическим приемом для моделирования нарушения когнитивных функций является применение в качестве амнезирующего воздействия максимального электросудорожного шока (МЭШ). Известно, что подобное травмирующее воздействие на мозг животных оказывает мощный амнезирующий эффект, вызывая резкое ухудшение воспроизведения рефлекса [3].
В результате проведенных исследований установлено, что курсовое введение нейрофита и ноофита улучшает у животных выработку условного рефлекса, на фоне амнезии, вызванной МЭШ что проявляется в увеличении ла-
тентного времени захода крыс в темный отсек экспериментальной установки н
через один час после тестирования (рис.1) по сравнению с контролем. При
проверке памятного следа результаты тестирования показали, что введение
животным ноофита и нейрофита вызывает у крыс более прочное сохранение и
рефлекса. Так, латентный период у животных этих групп через 24 часа после выработки рефлекса увеличивается на 27 и 23 %, а на 7 сутки - в 2,9 и 2,7 раза сортветственно по сравнению с таковым у животных контрольной группы (рис. 1).
2oo
loo
й 5o
o
До обучения Через 1 час Через 24 часа Через 7 суток
И Интактная группа (вода), n=8 В Контрольная группа (МЭШ+вода), п=9 11 Опытная группа 1 (МЭШ+ноофит), п=9 □ Опытная группа 2 (МЭШ+ нейрофит), п =9
Рис. 1. Влияние ноофита и нейрофита на сохранение условного рефлекса пассивного избегания у белых крыс на фоне амнезии, вызванной максимальным электросудорожным шоком.
Примечание: здесь и далее: * - различия статистически значимы по сравнению с данными у животных интактной группы; ** - по сравнению с данными у животных контрольной группы прир<0,05; п - количество животных в группе.
Известно, что ноотропные препараты обладают довольно высокой активностью в условиях различного вида гипоксии. Именно наличие противоги-поксической активности, по мнению некоторых авторов [1], в значительной степени определяет нейропротекторные свойства отдельных ноотропных
н
препаратов. Для препаратов с ноотропным видом деятельности характерна и антиамнестическая активность в условиях амнезии, вызванной гипоксией [1, 9]. Результаты исследований показали, что исследуемые фитосборы в условиях нормобарической гипоксии с гиперкапнией обладают антиамнестиче-
ским эффектом, что проявляется в выработке условного рефлекса и сохран-<и
ности памятного следа на протяжении всех сроков эксперимента по сравнению с контролем (рис. 2).
250
200
150
100
50
0
* * **
* *
* *
**
До обучения Через 1 час Через 24 часа Через 7 суток
Ш Интактная группа (вода), п=8 В Контрольная группа (Гипоксия+вода), п=10 II Опытная группа 1 (Гипоксия+ноофит), п=10 □ Опытная группа 2 (Гипоксия +нейрофит), п=10
Рис. 2. Влияние ноофита и нейрофита на сохранение условного рефлекса пассивного избегания у белых крыс на фоне амнезии, вызванной гипоксией с гиперкапнией.
Известно, что в основе органических поражений головного мозга и связанных с ними нарушений высших интегративных функций лежат процессы свободнорадикального окисления липидов [5]. Учитывая, что растения, входящие в состав исследуемых сборов содержат полифенольные соединения, которые являются ловушками свободных радикалов, защищают организм от оксидантного стресса, блокируют процессы перекисного окисления липидов, а также меняют структурные характеристики биологических мембран [11, 12], можно полагать, что базисным механизмом нейропротекторного дейст-
вия исследуемых средств являются антиоксидантное и мембраностабилизирующее действие.
Так, при исследовании влияния фитосборов ноофит и нейрофит на кинети-
17 2+-
ку Fe индуцированной хемилюминесценции установлено, что исследуемые средства способствуют монотонному снижению скорости нарастания «медленной вспышки» (табл.1). При этом концентрация половинного ингибирования, вычисляемая по tg угла наклона «медленной вспышки», для ноофита составляет 0,034 г/л, для нейрофита - 0,037 г/л , и их антиокислительная активность - соответственно 29,4 и 27,0 (г/л)-1 (табл. 1).
Таблица 1
Влияние ноофита и нейрофита на показатели Fe2 +-- индуцированной
хемилюминесценции
In vitro по степени торможения перекисного и осмотического гемолиза определяли мембраностабилизирующую активность исследуемых растительных средств. При исследовании влияния отваров фитосборов - ноофита и нейрофита на гемолиз эритроцитов, выявлено, что максимальный мембраностабилизирующий эффект при осмотическом гемолизе составляет 67 и 46 % соответственно и при гемолизе, вызванном реактивом Фентона, - 70 и 57 % соответственно (рис.3).
Рис. 3. Влияние ноофита и нейрофита на степень ингибирования осмотического и перекисного гемолиза.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемые растительные средства - фитосборы нейрофит и ноофит обладают анти-амнестическим действием, устраняя амнезирующее влияние электрошока и гипоксии, о чем свидетельствует удлинение латентного период захода животных в темный отсек установки в тесте УРПИ во все сроки исследований по сравнению с контролем. Реализации ноотропного действия исследуемых
средств способствует их мембраностабилизирующая и антиоксидантная активность.
ANTI-AMNESIA EFFECT OF COMPLEX PLANT MEANS FROM THE TRADITIONAL MEDICINE
YA.G. Razuvaeva, S.M. Nikolaev, A.O. Zandanov, S.V. Tsyrempilov, A.A. Gulevich, A.A. Ausheeva Institute of General and Experimental Biology SB RAS, Buryat State University,
Ulan-Ude, Irkutsk State Institute of Postgraduate Medical Education, Irkutsk.
Abstract. We determined anti-amnesia effect of complex plant means, neophyt and neurophyt, on amnesia induced by maximal electroconvulsive shock and hypoxia in white rats of Wistar line. It was shown that in all periods of study(after 1 hour, 24 hours and 7 days) phyto-means prolong the latent period of animals entering into the dark module of the device during the conditioned reflex test of passive avoidance. Membrane stabilizing and anti-oxidant activities contribute causes the nootropic effect of the means.
Key words: complex plant means neurophyt, noophyt, anti-amnesia effect, membrane stabilizing and antioxidant activity.
Литература
1. Арушанян Э.Б. Ноотропные свойства препаратов гинго билобо // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 71, № 4. - С. 3763.
2. Воробьева О.В. Цереброваскулярная болезнь: возможности ноотропной терапии // Фарматека. - 2005. - № 9(104). - С. 61-65.
3. Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - С. 153-161.
4. Гольдберг А.Д., Дыгай А.М. Литвиненко В.И. и др. Шлемник байкальский. Фитохимия и фармакологические свойства. - Томск, 1994. - 222 с.
5. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Оксидантный стресс - общий механизм повреждения при заболеваниях нервной системы // Журн. неврологии и психиатрии им С.С. Корсакова. - 1996. - Т. 96, № 2. - С. 111-114.
6. Захаров В.В. Когнитивные нарушения в неврологической практике // Фармация. - 2006. - № 7 (122). - С. 37-43.
7. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О. и др. Оценка антиокси-дантной активности плазмы крови с применением желчных протеидов // Лаб.дело. - 1998. - № 5. - С. 59 -62.
8. Ковалев И.Е., Данилова Н.П., Андронати С.А. и др. Влияние эномела-нина на гемолиз эритроцитов, вызываемый свободнорадикальными реакциями и другими факторами // Фармакология и токсикология. - 1986. - № 4.
- С. 89-91.
9. Куркин В.А., Дубищев А.В., Ежков В.Н. и др. Ноотропная активность некоторых фитопрепаратов и фенилпропаноидов // Растительные ресурсы. -2007. - Т. 43, Вып. 2. - С. 76-88.
10. Сергиенко В.И. Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. - М., 2006. -256с.
11. Cook N.C., Jamman S. Flavonoids: chemistry, metabolism, cardioprotective, effects and dietary sources // J. Natur. Biochem. - 1996. - Vol. 7. - P. 66-76.
12. Packer L., Rimbach G., Virgili F. Antioxydant activity and biologic properties of a procyanidin - rich extract from pine (Pinus maritime) bark, pycnogenol / Free. Radic biol. Med. - 1999. - Vol. 27. - P. 704-724.
