CC BY
27
Туманова У.Н.1, Щеголев А.И.2 ©
1Младший научный сотрудник отдела лучевой диагностики, Институт хирургии им.
А.В.Вишневского; доктор мед. наук, зав. 2-м патологоанатомическим отделением, Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И.Кулакова, г. Москва
ангиоархитектоника ткани гепатоцеллюлярного рака
Аннотация
Изучены морфометрические особенности сосудов ткани гепатоцеллюлярного рака разной степени гистологической дифференцировки. Установлено, что ангиоархитектоника опухолевой ткани зависит от степени дифференцировки. Повышение степени
злокачественности ГЦР сопровождается изменениями ее васкуляризации и сочетается с прогрессирующим увеличением доли крови, поступающей по печеночной артерии. Морфометрические показатели сосудов в ткани новообразования можно использовать в качестве дополнительных диагностических критериев и для оценки прогноза заболевания.
Ключевые слова: ангиоархитектоника, гепатоцеллюлярный рак, степень дифференцировки. Keyword: angioarchitectonica, hepatocellular carcinoma, degree of differentiation.
Введение. Гепатоцеллюлярный рак (ГЦР) занимает шестое место по заболеваемости среди всех новообразований в мире и третье место среди причин смерти среди всех новообразований в мире [1]. Средняя продолжительность жизни больных после выявления ГЦР составляет 6-9 месяцев, а 5-летняя выживаемость - менее 5% [2; 3].
Быстрые темпы роста первичного узла, инвазия и развитие метастазов во многом обусловлены процессами неоангиогенеза [4]. Поэтому изучение механизмов ангиогенеза и особенностей ангиоархитектоники опухолевой ткани является актуальной задачей, решение которой будет способствовать улучшению диагностики и разработке таргетной антиангиогенной коррекции [5]. В частности, недостаточно изучены изменения васкуляризации ГЦР разной степени злокачественности [6].
Цель работы: морфометрический анализ особенностей ангиоархитектоники ткани гепатоцеллюлярного рака в зависимости от степени дифференцировки.
Материал и методы. В основу работы положен анализ операционного материала 28 больных в возрасте 17-72 лет, оперированных по поводу ГЦР без сопутствующего цирроза печени.
Полученный после резекции операционный материал подвергали комплексному макро-и микроскопическому исследованию. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Определение степени гистологической дифференцировки проводили согласно рекомендациям ВОЗ по Международной гистологической классификации опухолей печени [7; 8]. У 10 пациентов диагностирован высокодифференцированный (ВД), у 14 - умереннодифференцированный (УД), у 4 - низкодифференцированный (НД) вариант ГЦР.
Морфологическое исследование кровеносных сосудов в ткани ГЦР проводили на гистологических препаратах путем иммуногистохимического исследования с использованием готовых к употреблению моноклональных мышиных антител к CD34 (клон QBEnd/10) и кроличьих поликлональных антител к CD105 и полимерной системы детекции производства Spring Bioscience. В качестве фонового красителя использовали гематоксилин.
Морфометрический анализ препаратов проводили при помощи системы анализа изображения на базе микроскопа «Ахю Imager M1» с использованием программы AxioVision (Carl Zeiss). При большом увеличении микроскопа определяли площадь и периметр кровеносных сосудов, а также их количество (N) в поле зрения, на основании которых рассчитывали средние и суммарные значения площади (S1 и Sc) и периметра (P1 и Рс) сечения
© Туманова У.Н., Щеголев А.И., 2014 г.
кровеносных сосудов с последующим расчетом фактора формы сечения сосудов (ФФ) и морфологического показателя васкуляризации ткани (ПВ).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного пакета «Statistica 6.0». Рассчитывали среднее значение (М), стандартное отклонение (SD), ошибку среднего (m). Взаимосвязь параметров изучали при помощи корреляционного анализа с вычислением коэффициентов корреляции. Силу связи оценивали по 3 степеням: сильная (г>0,7), средняя (0,3<г<0,7), слабая (г<0,3).
Результаты и их обсуждение
В результате сравнительного иммуногистохимического изучения препаратов ткани ГЦР нами установлен различный уровень экспрессии CD34 и CD105 в кровеносных сосудах (табл. 1), а также особенности взаимосвязей между их морфометрическими характеристиками (рис. 1).
Таблица 1
Морфометрические характеристики сосудов, экспрессирующих CD34 и CD105, в ткани ГЦР
разной степени дифференцировки (M±m)
В Д УД НД
CD34 CD105 CD34 CD105 CD34 CD105
N 24,4±1,9 16,8±1,3 19,2±1,7 15±1,3 15,0±1,2 9,0±0,9
S1 173,5±15,6 138,1± 11,4 198,5±17,3 157,3±13,2 217,6±18,9 90,7±8,3
P1 58,5±3,9 49,3±2,7 72,9±5,8 65,2±4,0 68,4±4,1 47,5±2,7
Sc 4232,4±330.5 2320,1±192,3 3811,2±310,5 2359,8±198,7 3264,5±279,7 816,3±68,5
Pc 1428,4±110.4 828,6±61,8 1398,9±98,4 977,4±72,5 1026,0±84,3 427,2±36,6
ФФ 19,8±1,7 17,6±1,4 26,7±2,1 27±2,1 21,5±1,7 24,8±2,0
ПВ 12,0±0,9 6,6±0,5 10,8±0,7 6,7±0,5 9,3±0,6 2,3±0,2
Из анализа таблицы 1 видно, что на препаратах, окрашенных CD34, наибольшее количество кровеносных сосудов в поле зрения отмечается в ткани ВД ГЦР, превышающее соответствующие показатели УД и НД ГЦР на 27,1% и 62,7% соответственно. При использовании CD 105 максимальное количество сосудов установлено также в ткани ВД ГЦР. В наблюдениях УД и НД ГЦР их число меньше на 10,7% и 46,4% соответственно.
В то же время средняя площадь сечения CD34 положительных сосудов имеет наибольшие значения в ткани НД ГЦР, превышающее показатели ВД и УД ГЦР на 25,4% и 9,6% соответственно. При этом суммарная площадь кровеносных сосудов в поле зрения имеет максимальные значения в наблюдениях ВД ГЦР, превышая показатели УД и НД ГЦР соответственно на 11,1% и 29,6%. Максимальные значения средней площади сосудов при окрашивании CD105 установлены в наблюдениях УД ГЦР, где они больше значений ВД и НД ГЦР соответственно на 13,9% и 73,4%. Суммарная площадь кровеносных сосудов в поле зрения также наибольшие значения имеет в ткани УД ГЦР, а минимальные - в наблюдениях НД ГЦР.
Средние значения периметра CD34 положительных сосудов имеют максимальные значения в ткани УД ГЦР, а минимальные - в ВД ГЦР. Максимальные значения суммарного показателя периметров сечения, наоборот, отмечаются в наблюдениях ВД ГЦР, а наименьшие -в НД ГЦР. При использовании CD105 наибольшие значения среднего и суммарного показателей периметров установлены в ткани УД ГЦР, а минимальные - в наблюдениях НД ГЦР.
Примечательно, что рассчитанные показатели фактора формы сечения сосудов, окрашенных как CD34, так и CD105, имеют наибольшие значения в ткани УД ГЦР, а минимальные - в наблюдениях ВД ГЦР. В то же время максимальные значения показателя васкуляризации ткани, характеризующего удельную площадь сечения кровеносных сосудов в поле зрения, установлены в наблюдениях ВД ГЦР при анализе препаратов, окрашенных СD34, и в ткани УД ГЦР при использовании CD105.
Анализируя особенности иммуногистохимической реакции опухолевых сосудов с антителами CD34 и CD105, следует отметить, что СD34 относится к панэндотелиальным
маркерам, реагирующим с большинством эндотелиальных клеток. В свою очередь CD105 усиливает пролиферацию эндотелиоцитов и экспрессируется в участках неоангиогенеза на растущих кровеносных сосудах [9]. В целом показатели площади, периметра и количества кровеносных сосудов, окрашенных CD34, превышают соответствующие значения при использовании CD105, что согласуется с данными литературы: внутриопухолевая плотность сосудов на препаратах с реакцией на CD105 была меньше по сравнению с таковой при окраске CD34 (50,8 по сравнению 125,6 на 0,74 мм2 ткани) [10].
Результаты сравнительного корреляционного анализа морфометрических показателей кровеносных сосудов в ткани ГЦР разной степени дифференцировки представлены схематично на рис. 1, где отражены только сильные связи (г>0,7).
В узлах ВД ГЦР количество CD34 позитивных сосудов имеет сильные положительные связи с суммарным периметром и фактором формы их сечения и отрицательную связь со средней площадью сосудов в поле зрения. При этом значения суммарного периметра прямо коррелируют с фактором формы и имеют отрицательную взаимосвязь со средней площадью. Количество CD105 окрашенных сосудов также имеет положительную сильную связь с суммарным периметром, но отрицательную взаимосвязь с его средними значениями. Фактор формы сечения сосудов обратно коррелирует со средними значениями их площади и периметра.
В ткани УД ГЦР при использовании CD34 отмечаются отрицательные корреляции количества сосудов со средними значениями их площади и периметра и положительная взаимосвязь с суммарным периметром. При этом средняя площадь сечения сосудов прямо коррелирует с их средним периметром, суммарной площадью сечения и показателем васкуляризации. Количество же CD105 позитивных сосудов аналогично наблюдениям ВД ГЦР имеет имеет прямую взаимосвязь с суммарным периметром. Наряду с этим, отмечаются положительные корреляции между средними и суммарными значениями площади и периметра кровеносных сосудов.
Рис. 1. Схемы корреляционных связей морфометрических показателей сосудов, окрашенных CD34
(а, в, д) и CD105 (б, г, е), в ткани ГЦР.
а, б - ВД ГЦР; в, г - УД ГЦР; д, е - НД ГЦР.
Наблюдения НД ГЦР характеризуются наличием сильных взаимосвязей между всеми изученными морфометрическими показателями сосудов, окрашенных CD34. При
использовании CD105 количество сильных корреляций меньше, однако количество выявленных сосудов имеет положительные связи с суммарными значениями площади и периметра, фактором формы и показателем васкуляризации. Отмечаются прямые корреляции фактора формы сосудов с показателями суммарной площади и периметра, а также последних между собой.
Следовательно, морфометрические показатели кровеносных сосудов в узлах ГЦР зависят от степени гистологической дифференцировки. Выявленные нами изменения ангиоархитектоники ткани ГЦР подтверждают факт развития процессов опухолевого неоангиогенеза. Последние обеспечивают быстрый рост и увеличение в размерах опухолевой ткани. Одновременно с этим именно в результате ангиогенеза опухолевые клетки могут попадать в общий кровоток с последующим развитием отдаленных гематогенных метастазов.
Наиболее характерными признаками опухолевого ангиогенеза в ткани ГЦР считаются капилляризация синусоидов и артериализация ткани [5]. Капилляризация синусоидов представляет собой преобразование фенестрированных печеночных синусоидов в
нефенестрированные капилляры, которое сопровождается появлением в эндотелиальных клетках положительной экспрессии CD34. При этом процессы капилляризации синусоидов взаимосвязаны со степенью злокачественности новообразования. В участках ВД ГЦР встречаются как обычные синусоиды, так и микрососуды капиллярного типа, а при НД форме -только капилляры [11].
Артериализацией или артериогенезом ткани ГЦР обозначают образование новых коллатеральных артерий из ранее существовавших. В нормальной ткани печени печеночные артерии проходят в портальных трактах и сопровождаются желчными протоками. Опухолевые артериальные сосуды расположены в толще опухоли и не сопровождаются желчными протоками, вследствие чего их называют непарными артериями. В процессе роста новообразования внутриопухолевые портальные тракты подвергаются инвазии и уменьшаются в количестве, вследствие чего артериальные опухолевые сосуды начинают прорастать в опухоль от печеночных артерий, расположенных вокруг опухоли. При этом количество непарных артерий на единицу площади опухолевой ткани на ранней стадии (менее 1,5 см в диаметре) развития новообразования составляет порядка 60% от показателей выраженного ГЦР [12].
В результате проведенного морфометрического исследования нами установлено, что наибольшее количество CD34 окрашенных сосудов, а также максимальные значения суммарной и удельной площади их сечения отмечаются в ткани ВД ГЦР. При этом установлено увеличение средней площади сосудов в процессе снижения степени гистологической дифференцировки. При использовании CD105 максимальное количество новообразованных сосудов наблюдается также в ткани ВД ГЦР, а суммарной площади их сечения в поле зрения -в наблюдениях УД ГЦР. Минимальные значения количества сосудов и степени васкуляризации ткани установлены нами в узлах НД ГЦР.
Подобные изменения, видимо, обусловлены «возрастом» опухоли. Выраженный ангиогенез характерен для ранних стадий развития опухолей, в дальнейшем он снижается. В процессе развития новообразования и увеличения его в размерах метаболизм опухолевых клеток меняется в сторону анаэробного [13].
Вместе с тем, на основании проведенного корреляционного анализа можно заключить, что ткань ВД ГЦР характеризуется большим количеством сосудов, в том числе новообразованных, мелких размеров и неправильной формы. Более крупные сосуды имеют более округлую форму сечения. В наблюдениях ГЦР отмечается увеличение числа зрелых крупных сосудов преимущественно неправильной формы, новообразованные сосуды в основном округлой формы. Ангиоархитектоника НД ГЦР характеризуется меньшим количеством крупных зрелых и мелких новообразованных сосудов неправильной формы, что свидетельствует об увеличении площади поверхности обмена в условиях недостаточного поступления кислорода.
Вышеописанные нарушения структуры синусоидов и формирование новых сосудов в процессе развития ГЦР сопровождаются изменениями и кровоснабжения опухолевого узла. По данным литературы [11] высокодифференцированные ГЦР размером менее 3 см достаточно часто кровоснабжаются преимущественно портальной венозной кровью, тогда как во всех наблюдениях умеренно- и низкодифференцированного рака кровоснабжение осуществляется печеночной артерией. В то же время большинство опухолевых узлов ГЦР размером более 3 см, включая высокодифференцированные формы, имеет преимущественно артериальное кровоснабжение. На основании проведенных нами компьютерно-томографических и морфологических сопоставлений показано, что наиболее васкуляризованным образованием среди изученных форм ГЦР является высокодифференцированный, а наименее васкулярным -низкодифференцированный вариант рака [14].
Необходимо добавить, что повышение плотности узла ГЦР при КТ с использованием контрастного вещества коррелирует с количеством микрососудов в его ткани, определяемых на иммуногистохимических препаратах [15]. При этом увеличение степени васкуляризации в процессе опухолевой прогрессии ГЦР сопровождается изменениями и КТ характеристик [16;
17]. В этой связи особое значение приобретают неинвазивные методы оценки васкуляризации для дифференциальной диагностики и определения эффективности лечения ГЦР.
Таким образом, ангиоархитектоника ткани гепатоцеллюлярного рака зависит от степени гистологической дифференцировки. Повышение степени злокачественности ГЦР сопровождается изменениями ее васкуляризации и сочетается с прогрессирующим увеличением доли крови, поступающей по печеночной артерии. Морфометрические показатели сосудов в ткани новообразования можно использовать в качестве дополнительных диагностических критериев и для оценки прогноза заболевания.
Литература
1. Parkin D.M., Bray F., Ferlay J., Pisani P. Global cancer statistics, 2002 // CA Cancer J. Clin. - 2005. -V.55. - P.74-108.
2. Hemming A.W., Cattral M.S., Reed A.I. et al. Liver transplantation for hepatocellular carcinoma // Ann. Surg. - 2001. - V.233. - P.652-659.
3. El-Serag H.B., Rudolph K.L. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis // Gastroenterology. - 2007. - V.132. - P.2557-2576.
4. Yang Z.F., Poon R.T. Vascular changes in hepatocellular carcinoma // Anat. Rec. - 2008. - V. 291. - P. 721-734.
5. Zhu A.X., Duda D.G., Sahani D.V., Jain R.K. HCC and angiogenesis: possible targets and future directions // Nat. Rev. Clin. Oncol. - 2011. - V. 8. - P. 292-301.
6. Туманова У.Н., Кармазановский Г.Г., Щеголев А.И. Компьютерно-томографические
характеристики степени васкуляризации гепатоцеллюлярного рака печени // Медицинская визуализация. - 2013. - № 1. - С. 52-58.
7. Theise N.D., Curado M.P., Franceschi S. et al. (Eds.) WHO classification of tumours of the digestive system. Lyon: IARC, 2010. - P. 205-216.
8. Щеголев А.И., Мишнёв О.Д., Тинькова И.О. Онкоморфология печени. М.: Издательство РГМУ, 2006. - 252с
9. Tanaka F., Otake Y., Yanagihara K. et al. Evaluation of angiogenesis in non-small cell lung cancer: comparison between anti-CD34 antibody and anti-CD105 antibody // Clin. Cancer. Res. - 2001. - V. 7. - P. 3410-3415.
10. Ho J.W, Poon R.T., Sun C.K. et al. Clinicopahological and prognosis implications of endoglin (CD105) expression in hepatocellular carcinoma and its adjacent non-tumorous liver // World J. Gastroenterol. -2005.- V.11. - P. 176-181.
11. Yamamoto T., Hirohashi K., Kaneda K., Ikebe T., Mikami S., Uenishi T. et al. Relationship of the microvascular type to the tumor size, arterialization and dedifferentiation of human hepatocellular carcinoma // Jpn. J. Cancer Res. - 2001. V. 92. - P. 1207-1213.
12. Kojiro M. Pathology of hepatocellular carcinoma. USA: Blackwell Publishing, 2006. - 174p.
13. Hlatky L., Hahnfeldt P., Folkman J. Clinical Application of Antiangiogenic Therapy: Microvessel Density, What It Does and Doesn’t Tell Us // J. Natl. Cancer Inst. - 2002. - V. 94. - P. 883-893.
14. Туманова У.Н., Дубова Е.А., Кармазановский Г.Г., Щеголев А.И. Компьютерно-томографическая оценка кровоснабжения гепатоцеллюлярного рака печени // Анналы хирургической гепатологии. -2013. - №4. С.53-60.
15. Chen W.X., Min P.Q., Song B., Xiao B.L., Liu Y., Ge Y.H. Singlelevel dynamic spiral CT of hepatocellular carcinoma: correlation between imaging features and density of tumor microvessels // World J. Gastroenterol. - 2004. V. 10. - P. 67-72.
16. Kitao A., Zen Y., Matsui O., Gabata T., Nakanuma Y. Hepatocarcinogenesis: multistep changes of drainage vessels at CT during arterial portography and hepatic arteriography - radiologic-pathologic correlation // Radiology. - 2009. - V. 252. - P. 605-614.
17. Туманова У.Н., Кармазановский Г.Г, Дубова Е.А., Щеголев А.И. Сравнительный анализ степени васкуляризации гепатоцеллюлярного рака и очаговой узловой гиперплазии печени по данным компьютерно-томографического и морфологического исследований // Вестник Российской Академии медицинских наук. - 2013. № 12. - С. 9-15.
