Антагонистическая активность гетеротрофных микроорганизмовиз биопленок на твёрдых субстратах литоральной зоны озера байкал Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Серия «Биология. Экология»

Онлайн-доступ к журналу: http://isu.ru/izvestia

2014. Т. 7. С. 91-98

Иркутского государственного университета

И З В Е С Т И Я

УДК [579.264:579.84/85]:552. 32 (282.256.341)

Антагонистическая активность гетеротрофных

микроорганизмов из биоплёнок на твёрдых субстратах

литоральной зоны озера Байкал

12 2 2 Е. А. Зименс ' , Е. В. Суханова , Ю. Р. Штыкова ,

В. В. Парфенова2, Н. Л. Белькова1' 2

1 Иркутский государственный университет, Иркутск

2 Лимнологический институт СО РАН, Иркутск E-mail: ekaterinasiemens93@gmail.com

Аннотация. Идентификация гетеротрофных микроорганизмов из биоплёнок, сформированных на пластинах из горных пород, выявила представителей следующих родов: Pseudomonas spp., Serratia spp., Kocuria sp., Bacillus spp. и Paenibacillus spp. Показано, что некоторые штаммы способны подавлять рост природных бактерий рода Bacillus spp., а также ряд условно-патогенных микроорганизмов, которые могут вызывать различные заболевания у человека. Бактерии рода Paenibacillus по сравнению с другими штаммами-антагонистами обладают более широким спектром антимикробной активности. Их изучение представляет несомненный практический интерес в биотехнологии.

Ключевые слова: штаммы-антагонисты, биоплёнки, антагонистическая активность, субстрат, литоральная зона, озеро Байкал.

Введение

Известно, что в природных местообитаниях микроорганизмы преимущественно существуют в ассоциативном состоянии, прикрепляясь к поверхностям, создавая сложные структуры - биоплёнки. Они представляют собой сложные сообщества, развивающиеся на различных поверхностях, включая границы фаз вода - воздух, вода - грунт, вода - геологические субстраты [5].

Антагонистические взаимодействия оказывают влияние, во-первых, на структуру микробного сообщества: состав и разнообразие видов бактерий; во-вторых, на функционирование микробиоценозов и, в целом, на природу и скорость биогеохимической трансформации веществ в водоёме [6].

Одним из эффективных путей получения новых антибактериальных веществ является поиск и культивирование микроорганизмов, продуцирующих метаболиты, способные угнетать рост патогенов. Установлено, что антимикробная активность водных штаммов бактерий не уступает почвенным [7; 8].

В частности, изучение антагонистической активности актиномицетов из оз. Байкал показало, что бактерии родов Streptomyces и Micromonospora являются сильными антагонистами по отношению к некоторым гетеротрофным микроорганизмам и позволило выявить как узкоспециализированные, так и штаммы с широким спектром антимикробной активности [3].

Зона литорали занимает около 7 % от общей площади оз. Байкал, однако протекающие в ней процессы играют важную роль и оказывают влияние на биоту всего водоёма [4]. Высокая концентрация кислорода, освещённость, температурные условия обусловливают повышенное содержание органических веществ и биомассу организмов, поэтому биогеохимические процессы протекают здесь более интенсивно, нежели в зоне открытого Байкала.

Цель работы - изучение антагонистических взаимоотношений гетеротрофных бактерий, выделенных из биоплёнок оз. Байкал, с другими автохтонными и аллохтонными микроорганизмами.

Материалы и методы

Штаммы гетеротрофных микроорганизмов были получены из коллекции культур лаборатории водной микробиологии ЛИН СО РАН (табл. 1), изолированные из биопленок, сформированных на пластинах из горных пород, которые выдержаны в течение года в литоральной зоне южной котловины оз. Байкал (пос. Листвянка). Ферментативную активность (протео-литическую, амилолитическую, фосфатазную, липазную, лецитиназную) этих штаммов определяли по методикам, описанным ранее [1]. Идентификацию культур проводили с помощью молекулярно-генетического анализа фрагментов гена 168 рРНК [2]. Полученные последовательности зарегистрированы в банке данных БМБЬ, где им присвоены следующие номера: №548398, №678914, №678933, №678934, №678944-№678946, №678977, №678986, №947325.

Определение влияния штаммов-антагонистов на природные микроорганизмы. Для эксперимента 100 мкл аликвоты суточной суспензии природных штаммов (см. табл. 1) растирали шпателем по среде Я2Л (Нте&а, Индия), затем в агаре стерильным пробочным сверлом (диаметр 6-8 мм) делали лунку, куда вносили 50 мкл суточной суспензии штаммов-антагонистов. Чашки инкубировали в термостате при 22 °С, антимикробную активность учитывали на вторые сутки культивирования по радиусу зоны лизиса (мм).

Определение антимикробной активности штаммов-антагонистов. Для исследования 300 мкл аликвоты суспензии культуральной жидкости тест-культуры растирали шпателем по среде Я2Л (Нте&а, Индия), затем в агаре делали лунку стерильным пробочным сверлом (диаметр 6-8 мм), куда вносили 100 мкл суточной суспензии антагонистов. Чашки инкубировали в термостате при 37 °С, антимикробную активность учитывали на первые сутки культивирования по радиусу зоны лизиса тест-культуры (мм).

Таблица 1

Характеристика штаммов гетеротрофных микроорганизмов, использованных в работе

Название штамма Род Среда Субстрат

Штаммы-антагонисты

Ant-1A Serratia sp. R2A Природный камень

Ant-10A Serratia sp. PCA Природный камень

Ant-4A Pseudomonas sp. R2A Уртит

Ant-6A Pseudomonas sp. r2a Гранит

Ant-3A Kocuria sp. r2a Уртит

Ant-2A Bacillus sp. r2a Природный камень

Ant-9A Bacillus sp. r2a Природный камень

Ant-8A Bacillus sp. r2a Полосчатое габбро

Ant-5A Paenibacillus sp. r2a Природный камень

Ant-12A Paenibacillus sp. r2a Природный камень

Ant-7A Paenibacillus sp. r2a Сталь

Природные штаммы

Ant-1B Bacillus sp. r2a Природный камень

Ant-2B Bacillus sp. r2a Природный камень

Ant-20 Bacillus sp. r2a Природный камень

Ant-12B Bacillus sp. r2a Природный камень

Ant-3B Bacillus sp. r2a Полосчатое габбро

Ant-5B Bacillus sp. r2a Гранит

Ant-6B Bacillus sp. r2a Гранит

Спектр антимикробной активности метаболитов штаммов-антагонистов при культивировании в жидкой питательной среде NSY (г/л: питательный бульон-1; дрожжевой экстракт-1; соевый пептон-1) определяли по отношению к тест-культурам из коллекции лаборатории водной микробиологии ЛИН СО РАН: Escherichia coli K12 F+ Str^ ВКПМ (KS-507) B-3254, E. coli M17-02 ВКПМ В-8208, Pseudomonas aeruginosa ФГУН ГИСК им. Л. А.Тарасевича Роспотребнадзора, Bacillus subtilis ВКПМ, B. subtilis DSM, Candida albicans АТСС 10231, Enterococcus faecalis АТСС 29212, E. faecium АТСС 35667, Staphylococcus aureus АТСС 25923. Тест-культуры инкубировали в мясопептонном бульоне (Биотехновация, Россия).

Штаммы-антагонисты культивировали в колбах объёмом 50 мл на орбитальном шейкере (130 об/мин, 27 °С) в течение 12 сут. Определение антимикробной активности метаболитов проводили ежесуточно на твёрдой среде РПА:10 по методике, описанной выше.

Результаты и обсуждение

Из коллекции гетеротрофных микроорганизмов было отобрано 11 культур, изолированных с различных субстратов: природный камень (6 штаммов), уртит (2), габбро (1), гранит (1) и сталь (1) (см. табл. 1). Сравнительный и филогенетический анализ их нуклеотидных последовательно-

стей показал, что разнообразие представлено тремя филами и пятью родами: фила Proteobacteria (Pseudomonas spp., Serratia spp.); фила Actinobacteria (Kocuria sp.); фила Firmicutes (Bacillus spp., Paenibacillus spp.).

Результаты тестирования показали, что только один штамм Pseudomonas sp. Ant-6A обладает потенциальной липолитической активностью. Анализ гетеротрофных микроорганизмов на наличие фосфатазной активности за сутки показал её присутствие у трёх штаммов: Serratia spp. Ап^1А и Ant-ЮА, Pseudomonas sp. Ant-6A. Определено, что 5 из 11 штаммов продуцируют лецитиназный фермент. Протеолитическая активность на казеине обнаружена у 7 штаммов. Протеолиз желатины наблюдается у 4 штаммов: Pseudomonas spp. Ant-4A и Ant-6A, Bacillus spp. Ant-2А и Ant-9А. Большинство штаммов (9) обладают амилолитической активностью. Штаммы Bacillus Ant-2А и Ant-9А, Pseudomonas Ant-4А и Ant-6A характеризуются множественной ферментативной активностью.

Определение влияния антагонистов на природные штаммы, изолированные из биоплёнок оз. Байкал, показало, что все представители рода Paenibacillus spp. ^Ш^А, Ant-7А, Ant-12А) и Serratia sp. Ant-^ способны угнетать рост некоторых видов Bacillus spp. (табл. 2).

Таблица 2

Влияние штаммов-антагонистов на природные штаммы рода Bacillus

Штаммы-антагонисты Природные штаммы Радиус зоны лизиса на 2 сутки, мм

Paenibacillus sp. АШ-5А Bacillus sp. АШ-5В 3,5

Paenibacillus sp. АШ-7А Bacillus sp. АШ-2В 2

Paenibacillus sp. АШ-12А Bacillus sp. АЙ-12В 3

Bacillus sp. АШ-2А Bacillus sp. АШ-2В -

Bacillus sp. АШ-2А Bacillus sp. АШ-2С -

Bacillus sp. АШ-8А Bacillus sp. АШ-2В -

Serratia sp. АШ-10А Bacillus sp. АЙ-12В -

Pseudomonas sp. АШ-6А Bacillus sp. АШ-6В -

Kocuria sp. АШ-3А Bacillus sp. АШ-3В -

Serratia sp. АШ-1А Bacillus sp. АШ-1В 3

Определение спектра антимикробной активности метаболитов для проанализированных штаммов показало, что они являются антагонистами по отношению к микроорганизмам, которые могут вызывать заболевания у человека: E. coli K12, E. coli M17-02, B. subtilis ВКПМ, B. subtilis DSM, C. albicans, E. faecalis, E. faecium, S. aureus, но ни один из исследуемых штаммов не подавляет Ps. aeruginosa.

Эксперимент по определению антимикробной активности суспензии суточных культур исследуемых штаммов показал, что только один из 11 проанализированных штаммов Paenibacillus sp. Ап^7А не проявил антимикробной активности (табл. 3). Штаммы Serratia sp. АпМА, Kocuria sp. Ant-ЗА, Pseudomonas sp. Ant-бА, Bacillus sp. Ап1:-9А, по-видимому, являются узкоспециализированными, так как подавляют рост только одной

тест-культуры. Все остальные штаммы проявили широкий спектр антагонистической активности (табл. 3).

Таблица 3

Антимикробная активность изолированных из биоплёнок суточных штаммов-антагонистов в отношении тест-культур (радиус зоны лизиса, мм)

ETaMMH-aHTaroHHCTLi Тест- культуры

E.coli K12 E.coli М17-02 Ps. aeruginosa B. subtilis ВКПМ B. subtilis DSM С. albicans E. faecalis E. faecium S. aureus

Paenibacillus sp. Ant-7A

Serratia sp. Ant-1A - - - 1 - - - - -

Kocuria sp. Ant-3A - - - - - 1 - - -

Pseudomonas sp. Ant-6A - - - - - 1 - - -

Bacillus sp. Ant-9A - - - - 1 - - -

Bacillus sp. Ant-8A - - - - 2 1 - - -

Pseudomonas sp. Ant-4A 5 - - - 1 - - -

Serratia sp. Ant-10A - - - - - 1 - - 1

Bacillus spp. Ant-2A 2 - - - 1 1 - - -

Paenibacillus sp. Ant-5A 1,5 1 1 - 1 3 - - 3

Paenibacillus sp. Ant-12A 3 5 1 1 2 1 - - 6

В эксперимент по определению спектра антимикробной активности взяли шесть штаммов-антагонистов, которые были определены как узкоспециализированные (Serratia sp. Ant-iÄ, Kocuria sp. Ant-ЗА, Pseudomonas sp. Ant-4Ä, Bacillus sp. Ant-9Ä) и штаммы с широким спектром действия метаболитов (Paenibacillus spp. Ant-5Ä и Ant-i2Ä), которые угнетали рост сразу нескольких тест-культур.

Штаммы с широким спектром действия метаболитов Paenibacillus spp. Ant-5Ä и Ant-i2Ä подтвердили свои антагонистические свойства, проявив антимикробную активность к 5 и 6 тест-культурам из 9 соответственно. Данные культуры показали максимальные зоны лизиса (15-17 мм) на четвёртые сутки культивирования для S. aureus. Дополнительно штамм Paenibacillus sp. Ant-i2Ä является более активным, он уже на первые сутки культивирования угнетает рост тест-культуры E. coli K12 (9 мм), E. faecium — на четвёртые сутки (9 мм), E. coli M17-02 — на пятые (15 мм).

Предварительно охарактеризованные как узкоспециализированные, штаммы Bacillus sp. Ant-9Ä, Serratia sp. Ant-1Ä и Kocuria sp. Ant-3Ä показали в данном эксперименте множественную антимикробную активность.

Штамм Bacillus sp. Ant-9Ä проявил максимальную антагонистическую активность к тест-культуре B. subtilis ВКПМ на первые сутки культивирования (5 мм), к тест-культуре S. aureus — на шестые (13 мм). Антагонист Serratia sp. Ant-1Ä подавлял рост четырёх тест-культур, максимальную зону лизиса (5—6 мм) наблюдали на первые сутки в отношении S. aureus и

E. coli M17-02, а также на вторые сутки в отношении B. subtilis ВКПМ. Kocuria sp. Ап^3А проявил антимикробную активность (4 мм) к тест-культурам B. subtilis DSM и B. subtilis ВКПМ на первые и вторые сутки соответственно. Только Pseudomonas sp. Ап^4А подавлял рост единственной тест-культуры E. faecium на четвёртые сутки культивирования, при этом зона лизиса составила 4 мм.

В зависимости от видовой принадлежности антагониста необходимо учитывать продолжительность его культивирования для получения определённых метаболитов. Так, например, штаммы Serratia sp. Ап^1А и Kocuria sp. АШ>3А показали максимальную антагонистическую активность на первые-третьи сутки культивирования, остальные штаммы на четвёртые-шестые сутки.

Кроме того, при длительном культивировании следует учитывать способность антагонистов продуцировать метаболиты, подавляющие рост разных тест-культур.

Таким образом, бактерии рода Paenibacillus spp., выделенные из биоплёнок оз. Байкал, обладают широким спектром антимикробной активности и могут представлять практический интерес как продуценты разных биологически активных веществ.

Выводы

1. Идентификация гетеротрофов, выделенных из биоплёнок, сформированных на пластинах из горных пород оз. Байкал, показала, что они относятся к пяти родам: Serratia spp. АпМА и АпМОА, Kocuria sp. Ай-3А, Bacillus spp. Ап^2А, Ап^8А и Ап^9А, Pseudomonas spp. Ап^4А и Ап^6А, Paenibacillus spp. Ап^5А, Ап^7А и АпМ2А.

2. Анализ штаммов-антагонистов на наличие ферментов показал, что они преимущественно вырабатывают амилазу. Штаммы Bacillus spp. Ап-2А и Ап^9А, Pseudomonas spp. Ап^4А и Ап^6А проявили множественную ферментативную активность.

3. Определение спектра антимикробной активности метаболитов позволило установить наиболее активные штаммы: Paenibacillus spp. (Ап^ 5А, АпМ2А) и Bacillus sp. Ап^9А, которые проявили максимальную активность в отношении следующих тест-культур: S. aureus, E. coli M17-02, E. coli K12 и E. faecium.

Работа выполнена в рамках бюджетной темы «VI.55.1.3 Структура, динамика формирования и метаболический потенциал сообщества микроорганизмов и фагов в биопленках пресноводных водоемов», номер гос. рег. 01201353443.

Список литературы

1. Биоразнообразие и активность микробного сообщества горячего источника Котельниковский (оз. Байкал) / Н. Л. Белькова [и др.] // Изв. РАН. Сер. Биология. - 2005. - Т. 32, № 6. - С. 664-671.

2. Изучение видового состава культивируемых гетеротрофных микроорганизмов оз. Байкал / В. В. Парфенова [и др.] // Биология внутрен. вод. - 2006. -№ 1. - С. 8-15.

3. Теркина И. А. Антагонистическая активность актиномицетов озера Байкал / И. А. Теркина, В. В. Парфенова, Т. С. Ан // Прикл. биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42, № 2. - С. 195-199.

4. Фиалков В. А. Течения прибрежной зоны озера Байкал / В. А. Фиалков. -Новосибирск : Наука, 1983. - 193 с.

5. Flemming H. C. Biofouling in water systems - cases, causes and counter-measures / H. C. Flemming // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - Vol.59. -P.629-640.

6. Long R. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria / R. Long, F. Azam // Appl. Environ. Microbiol. - 2001.- Vol. 67, N 11. - P. 4975-4983.

7. Biodiversity and potentials of marine-derived microorganisms / F. Sponga [et al.] // J. Biotechnol. - 1999. - Vol. 70. - P. 65-69.

8. Phylogenetic diversity of bacteria associated with the marine sponge Rhopa-loeides odorabile / N. S. Webster [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2001.-Vol. 67, N 1. - P. 434-444.

Antagonistic Activity of Heterotrophic Microorganisms Isolated from the Biofilms on Hard Substrates of Littoral Zone of Lake Baikal

E. A. Zimens1, 2, E. V. Sukhanova2, Y. R. Shtykova2, V. V. Parfenova2, N. L. Bel'kova1, 2

1 Irkutsk State University, Irkutsk

2 Limnological Institute SB RAS, Irkutsk

Abstract. Identification of heterotrophic microorganisms from the biofilms formed on the plates subsurface rock developed representatives of the genera Pseudomonas spp., Serratia spp., Kocuria sp., Bacillus spp. and Paenibacillus spp. It was demonstrated that some strains able to inhibit the growth of natural bacteria of the genus Bacillus spp., as well a number of opportunistic pathogenic microorganisms that can cause various diseases in humans. Of particular interest are bacteria of the genus Paenibacillus, which possess a broad spectrum of antimicrobial activity, as compared to other strains antagonists. It is obvious that their study is of practical interest in biotechnology.

Keywords: antagonistic strains, biofilms, antagonistic activity, substrates, littoral zone, lake Baikal.

Зименс Екатерина Андреевна студент

Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 Лимнологический институт СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3

Zimens Ekaterina Andreevna Student

Irkutsk State University 1, K. Marx st., Irkutsk, 664003 Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033

тел.: (3952)42-54-15

e-mail: ekaterinasiemens93@gmail.com

Суханова Елена Викторовна кандидат биологических наук научный сотрудник Лимнологический институт СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3 тел.: (3952) 42-54-15 e-mail: sukhanova@lin.irk.ru

Штыкова Юлия Рафиковна кандидат биологических наук младший научный сотрудник Лимнологический институт СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3 тел.: (3952) 42-54-15 e-mail: tulupova@lin.irk.ru

Парфенова Валентина Владимировна кандидат биологических наук, доцент заведующая лабораторией Лимнологический институт СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3 тел.: (3952)42-54-15 e-mail: parf@lin.irk.ru

Белькова Наталья Леонидовна кандидат биологических наук старший научный сотрудник Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1 Лимнологический институт СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3 тел.: (3952)42-54-15 e-mail: belkovan@mail.ru, belkova@lin.irk.ru

tel.: (3952)42-54-15

e-mail: ekaterinasiemens93@gmail.com

Sukhanova Elena Victorovna Candidate of Sciences (Biology) Research Scientist Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033 tel.: (3952) 42-54-15 e-mail: sukhanova@lin.irk.ru

Shtykova Yuliya Rafkovna Candidate of Sciences (Biology) Junior Research Scientist Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033 tel.: (3952) 42-54-15 e-mail: tulupova@lin.irk.ru

Parfenova Valentina Vladimirovna Candidate of Sciences (Biology) Associate Professor, Head of Laboratory Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033 tel.: (3952)42-54-15 e-mail: parf@lin.irk.ru

Bel 'kova Natalia Leonidovna Candidate of Sciences (Biology) Senior Research Scientist Irkutsk State University 1, K. Marx st., Irkutsk, 664003 Limnological Institute SB RAS 3, Ulan-Batorskaya st., Irkutsk, 664033 tel.: (3952)42-54-15 e-mail: belkovan@mail.ru, belkova@lin.irk.ru