CC BY
22
Вакцинопрофилактика
Анти-адгезивная стратегия в разработке комплексных противодифтерийных вакцин как перспективная мера снижения циркуляции Corynebacterium diphtheriae среди населения
И. В. Елисеева, Е. М. Бабич, Л. А. Ждамарова, В. И. Белозерский, Е. Ю. Исаенко, С. А. Колпак
Государственное учреждение «Институт микробиологии и иммунологии
им. И. И. Мечникова Национальной академии медицинских наук Украины», Харьков, Украина
Исследование посвящено разработке новых бактериальных дифтерийных вакцин, направленных на предупреждение колонизации слизистых оболочек, формирование бактерионосительства и способствующих снижению циркуляции C. diphtheriaе среди населения. В качестве основы кандидат-вакцины предлагается дифтерийный бактериальный антигенный препарат, полученный с помощью электро-магнитного излучения сверхвысокой частоты из культуры C. diphtheriaе, var. gravis, tox +.
Ключевые слова: дифтерийные вакцины, C. diphtheriaе, дифтерийные бактериальные антигены, адгезия, электро-магнитное излучение сверхвысокой частоты
Anti-adhesive Strategy in Development of Combined Antidiphtheritic Vaccine as a Perspective Preventive Measure of Corynebacteria diphtheriae Circulation Among the Population
I. V. Yelyseyeva, Ye. M. Babich, L. A. Zhdamarova, V I. Belozersky, Ye. Yu. Isayenko, S. A. Kolpak
State Institution «Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of National Academy of Medical Science of Ukraine», Kharkov, Ukraine
A study is devoted to the development of new bacterial diphtheria vaccines aimed at prevention adhesion of microbial cells to host's pharyngeal epithelial cells and thus limit colonization of mucous membranes, bacteria carrier state formation and promoted to C. diphtherias circulation decrease among the population. As a base of the candidate-vaccine we suggest the diphtheria bacterial antigenic preparation obtained by use of electro-magnetic radiation of ultrahigh frequency from a culture of C. diphtherias, var. gravis, tox +.
Keywords: diphtheria vaccines, C. diphtherias, diphtheria bacterial antigens, adhesion, electromagnetic radiation of microwave frequency
Контактная информация: Елисеева Ирина Витальевна — ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики капельных инфекций, Государственное учреждение «Институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова Национальной академии медицинских Украины»; ул. Пушкинская, 14 — 16, г. Харьков, Украина, 61057; [email protected]
Yelyseyeva Iryna Vitaliyevna, senior researcher, leading scientific associate of respiratory infection prevention laboratory, State Institution «Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of National Academy of Medical Science of Ukraine»; Pushkinskaya Str., 14/1 6, Kharkov, Ukraine, 61057; [email protected]
УДК 616.921:579.871
Эпидемическое возвращение дифтерии в странах Восточной Европы в 1990-х годах стало свидетельством постоянной угрозы этого, как уже считалось к тому времени, редкого заболевания. Медицинское сообщество вынуждено было признать, что СогупеЬа^епит С1рЬ-Жепае все еще является глобальным медицинским вызовом, который требует пристального внимания и разработки новых подходов для борьбы с инфекцией [1—4].
Основой эпидемического процесса дифтерии является циркуляция инфекции среди населения посредством бактерионосительства и легких, не диагностированных форм заболевания, которые определяют сохранение резервуара инфекции в человеческой популяции [5]. В межэпидемический период спорадические случаи генерализованных заболеваний, при своевременной диагностике, не представляют собою масштабной угрозы инфицирования большого количества людей. Выявленных в очагах дифтерии бактерионосителей санируют антибиотиками, однако эффективные методы лечения состояния стойкого но-сительства отсуствуют. Таким образом, на практике латентная передача дифтерийной инфекции остается, в
основном, за рамками противоэпидемических и профилактических мероприятий.
Официальной доктриной ВОЗ по вопросу специфической иммунопрофилактики дифтерии является предупреждение тяжелых, токсических форм заболевания путем создания коллективного иммунитета с не менее чем 90-процентным охватом населения 3-кратной иммунизацией дифтерийным анатоксином [6].
Текущее десятилетие — 2011—2020 гг. — Всемирная организация здравоохранения объявила десятилетием вакцин. Глобальный план действия по отношению к вакцинам (ГПДВ), одобренный 194 странами-членами Всемирной ассамблеи здравоохранения в мае 2012 года, является рамочным документом для предупреждения к 2020 году миллионов случаев смерти от инфекций, управляемых средствами специфической профилактики. ГПДВ направлен на укрепление плановой иммунизации и предусматривает следующие задачи: (1) достижение целевых показателей по охвату вакцинацией; (2) наращивание темпов борьбы с инфекциями, которые можно предотвратить с помощью вакцин; (3) внедрение новых и улучшеных вак-
цин; (4) внедрение разработок для получения вакцин и технологий следующего поколения [6].
Общепринятым маркером защищенности человека от заболевания дифтерией является уровень антитоксина в крови. Однако, как известно, поствакцинальный антитоксический иммунитет не предотвращает колонизацию ко-ринебактериями дифтерии слизистых оболочек и состояние бактерионосительства С. (ЛрЬ^епае [5, 7]. В существующих вакцинах против дифтерии не задействован спектр бактериальных антигенов, индуцирующих интегральный ответ иммунной системы организма на совокупный патогенный потенциал возбудителя, направленный на эффективное проникновение патогена в макроорганизм. Таким образом, искусственный активный антитоксический иммунитет можно считать необходимым, но не достаточным условием защищенности от дифтерии. Подтверждением этому может служить как важнейшая особенность последней эпидемии дифтерии — возникновение и развитие ее на фоне высоких показателей приви-тости и иммунности, так и существенная доля привитых лиц среди заболевших дифтерией в разных странах и в предшествующие годы [1, 3, 4]. Закономерно возникает вопрос о необходимости разработки новых средств иммунопрофилактики дифтерии на основе изучения бактериальных антигенов, ответственных за формирование резистентности организма к инвазии патогена [5, 7].
Для многих патогенных бактерий инфекция инициируется только после адгезии микроорганизма к поверхности клетки хозяина, и, чтобы вызвать инфекционный процесс, возбудители, используя адгезины, должны стабильно колонизировать поверхность слизистых [8]. Если воспрепятствовать адгезии бактерий, то можно предотвратить и соответствующую инфекцию. Этот подход формирует основу нескольких анти-адгезивных стратегий, котрые были предложены для предупреждения разнообразных бактериальных инфекций [9, 10].
Бактериальное прикрепление можно подавлять, вмешиваясь в биосинтез адгезинов, их сборку или в сборку рецепторов хозяина — молекул распознавания адгези-нов, а также используя растворимые молекулы или сконструированные микробы, пробиотики, пищевые добавки, которые способны к конкурентному замещению адгезина от хозяина или рецептора хозяина от адгезина. Поверхностные эпитопы связывания адгезинов с рецепторами можно блокировать также антителами против бактериальных адгезинов посредством вакцинации адгезинами или их аналогами [11, 12].
Хозяина можно прямо или пассивно иммунизировать, используя бактериальный адгезин, мульти-субъединичные адгезивные органеллы, такие как фимбрии, фрагмент им-муногенного пептида, основанный или на индиидуальном адгезине, или на консенсусе производных из группы адгезинов, а также ДНК-вакцины, кодирующие адгезин или его часть [11 — 13]. Но если адгезивные факторы грам-от-рицательных микрорганизмов изучены достаточно глубо-
ко, для грам-положительных микробов эта сфера стремительно развивается [14].
Конструирование специфических противодифтерийных профилактических препаратов, которые препятствовали бы адгезии микробных клеток к фарингеальным эпителиальным клеткам хозяина может стать эффективным средством в ограничении колонизации слизистых оболочек и уменьшения циркуляции C. diphtheriae среди населения и новой стратегией разработки противодифтерийных вакцин [5, 7, 14].
Целью первого этапа наших экспериментов стало изучение возможности получения антигенной субстанции для бактериальной дифтерийной кандидат-вакцины с повышенными адгезивными свойствами из культуры C. diphtheriae.
Материалы и методы исследования
Адгезию C. diphtheriae исследовали известным способом [15]. Объектом исследования был взят музейный штамм C. diphtheriae, var. gravis to x + № 255. Адгезивные свойства возбудителя дифтерии усиливали с помощью воздействия электромагнитного облучения сверхвысокой частоты (ЭМИ СВЧ) [16].
Суточную культуру C.diphtheriae № 255, выращенную на 10 %-ом сыворотчном агаре, смывали стерильным физиологическим раствором (рН 7,2) и готовили густую суспензию, оптическая плотность которой по оптическому стандрту ГИСК им. Л. А. Тарасевича составила 14 млрд. м.т./мл. Из нее готовили рабочую суспензию C. diphtheriae с концентрацией 109 м.т./мл, которую разделили на равные по объему образцы — опыт и контроль.
Для повышения адгезивности культуры C. diphtheriae использовали узкополосное ЭМИ СВЧ при помощи электромагнитного генератора Г4-142, предоставленного ГУ «Институт радиофизики и электроники им. А. Я. Усикова Национальной академии наук Украины».
В пробирки № 1 (опыт) и № 2 (контроль) вносили по 0,5 мл взвеси формалинизированных эритроцитов человека и, соответственно, облученной и не облученной культуры C.diphtheriae в концентрации 109 м.т./мл. Инкубировали смеси при температуре 37°С в течение 30 минут, время от времени встряхивая.
Готовили мазки, высушивали, фиксировали фиксатором Майн-Грюнвальд, окрашивали по Романовскому-Гим-за и изучали активность адгезии в световом микроскопе. Всего было сделано 6 мазков облученной культуры и 6 контрольных мазков, в каждом из которых просматривали не менее 50 эритроцитов. Подсчитывали количество эритроцитов, несущих прикрепленные бактерии, и количество бактерий, прикрепившихся к каждому из них. Высчитывали следующие показатели: средний показатель адгезии (СПА) — среднее количество микробов, которые прикрепились к одному эритроциту, коэффициент адгезии (КА) — процент эритроцитов, которые имели на своей поверхности прикрепленные микробы, индекс адгезив-
Таблица 1. Показатели адгезии тест-штамма СЛ1рЬгЬепае после его облучения ЭМИ СВЧ
СПА КА ИАМ
опыт контроль опыт контроль опыт контроль
3,2 ± 0,06 2,2 ± 0,06 82 ± 0,4 72 ± 0,5 4,0 ± 0,06 3,0 ± 0,07
Таблица 2. Результаты биохимического анализа исследуемых образцов антигенных субстанций С. diphtheriae
Антигенные субстанции Концентрация белка, мг/мл Липотейхоевые кислоты, мкг/мл
Глицерин тейхоевая Рибит тейхоевая Маннит тейхоевая
СНо 3,6 ± 0,06 61,8 ± 0,4 33,6 ± 0,3 19,5 ± 0,3
СНк 2,7 ± 0,06 57,8 ± 0,4 29,9 ± 0,3 15,44 ± 0,2
Таблица 3. Показатели адгезии тест-штамма С. diphtheriaе к эритроцитам человека, предварительно выдержанным с исследуемыми антигенными субстанциями
№№ пп СПА КА ИАМ
СНо СНк СНо СНк СНо СНк
1* 1,7 ± 0,04 3,4 ± 0,04 68,7 ± 0,9 86,3 ± 0,2 2,3 ± 0,03 4,0 ± 0,06
2* 1,1 ± 0,02 2,6 ± 0,05 59 ± 0,5 75,4 ± 0,2 1,9 ± 0,01 3,5 ± 0,07
К 3,2 ± 0,06 2,2 ± 0,06 82 ± 0,4 72 ± 0,5 4,0 ± 0,06 3,0 ± 0,07
1 * — оптическая плотность исходной микробной суспензии 1 млрд. м.т./мл по оптическому стандарту ГИСК им. Л. А. Тарасевича; 2* — оптическая плотность 14 млрд. м.т./мл; К — контроль
ности микроорганизмов (ИАМ) — отношение СПА до КА умноженное на 100.
Результат оценивали, сравнивая средние показатели адгезии в опыте и в контроле по следующим критериям: ИАМ ^ 1,75 — отсутствие адгезивности; 1,76 ^ 1АМ ^ ^ 2,5 — низкая степень адгезивности; 2,5 ^ 1АМ ^ 4,0 — средняя адгезивность; 1АМ > 4,0 — высокая адгезивность бактерий.
Для проведения биохимических исследований и последующего изучения влияния исследуемых субстанций поверхностных антигенов дифтерии на процесс адгезии тест-культуры С. diphtheriae к эритроцитам человека облученные и не облученные суспензии микробных клеток С. diphtheriae центрифугировали и отделяли супернатан-ты облученных (СНо) и не облученных (СНк) образцов.
Антигенные субстанции СНо и СНк вносили по 0,5 мл в пробирки с 0,5 мл взвеси формалинизированных эритроцитов человека, выдерживали полчаса в термостате при температуре 37 °С, а потом изучали адгезивные свойства тест-культуры С. diphtheriae.
Результаты и их обсуждение
В таблице 1 представлены показатели адгезии микробной культуры патогенных коринебактерий, облу-
ченной (опыт) и не облученной (контроль) ЭМИ СВЧ (табл. 1).
Как видно из таблицы 1, в результате облучения микробной суспензии С. diphtheriaе увеличились все показатели адгезии: СПА вырос в 1,5 раза, КА — на 12,2 %, ИАМ — 4,0 — вырос в 1,3 раза по сравнению с контролем.
Результаты биохимических исследований полученных антигенных субстанций (СНо и СНк) представлены в таблице 2.
Концентрация белка в СНо — 3,6 мг/мл превышала показатель контроля — 2,7 мг/мл в 1,3 раза. Содержание липотейхоевых кислот, входящих в состав мурамил-пептида клеточной стенки коринебактерий, в образце, полученном из облученной ЭМИ СВЧ культуры (СНо), также превышало соответсвующие показатели для образца СНк: в 1,1—1,3 раза. Полученные результаты свидетельствуют о том, что под действием ЭМИ происходят процессы дезинтеграции микробных клеток с накоплением в жидкой фазе суспензии элементов клеточной стенки.
Следующим этапом исследования стало изучение влияния исследуемых антигенных субстанций СНо и СНк на процесс адгезии тест-штамма С. diphtheriaе, результаты отражены в таблице 3.
Данные таблицы 3 говорят о том, что предварительная экспозиция эритроцитов с препаратами СНо в обоих вариантах концентрации исходных суспензий C. diphtheriae (1 млрд. и 14 млрд.) привела к существенному снижению всех показателей адгезии: СПА — в 2,0—2,4 раза, КА — в 1,3 раза, ИАМ — в 1,7—1,9 раза. При этом степень адгезии из интервала 2,5 < ИАМ < 4,0 — група среднеадге-зивных микроорганизмов изменился на интервал 1,76 < < 1АМ < 2,5 — група низкоадгезивных микроорганизмов.
Выводы
1. Узкополосное облучение ЭМИ СВЧ приводит как к увеличению адгезивности самой тест-культуры C. diphtheriae, так и к накоплению адгезинов в жидкой фазе микробной суспензии.
2. Полученные антигенные субстанции C. diphtheriae с повышенным содержанием адгезинов могут быть использованы в дальнейших исследованиях для изучения их влияния на колонизационную устойчивость при иммунизации ими подопытных животных и являются перспективным компонентом при разработке комплексных дифтерийных вакцин.
Литература / References:
1. Чудная Л.М., Оксиюк И.Г., Красюк Л.С., Мороз Л.В. и др. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии в Украине // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 1999. — № 1. — С. 10— 12.
Chyudnaya 1М. Epidemiologicheskaya situatsiya po difterii v Ukraine [Epidemiological situation regarding to diphtheria in Ukraine] / LM. Chyudnaya, V.G. Oxiyuk, L.S. Krasyuk, L.V. Моrоz, S.I. Bryzhata, 1.М. Skuratovskaya, Ye.V. Demichovskaya // Epidemiology and Infectious Diseases. — 1999. — № 1. — P. 10—12. (In Russ).
2. Kolodkina V. Molecular epidemiology of C. diphtheriae strains during different phases of the diphtheria epidemic in Belarus / V. Kolodkina, L. Titov, T. Sharapa, F. Grimont, P.A.D. Grimont, A. Ef-stratiou // BMC Infect Dis. — 2006. — V. 6. — Р. 129—1 37.
3. Костюкова Н.Н. Уроки дифтерии // Журнал микробиол., эпи-демиол., иммунобиол. — 1999. — № 2. — С. 92—96. Kostyukova N.N. Uroki difterii [The lessons of diphtheria] // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. — 1999. — № 2. — S. 92—96. (In Russ).
4. Mattos-Guaraldi A.L. Diphtheria remains a threat to health in the developing world — an overview / A.L. Mattos-Guaraldi, L.O. Morei-ra, P.V. Damasco, R. Hirata Junior / / Mem. Inst. Oswaldo Cruz. — 2003. — V. 98. — Р. 987—989.
5. Шмелева Е.А., Никитин Д.П., Кузиков А.Н., Яровая Л.М. и др. Характеристика дифтерийной бактериальной вакцины и результаты ее изучения в эксперименте и на людях / / Тезисы Всероссийского съезда микробиологов и эпидемиологов (22— 24 октября 1985, Краснодар). — М., 1985. — С. 69—71. Shmelyeva YeA Characteristics of diphtheria bacterial vaccine and results of its study in e x periment and in human research / YeA Shmelyeva, D. P. Nikitin, AN. Kuzikov, LM. Yarovaya, V.P. Bochkova, S.S. Markina, N.N. Kondrashina // Theses of VAll-Russian Microbiologists and Epidemiologists Congress Reports, (22 — 24 october 1985, krasnodar). — М., 1985. — P. 69—71. (In Russ).
6. Global Vaccine Action Plan 2011 — 2020 [Electronic resource] // Immunization, Vaccines and Biologicals. — Access: http:// www.who.int/immunization/global_vaccine_action_plan/en/
7. Харсеева Г.Г., Алиева А.А. Адгезия Corynebacterium diphtheriae: роль поверхностных структур и механизмы формирования / / Журнал микробиол., эпидемиол., иммунобиол. — 2014. — №4. — С. 109—117.
Kharseeva G.G., Alieva A.A. Adgezia Corynebacterium diphtheriae: rol poverchnostnyh struktur I mehanizmy formirovaniya [Adhesion of Corynebacterium diphtheriae: the role of surface structures and formation mechanism] //Zh. Mikrobiol. (Moscow). — 2014. — № 4. — С. 109—117. (In Russ).
8. Rogers E.A. Adhesion by pathogenic corynebacteria / H.E. Mei, T. Yoshida, W. Sime, F. Hiepe, K. Thiele, R.A. Manz, A. Radbruch, T. Dorner // Adv Exp Med Biol. — 2011. — V. 715. — Р. 91 — 103. — Access : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21557059
9. Жигангирова Н.А., Гинцбург А.Л. Мишень-специфический скрининг антивирулентных препаратов для терапии хронической инфекции // Журнал микробиол., эпидемиол., иммунобиол. — 2011. -№ 4. — С. 107—115.
Zigangirova N.A. Mishen-spetsificheskiy skrining antivirulentnyh preparatov dlya terapii chronicheskoy infektsii [Target-specific screening of antivirulence preparations for chronic infection therapy] / N.A. Zigangirova, A.L. Gintsburg //Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. — 2011. — № 4. — 1 07—115. (In Russ).
10. Shoaf-Sweeney K.D. Adherence, anti-adherence, and oligosac-charides preventing pathogens from sticking to the host /Shoaf-Sweeney K.D., Hutkins R.W.//Adv Food Nutr Res. — 2009. — V. 55. — P. 101 — 161.
11. Krachler A.M. Targeting the bacteria-host interface: strategies in anti-adhesion therapy / A.M. Krachler, K. Orth // Virulence. — 2013. — V. 15. — N 4. — P. 284—294.
12. Cozens D. Anti-adhesion methods as novel therapeutics for bacterial infections / D. Cozens, R.C. Read // Expert Rev Anti Infect Ther. — 2012. — V.10. — N 12. — P. 1457—1468.
13. Gaudreau M.C. Protective immune responses to a multi-gene DNA vaccine against Staphylococcus aureus / M.C. Gaudreau, P. Lacasse, B.G. Talbot // Vaccine. — 2007. — V. 25. — P. 814— 824. — Access: http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S0264410 X 06010401
14. Mandlik A. Pili in Gram-positive bacteria: assembly, involvement in colonization and biofilm development / A. Mandlik, A. Swierczyn-ski, A. Das, H. Ton-That // Trends Microbiol. — 2008. — V. 16. — N 1. — P. 33—40. — Access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC2841691/
15. Брилис В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленц-нер // Лабораторное дело. —1986. — № 4. — С. 21 0—212. Brilis V.I. Metodika izucheniya adgezivnogo protsessa mikroorgan-izmov [Method of research of microorganisms adgesive process] / Т.А. Brilene, Х.П. Lentsner, А.А. Lentsner // Laboratornoye Delo. — 1986. — N 4. — S. 210—21 2. (In Russ).
16. Патент № 79848 (UA), МПК (2006) C12N 13/00 А61К 41/00 Способ модуляции адгезивных свойств микроорганизмов / С.В. Калиниченко, Е.М. Бабич, И.Ю. Кучма, Ю.Л. Волянский и др., заявитель Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины (иА).- № заявки u 2010 08396; заявл. 22.07.2005; опубл. 25.07.2007, Бюл. № 11.
Patent N 79848 (UA), МПК (2006) C12N 13/00 А61К 41/00 [The way of microorganisms adgesive properties modulation] / S.V. Kalinichenko, Ye.M. Babych, I.Yu. Kuchma, Yu.L. Volyansky et al.; applicant Mechnikov's Institute of microbiology and immunology of Academy of Medical Sciences; Appl. No.: u 2010 08396; Application data: 2005-07-22; Publication date: 2007-07-25; Bul. N 11. (In Russ).
