CC BY
49
Rccmlgttorv Mechanisms
mTsiosystems
Regulatory Mechanisms
in Biosystems
ISSN 2519-8521 (Print) ISSN 2520-2588 (Online) Regul. Mech. Biosyst., 9(2), 216-222 doi: 10.15421/021832
Analysis of the transmembrane potential
of embryos exposed to action of nickel, cobalt, tin and zinc
G. V. Galyk*, Z. Y. Fedorovych*, E. I. Lychkovsky*, D. I. Sanagursky**
*Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Lviv, Ukraine **Ivan Franko National University of Lviv, Lviv, Ukraine
Article info
Received 02.03.2018 Received in revised form
07.04.2018 Accepted 10.04.2018
Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Pekarska st., 69, Lviv, 79010, Ukraine. Tel.: +38-096-217-52-08. E-mail:
Zoryana.lvanytska@gmail. com
Galyk, G. V., Fedorovych, Z. Y., Lychkovsky, E. I, & Sanagursky, D. I (2018). Analysis of the transmembrane potential of embryos exposed to action of nickel, cobalt, tin and zinc. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 9(2), 216-222. doi:10.15421/021832
Germ cells of aquatic organisms are complex systems whose growth and development depends on many factors, one of which is the composition of the aquatic environment. We used parameters in our analysis from aggregate data available from published literature. They are data of the transmembrane potential of the germinal cells of Misgurnus fossilis (Linnaeus, 1758) at the development stage from 180th to 360th minutes. Embryos were incubated in an environment with nickel, cobalt, tin, and zinc ions and without them. Plotted lines of the transmembrane potential were digitized and calibrated at intervals of 10 minutes. Rows of numerical values of the transmembrane potentials were obtained. These rows were used for calculation of autocorrelation and cross-cross-correlation functions. It was established that the transmembrane potential describes nonperiodic and quasi-periodic oscillations. The higher statistically significant values of the autocorrelation coefficients were observed in the first lags. Autocorrelation analysis indicates that the periods of oscillations of the transmembrane potential increase with the action of nickel, cobalt, tin and zinc on the germ. The phenomena and processes that occur in the germ cell are well reflected at the initial stages of the auto-correction and are lost when the magnitude of the lag increases. The degree of similarity of transmembrane potentials with the help of cross-correlation analysis is quantitatively characterized. The distribution of fluctuations of cross-correlation functions with complex dynamics, which arise with time shifts both in the forward and reverse directions, were established. It is established that for large values of time shifts, the cross-correlation coefficient is a low-informative indicator, since information about the influence of the factor on the living system is lost. A graph for a given time shift was constructed. The connection between the nodes is the magnitude of the cross-correlation coefficients between the vapor of the transmembrane potentials, which indicate the degree of similarity of the bioelectric processes. Graphs will be used for qualitative and quantitative study of system dynamics. The obtained results confirm the existence of a close relationship between environmental nickel, cobalt, tin, and zinc and the oscillation of transmembrane potential during early embryogenesis.
Keywords: autocorrelation; cross-correlation; lag; time series; heavy metals
Aналiз трансмембранного потенщалу зародюв в'юна за Д11 шкелю, кобальту, олова та цинку
Г. В. Галик*, З. Я. Федорович*, Е. I. Личковський*, Д. I. Санагурський**
*Л-beiecbKuu нацюнальний медичний yuieepcumem Шеш Данила Галицького, Львiв, Украта *^beiecbmu нацюнальнийутверситет Шет 1вана Франка, Лbвiв, Украта
Зародкота кштини водних opraHi3MiB - складн системи, picT i розвиток яких залежить ид багатьох чинниюв, одним з яких е склад водного середовища. Вхщш параметри - штературш даш трансмембранного потенщалу зародкових клгтин Misgurnus fossilis (Linnaeus, 1758) на стада 180-360-i хвилини розвитку, яю iнкубували в cеpедoвищi з юнами шкелю, кобальту, олова, цинку та без них. Граф^ трансмембранних потенщатв переведено у цифровий формат i проквантовано з штервалом 10 хв. Отримано ряди числових значень трансмембранних потенщатв, яю у подальшому використано для обчислення автокорелящйних i крос-кроскорелящйних функцш. Трансмембранний потенщал описуе неперюдичш та квазшерюдичш коливання. Висою статистично значущ значення коефщенпв автокореляци спостершаемо у перших лагах. Автокореляцшний анатз вказуе на те, що перюди коливань трансмембранного потенщалу зб^шуються за ди шкелю, кобальту, олова та цинку на зародок. Процеси, яю вщбуваються у зародковш кллит, добре вщображаюгься на початкових етапах автокорелограми та втрачаються у рая зб^шення величини лага. Юльюсно охарактеризовано стутнь гаэдбносп трансмембранних потенщатв за допомогою кроскореляцшного аналiзу. Встановлено поширення флуктуацш кроскореляцшних функцш зi складною динамiкoю, як^ виникають за часових зcувiв як у прямому, так i зворотному напрямах. За великих значень часових зcувiв кoефiцiент кpocкopеляцii - малoiнфopмативний показник,
осюльки втрачаетъся iнформацiя про вплив фактора на живу систему. Побудовано кореляцшш плеяди для заданих часових зсушв. Зв'язок м1ж компонентами плеяд - величина коефщешгв кроскореляци мiж парами трансмембранних потенцiалiв, яю вказуютъ на стушнь подiбностi бiоелектричних процесiв. Кореляцшш плеяди у подальшому будутъ застосуватись для яюсного та юлькюного дослщження динамiки системи. Отриманi результата шдтверджують iснування тiсного взаемозв'язку м1ж наявшстю в середовищi шкубаци зародкових клгтин у раннъому ембрiогенезi iонiв нжелю, кобальту, олова та цинку на величину перюду коливань трансмембранного потенщалу.
Ключовi слова: автокореляцiя; кроскорелящя; зсуви; часовий ряд; важк метали.
Вступ
Процес саморегуляцц будь-яко! бюлопчно! системи полягае у фунщюнуванш взаемозалежних сигнальних шляхiв, яю можна зо-бразити як позитивними, так i негативними зворотними зв'язками (Reversade & De Robertis, 2005; Abdelalim, 2013; Huang & Zheng, 2018). Зародшж клпини, як приклад складних систем, самореал-зуються шляхом координовано! динамично! експреси сотень гешв та бтюв, у точнш реакцц на дю зовиших сигнапiв (температур-ний режим, склад середовишд тощо).
Один 1з головних параметрiв, який описуе фвюлопчний стан клпини, - це мембранний потенциал. Результати ф1з1олог1чних до-слщжень вказують на змши в регуляци трансмембранного потенциалу, що, у свою чергу, контролюеться проходженням клпини через клпинний цикл (Blackiston et al., 2009; Barghouth et al., 2015). Трансмембранний потенциал розглядають як ключовий регулятор протферацц клпин р1зного типу, а також припускають, що вш контролюе фазов1 переходи G1/S та G2/M (Blackiston et al., 2009). Для зародкових об'екпв у перюд синхронних подiлiв бласгомерiв характеры коливання бюелектричних (Goyda, 1993) та метабошчних (Abdelalim, 2013) парамегрiв, таких, як швидккть поглинання кисню, швидюсть глiколiзу, активнiсгь Ш+Д+^ТРази, Ca2+-ATPази, казе-!нкiнази II. У зв'язку 1з цим для повного уявлення про особливосп клпинних ритмв у ранньому ембр1огенез1 тварин проанал1зовано динамку трансмембранного потенциалу не лише за нормальних умов розвитку, а i за да гормоив (Sanagursky & Goyda, 1980).
Найпоширенш забруднювач не лише водних екосистем - юни важких метапiв та !х сполук, серед яких найчастше зустр1чають кобальт, нкель, залiзо, цинк, мщь, кадмш (Gevorgyan et al., 2016; Blewett & Leonard, 2017). Ц речовини токсичт, бюакумулюються (Jitar et al., 2015) та залишаються у довюлш упродовж тривалого часу (Marzan et al., 2017). 1х походження як природне (Neta et al., 2018), так i зумовлене дяльнютю людини (Gevorgyan et al., 2016).
У водних тварин гамети видшяються у воду, де ввдбуваеться заплщнення. З лпературних даних вщомо, що, залежно вщ кон-центрап)!, юни важких метал1в акумулюються у клпинах (Boiko & Sanagursky, 2000) i впливають на гамети та ембрюни, змшюючи ф1зюлог!чт властивосп клгтин i генерацию потенщалу до (Boiko & Sanagursky, 2000; Gallo, 2018).
1они важких мет^в, нагромаджуючись у клгтин!, зумовлю-ють низку ефекпв, як метабол1чн1 розлади, токсична ефекти, що спричиняють структуры змши клпин, розвиток значних аномалш або смерть организму (Boiko & Sanagursky, 2000; Jezierska et al., 2008; Galyk, 2017). Важкi метали впливають на амплтуду коливань трансмембранного потенциалу зародкових клiтин (Boiko & Sanagursky, 2000) - шдикатор життездатносп клiтини та организму в цлому.
Крива, зареестрованого трансмембранного потенциалу на мембранах бластомергв характеризуется коливальною динамжою, де перiод кожного коливання збнжться в часi з подлом клпини у перюд синхронних подшв (Sanagursky & Goyda, 1980). Тому для дослщження зареестрованого сигналу трансмембранного потенциалу застосовують аналпичт пщходи (Sanagursky & Goyda, 1980). Розрахунок коефщенпБ автокореляцц та кроскореляци виконано у працях Sanagursky & Goyda (1980), Ivashkiv et al. (2001) iз метою встановлення тюноти зв'язку мiж часовими сшввщношен-нями метабоМчних показникiв (шБидкiсгь поглинання кисню, швидкють глжоМзу, рiвень рН, активтсть казе!нкшази-2 та Na+/K+-ATФази) та бюелектричних показникiБ (коефiцiент електричного зв'язку та трансмембранний потенцкл зародково! клпини) Як на-слщок запропоновано критерй оцшювання динамжи показникiБ бластомертв у перюд синхронних подшв за нормальних умов се-редовища та за да екстремальних чинникiв (Sanagursky & Goyda, 1980; Ivashkiv et al., 2001).
Вплив катюшв важких металгв на зародки водних оргашзм1в -актуальна проблема сучасно! бюлогй не лише з еколопчно!, а й iз бiофiзично! точки зору. Порушення механизму генерування i, як наслщок, величини трансмембранного потенциалу у перiод синхронних подшв бластомергв - один iз симптшпв аномального розвитку, який може викликати зменшення чисельносп водних органiзмiв. У зв'язку з цим, мета статп - оцшити динамiку трансмембранного потенциалу зародив в'юна за да iонiв нжелю, кобальту, олова, цинку та за нормальних умов.
MaTepiai i методи досЛджень
Вхщт параметри - лiтерагурнi даш авторгв (Boiko & Sanagursky, 2000) про змши трансмембранного потенциалу зародкових клпин Misgurnus fossilis (Linnaeus, 1758) на 180-360-й хвилит розвитку за вщсутносп та наявносп у середовищ шкубащ iонiв нжелю, кобальту, олова та цинку.
Методика обчислення кореляцино! функцд трансмембранного потенциалу у спрощеному виглядi полягае у таки посл1дов-ност!. По-перше, зареестровану в експерименп криву трансмембранного потенциалу необх1дно подати у форм1 послщовносп чисел, якi в1дображають величину сигналу потенциалу для часового вщрвку 180-360-та хв. Для переведення графшв у цифро-вий формат використали програму GetData Graph Digitizer 2.26 (Ivashkiv et al., 2001).
Наступний крок вимагав прокБантувати отриманi результати. Частоту вимiрiв обрано 10 хв. Отримано ряди числових значень трансмембранних потенцiалiв, якi у подальшому використано для обчислення автокореляц^йних i крос-кроскореляцшних функций. Автокореляц^йний аналiз полягае у ж^нянт часового ряду величин сигналу трансмембранного потенциалу iз самим собою, зсунутим на деякий промiжок часу, який називаеться лагом. Його ж^няння проводили на часовому промiжку з шшим часовим промiжком, який випереджуе або запiзнюеIься у часi вщносно да-ного. З метою отримання «чистгшо!^) картини перiодичних залеж-ностей (усунення впливу iнших зм1нних) обчислюеться часткова автокореляцiя часового ряду. Пд час кроскореляц^йного аналiзу виконують ж^няння двох сигналiБ трансмембранного потенциалу, реестрованих для двох клiтин, у чаа iз запiзненням i виперед-женням сигналу (Box et al., 2013; Huang & Zheng, 2018).
Розрахунок автокореляциних, часткових автокореляц^йних i кроскореляц^йних функций проводили за допомогою пакета Sta-tistica 8.0 (StatSoft Inc., USA). Дослвдження полягало у комплексному вивчент трансмембранного потенлалу, який являе собою випадковий процес, що мае властивосп стационарного. Статистичт об'екти - часовi ряди, значення в яких посл1довно впорядкованi в часг Автокореляцiя високих порядкiв оцшюеться за допомогою Q-тесту Льюнга - Бокса зi значенням ймовiрностi, з якою прийма-еться ггпотеза про те, що автокореляця в1дсутня на кожному лаа за тестом Льюнга - Бокса. Достжрнють кроскореляц^й оцшена за таблицею граничних значень коефщенпв кореляцiI за рiБня значимости Р = 0,05.
Результати
Дослщження автокореляциних функци п'яти часових рядiБ трансмембранних потенц^в для зародкiБ в'юна у перюд ранньо-го ембрiонального розвитку, яю iнкубували в середовищ^ з юнами н1келю, кобальту, олова та цинку та без них, виявило лаги, на яких значення коефщенпв автокореляци виходили за межi довiрчого iнтервалу. Для часового ряду трансмембранного потенциалу за-родкiБ, iнкубованих у середовищ^ без iонiв важких металiв на пер-шому лазi (190-та хв) коефiцiент автокореляпiI набув максималь-Biosyst., 9(2) 217
ного зтчення r = 0,74 m рвт знaчyщocтi P = 0,002. Aвтoкopе-ляцiйний зв'язок позитивний, cильний i пocлiдoвний y лaIax вщ першого по четвертий (перюд 30 xe: iß 190-ï по 220-ту xe) (рж. 1а), га негативний, cлaбкий y лaгax 1з 10-го по 15-й (перюд 1з 280-ï по 330-ry xe) i вдоутнй y лaгax is 5-го по 8-й (перюд 30 xe: is 230-ï по 260-ry xe), оектъки знaчення кopеляцiй оеиилююгъ близько нуля. Величини aвтoкopеляцiйииx фyикцiй виxoдягъ за меж дов1рчого iитеpвaлy в лaгax з першого по третш (перюд 20 xe: в 190-ï по 210-гу xe) i з 10-го по 15-й лиг (перюд 50 xe: 1з 280-ï по 330-ту xe). Коефщенти aEтoкopеляцiï плавно змiиююгъ знак 1з позитивного на негативний у шестому лаз1 (240 xe). Кoефiцieнт чacткoвoï авто-кopеляцiï виxoдигъ за меж дов1рчого штервалу на першому лаз1 (190 xe) i набирае минимального значення 0,736 на piEнi значущо-cri P = 0,0002 (pиc. 1б). Такий результат вказуе на кopеляцiю вiддaлеииx на 10 xe. Коливання пiкoвиx значень чacгкoвoï aEтoкopеляцiйиoï функци вiдбyEaюгъcя перюдично з третього по одинадцятий лаги (перюд 80 xe: 1з 210-ï по 290-гу xe), за шш^ значень чacoвиx xyßiB коливання чacткoвoï aEтoкopеляцiйиoï функци - аперюдичт.
Aвтoкopеляцiйнa функц1я
Лаг Кор. CTnC
1 +,736 ,1994
2 +,498 ,1946
+,429 ,1897
4 +,347 ,1846
5 +,112 ,1794
6 -,097 ,1741
7 -,076 ,1685
8 -,109 ,1628
9 -,276 ,1569
10 -,390 ,1508
11 -,332 ,1443
12 -,306 ,1376
13 -,368 ,1306
14 -,370 ,1231
15 -,268 ,1151
16 -,149 ,1066
17 -,119 ,0973
18 -,019 ,0870
Q
13,63
P
,0002
28,85 ,0000 29,24 ,0000
29,55 29,75
,0000 ,0001
30,20 ,0002 33,30 ,0001 40,00 ,0000 45,30 ,0000 50,24 ,0000 58,19 ,0000
72,65 74,61
,0000 ,0000
Чиркова автокореляцшна фyнкцiя
Лаг Кор. CTnC
1 +,736 ,2132
2 -,095 ,2132
+,215 ,2132
4 -,074 ,2132
5 -,324 ,2132
6 -,154 ,2132
7 +,225 ,2132
8 -,156 ,2132
9 -,184 ,2132
10 -,113 ,2132
11 +,026 ,2132
12 -,080 ,2132
13 +,001 ,2132
14 -,080 ,2132
15 -,053 ,2132
16 +,116 ,2132
17 +,026 ,2132
18 +,114 ,2132
■
"и
M
□
□ □ о □ □
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
б
Рис. 1. Графки aвтoкopеляцiйиoï (а) га чacткoвoï кopеляцiйиoï фyикцiï (б) для чашвого ряду тpaиcмембpaииoгo пoгеицiaлy: дов1рчий штервал показано чорною лiиieю
Для чашвого ряду тpaиcмембpaииoгo пoтеицiaлy, реестрова-ного на зapoдкax в'юна, шкубованж у cеpедoвищi з ншелем, мак-cимaльие значення коефщ1еша автокореляци значуще та вщиовь дае першому лагу (190-га xb) i cгaиoвить r = 0,85 на pißrn зтачущост1 P < 0,001, що вказуе на cильиий кореляцшний зв'язок i иaявиicть лiиiйиoгo тренду (рж 2а). Aвгöкopеляцiйиa функця позитивна достов1рна в лaгax 1з першого по третш (перюд 20 xb: 1з 190-ï по 210-гу xe) га негативна достов1рта у лагт 13-18 (перюд 50 xe: 1з 310-ï по 360-гу xe). Aвтoкopеляцiйнa функцк повтьно змеишyeтъcя з1 збшьшенням лага. У змiщеииi, що вщповщае шостому лагу (240 xe), корелограма змiиюe знак на негативний, автокорелящя практично вiдcyгия r = -0,024 за P < 0,001. Дошщжешя чacгкoвoï aвтoкopеляцiйиoï фyикцiï виявило, що лише для першого лага значення кoефiцieнгa кореляци виxoдить за дов1рчий штервал i становить 0,853 (P < 0,001). З першого по тринадцятий лаг (перюд 100 xe: 1з 190-ï по 310-ту xe) шостерта-
юте^я пеpioдичнi коливання чacгкoвoï aвтoкopеляцiйиoï функци з перюдом коливань 60 xe (рж. 2б), чого не cпocтеpiгaли на графжу aвтoкopеляцшшï функци (рж. 2а).
Aвтoкopеляцiйнa функц1я
Лаг 1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
15
16
17
18
Кор.
+,853 +,688 +,479 +,308 +,112 -,024 -,088 -,120 -,157 -,182 -,212 -,242 -,250 -,252 -,285 -,289 -,258 -,202
CTCT ,1994 ,1946 ,1897 ,1846 ,1794 ,1741 ,1685 ,1628 ,1569 ,1508 ,1443 ,1376 ,1306 ,1231 ,1151 ,1066 ,0973 ,0870
Q
18,27 30,76
37.15 39,94 40,33 40,35
40.62
41.16 42,16
43.63 45,79 48,89 52,55 56,73 62,85 70,19 77,22 82,60
P
,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000 ,0000
Чиркова автокореляцшна функц1я
Лаг Кор. CTnC
1 +,853 ,2132
2 -,143 ,2132
-,257 ,2132
4 +,015 ,2132
5 -,221 ,2132
6 +,041 ,2132
7 +,173 ,2132
8 -,082 ,2132
9 -,142 ,2132
10 -,028 ,2132
11 -,132 ,2132
12 -,050 ,2132
13 +,125 ,2132
14 -,085 ,2132
15 -,270 ,2132
16 +,090 ,2132
17 +,076 ,2132
18 -,028 ,2132
H
6 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
Рис. 2. Графжи автокореляцшжд (а) та частюжа кopеляцiйиoï фyикцiï (б) для часового ряду тpaнcмембpaниoгo потенциалу (гередовище iнкyбaцiï зapoдкiв в'юна мстить нжель): дов1рчий штервал показано чорною лшею
Maкcимaльиoгo значення aвтoкopеляцiйнa функнк, poзpaxoвa-на для чacoвoгo ряду тpaнcмебpaииoгo потенцзалу, pеecтpoвaиoгo для зародкв в'юна у cеpедoвищi iнкyбaцiï з юнами кобальту, набирае у першому лая (190 xe) i cтaнoвигь r = 0,863 (P < 0,001, рж. 3а). Такий результат вказуе на ^льний кореляцшний зв'язок. Aвтoкopеляцiйнa функци для даного чacoвoгo ряду xapaœpmy-eгьcя повшъним зaтyxaнням з1 зpocтaниям величини лага та зм-нюе знак на вщ'емний у рая зcyвy, що ввдповдае шзмому лагу (250 xe). Aвтoкopеляцiя практично B^cyT^ та кoлиEaeгьcя побли-зу нуля з 7-го по 10-й лаг (перюд 30 xe: 1з 250-ï по 280-ту xe). Значення автокореляцшжд фyикцiï Brno^TE за межi дов1рчого штервалу з першого по четвертий (перюд 30 xe: з1 190-ï по 220-ту xe) i з 12-го по 18-й лаг (перюд 60 xe: з 300-ï по 360-ту xe). Часткова автокорелящя у першому лая (190 xe) дocягae маш-мального значення, становить 0,863 (P < 0,001) га вводить за межi дов1рчого штервалу (pиc. 3б). Дocлiджеиня чacткoвoï автоко-pеляцiйиoï фyикцiï виявили пеpioдичнi коливання з 3-го по 13-й лаг (перюд 100 xe: в 210-ï по 310-ту xe) в перюдом коливань 50 xe.
Для часового ряду величин тpaнcмембpaниoгo потенциалу за-poдкiв в'юна, iнкyбoвaниx у cеpедoвищi з оловом, автокореляци-на функция xapaктеpизyeгьcя затукаючими коливаннями у рая збшьшення кiлъкocтi лаив (рж. 4а). Aвтoкopеляцiйнa функци зм-нюе знак на протилежний на 7-му лая (250 xe), величина коефшъ ента aвтoкopеляцiï r = 0. Макшмальт значення коефщенлв автокореляци на першому лая r = 0,885 (P < 0,001 ) га у другому лая r2 = 0,738 (P < 0,001) щдгверджуютъ наявтсть тренду. Значення коефь центв aвтoкopеляцiйиoï фyикцiï Brno^TE за межi дов1рчого ш-тервалу з першого по четвертий лаг (перюд 30 xe: 190-220-та xe) га з 11-го по 18-й лаг (перюд 70 xe: 290-360-та xe). Наявнютъ т-ншного тренду тдтверджуе також чacгкoвa автокореляцшна функция, мaкcимaльие значення якoï для першого лага становить 0,885
а
а
(Р < 0,001) та виходить за меж: дов:рчого штервалу (рис. 3б).
Автокореляцшна функцiя
Лаг 1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
15
16
17
18
Лаг 1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
15
16
17
18
Кор. СтПС +,863 ,1994
д Р
18,71 ,0000
31.21 ,0000 40,14 ,0000 45,35 ,0000 47,43 ,0000
47.92 ,0000
47.93 ,0000 48,00 ,0000
48.22 ,0000 49,32 ,0000
52.23 ,0000 56,91 ,0000 62,58 ,0000 71,35 ,0000 84,41 ,0000 99,90 ,0000
114.7 ,0000
126.8 ,0000
Кор
+,863 ,2132
-,220 ,2132
+,135 ,2132
-,248 ,2132
-,084 ,2132
-,060 ,2132
-,027 ,2132
+,130 ,2132
-,044 ,2132
-,254 ,2132
-,091 ,2132
-,078 ,2132
+,123 ,2132
-,247 ,2132
+,015 ,2132
-,055 ,2132
+,087 ,2132
+,081 ,2132
Часткова автокореляцшна функц:я
СтПС |-■-■-г-
□
И
Рис. 3. Графки автокореляцш^ (а) та частковоi кореляцшга функци (б) для часового ряду трансмембранного потенциалу (середовище шкубаци зародкiв в'юна мстить кобальт): дов:рчий iнтервал показано чорною лнею
Автокореляцшна функцiя
Лаг 1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
15
16
17
18
Кор.
+,885 +,738 +,620 +,470 +,318 +,166 -,000 -,114 -,191 -,284 -,386 -,439 -,436 -,425 -,395 -,329 -,272 -,190
СтПС ,1994 ,1946 ,1897 ,1846 ,1794 ,1741 ,1685 ,1628 ,1569 ,1508 ,1443 ,1376 ,1306 ,1231 ,1151 ,1066 ,0973 ,0870
Лаг 1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
15
16
17
18
Часткова автокореляцшна функц:я
Кор. СтПС |-■-■-г-
+,885 ,2132 •
209 ,2132
071 ,2132
,264 ,2132
,042 ,2132
175 ,2132
165 ,2132
,120 ,2132
041 ,2132
135 ,2132
,213 ,2132
073 ,2132
102 ,2132
,095 ,2132
062 ,2132
084 ,2132 ,2132
047 ,2132
□
О
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
б
Рис. 4. Графки автокореляцiйноi (а) та частковоi кореляцiйноi функци (б) для часового ряду трансмембранного потенциалу (середовище шкубаци зародив в'юна мстить олово): дов:рчий штервал показано чорною лнею
Автокрореляцшна функщя, обчислена для трансмембранного
потенциалу зародкш, шкубованих у середовищi та цинком, р:зко знижуеться з: зростанням кшькосп лагш, коливаеться близько нуля та не виходить за межi дов:рчого iнтервалу (рис. 5а) з 2-го по 18-й лаг (перюд 180 хв: з 200-1 по 3604 хв). Максимальне значення коефiцiента автокореляци вiдповiдае першому лагу, значуще та становить г = 0,611 (Р = 0,002), що вщповщае помлнш силънiй щiлъностi зв'язку. Пiд час зростання кiлъкостi лагiв значенння коефш^енлв автокореляци зменшуються. КоефiцiенIи частковоi автокореляци значущ для першого та четвертого лагш. Так результата вказують на кореляцго даних, змiщених на 10 та 40 хв.
Автокореляцшна функцiя
Лаг 1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
15
16
17
18
Кор. СтПс д Р
+,611 ,1994 1 1 1 1 9,39 ,0022
+,255 ,1946 11,11 ,0039
+,128 ,1897 — И" 11,56 ,0090
-,175 ,1846 1 12,46 ,0143
-,281 ,1794 I 1 14,90 ,0108
-,097 ,1741 ■ 15,22 ,0187
-,050 ,1685 1 15,30 ,0323
-,063 ,1628 15,45 ,0509
+,021 ,1569 » 15,47 ,0788
+,012 ,1508 1 15,48 ,1157
-,077 ,1443 п 15,76 ,1503
-,162 ,1376 \ а 17,14 ,1443
-,194 ,1306 19,35 ,1127
-,175 ,1231 = = 21,38 ,0923
-,119 ,1151 \ п 22,45 ,0967
-,046 ,1066 \ п 22,63 ,1240
-,022 ,0973 \ » 22,69 ,1599
-,034 ,0870 \ 0 ' 22,83 ,1971
0 0 ,0
,0 -0,5 0,0 0,5 1
Лаг 1 2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
15
16
17
18
Кор. +,611 -,189 +,097 -,440 +,136 +,128 -,042 -,099 -,019 +,013 -,048 -,231 -,004 +,020 +,033 -,100 -,134 +,000
Часткова автокореляцшна функц1я
СтПС г
,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132 ,2132
Рис. 5. Графки автокореляцiйноi (а) та частковоi кореляцiйноi функци (б) для часового ряду трансмембранного потенцалу (середовище шкубаци зародюв в'юна мстить цинк): дов:рчий штервал показано чорною лнею
Р-значення на вск лагах автокореляцшних функцш, окрiм та-коi для часового ряду трансмембранного потенциалу зародкiв, ш-кубованих у середовищi :з цинком, менше за рiвень значимост: 0,1%, тому за тестом Льюнга - Бокса вщхиляеться гiпотеза про вщсутнсть серiйноi кореляци на всiх лагах. Отже, дат дослщжу-ваних часових рядiв - не випадков: стохастичт коливання. Для всiх п'яти випадкв мае мсце автокореляця першого порядку. Оскшь-ки порядки автокореляци мж значеннями трансмембранного по-тенцалу однаков! кожне наступне значення мембранного потен-цалу залежить в1д попереднього, генерованого на 10 хв ранiше. Для випадку з умстом юнв цинку у середовищ: iнкубацii для за-родкових об'ектв значення трансмембранного потенцалу зале-жить в1д попередшх, генерованих на 10 та 40 хв ранше.
Кроскореляцшний анатз десяти часових рядв сигналiв, що вщповщають трансмембранним потенциалам ембрюнальних кш-тин, як шкубували у р1зних середовищах, виявив аперюдичт коливання кроскореляцшних функцш з: змiщеними вщносно ну-льового лага (180-та хв) максимальними значеннями кроскореля-цш як у прямому, так : у зворотному напрямах (рис. 6). Виходячи з вiзуалъного графiчного аналiзу, вс: тимчасовi ряди явно нестацю-нарнi. 1з графiкiв кроскореляцшних функцш видно незначнi коливання коефш^ентш кореляци, характер перiодичних коливань не виражений. У цьому випадку два сигнали трансмембранного по-тенцалу мають велику схожють за рахунок неритмiчних коливань. Наприклад, р1зниця в сил: кореляци м:ж трансмембранними потенцалами, вимряними для зародов, шкубованих у середовищ1
-1,0
а
а
-1,0
а
без юнв нжелю, кобальту, олова, цинку та за к наявносп, вказуе на вплив iонiв важких метал]в на загальну кореляц1ю сигнал1в. Це число може бути як позитивним, так i негативним (рис. 6а) в обох напрямах.
Взаемовплив двох сигнал!в - трансмембранних потенцатв, вимряних для зародкових клпиц шкубованих у середовишах без та за до нзкелю (рис. 6а), характеризуеться позитивною кроскоре-ляцею, яка поширюеться зi змщеннями вщ -1 до 12-го лага. Мак-симальне достовiрне значення кроскореляцино! функци ввдповь дае зсуву 40 хв (г = 0,65, Р = 0,05). Достжрт значення коефщен-тв кроскореляци рееструються за зсув!в 2-7.
Крива кореляцйних функц1й трансмембранних потенщал]в, вимряних для зародкових клiтин, шкубованих у середовишах без i за да кобальту (рис. 6а) характеризуеться позитивною кроскоре-ляцею, яка виходить за меж довiрчого штервалу зi змщеннями лага 0-6 (перiод 60 хв: вщ 180-1 до 240-1 хв). Максимальне значення коефшкнта кроскореляци становить г = 0,68 (Р = 0,05 на першому лаа). Кроскореляц1я трансмембранних потенц1ал1в, вимряних для зародкових клпиц шкубованих у середовишах без i за до олова (рис. 6а), характеризуеться позитивними значениями яи вщповдають зсувам в!д -4 до 9. Максимального значення кроскореляцк набувае за зсушв на 10 хв (г = 0,77; Р = 0,05). Значення коефщентгв кроскореляци виходять за меж дов1рчого штервалу за змщень у межах ввд -1-го до 5-го лага.
Взаемовплив трансмембранного потенщалу, вимряного на ембрюнальни клiтинi, за нормальних умов шкубаци та за наявносп в шкубациному середовиш! юнв цинку (рис. 6а), характеризуеться коливальною динамикою з позитивними значеннями кроскореляциних функци, що вщповвдають змщенням у лагах -17-15 та -1-12. Максимальне достов1рне значення коефшкнта кроскореля-цй становить г = 0,42 на рт значущосп Р = 0,05 за зсуву на 30 хв (лаг 3). Значення кроскореляцино! функци не виходять за меж дов1рчого штервалу.
Пд час дослвдження взаемовпливу сигнал1в трансмембранних потенц1ал]в, зареестрованих за шкубаци ембрюнв у середовищах !з нжелем ! кобальтом, кроскореляцин функци характеризуються позитивними значеннями в межах часових зсушв, що вщповда-ють лагам вщ -9-го до 5-го (рис. 66). Максимальне позитивне значення коефiпiента кроскореляци вщповдае нульовому лагу та становить г = 0,88 (Р = 0,05). Значення кроскореляциних функци виходять за меж дов1рчого iнтервалу при зсувавах ввд -4-го до 2-го.
Кроскореляцина функцк взаемовпливу сигнал1в трансмембранних потешав, зареестрованих за шкубаци ембрiонiв у середовишах !з нжелем i оловом, характеризуеться коливною динамкою. Значення коефiпiентiв кроскореляци виходять за межi дов1р-чого штервалу, шо ввдповвдають лагам ввд -9-го до 4-го (рис. 66). Максимального позитивного значення кроскореляця набувае у раз1 змщення у 30 хв назад (лаг -3) та становить г = 0,84; Р = 0,05. Достов1рт значення кроскореляциних функци перебувають у межах змщень ввд -6-го по 1-й лаг.
Аналз взаемовпливу сигналiв трансмембранних потенц^в, зареестрованих за шкубаци ембрюнв у середовишах !з нжелем ! цинком, характеризуються коливальною динам1кою з позитивними значеннями в межах часових зсутв, шо ввдповвдають лагам !з -4 до 5-го (рис. 66). Максимального позитивного значення коефь цент кроскореляцИ набирае за зсуву 10 хв назад (лаг -1) ! дор!в-нюе 0,73 (Р = 0,05). Кроскореляцина функця не виходить за меж дов1рчого штервалу за зсувв ввд -2 до 1-го.
Сшвставлення сигналiв, зареестрованих для ембрюнальних клпин, шкубованих у середовишах !з кобальтом ! оловом показало, шо кроскореляцина функця набирае позитивних значень у межах ввд -8 до 6-го лага (рис. 6е). Графж кроскореляц1йно1 функ-цй характеризуеться коливаннями з максимальною амплiгудою в нульовому лаз1, яка сгановигъ 0,87 (Р = 0,05). Достов1рн1 значення кроскореляцино! функци не виходять за меж дов1рчого штервалу в межах ввд -5 до 2-го лага.
Кроскореляцит функци, отримат для трансмембранного потенцалу зародк1в, шкубованих у середовишах !з кобальтом ! цинком, характеризуються коливаннями, з максимальною ампл-
тудою коефiпiенга кроскореляци 0,60 (Р = 0,05) у нульовому лаз1 (рис. 6е). Позитивн значення кроскореляцино! функци перебувають у межах змщень, шо ввдповвдають зсувам ввд -3 до 11-го. Достов1рт значення кроскореляцино! функци розмщет симет-рично ввд максимального значення коефiпiенга кроскореляци у лагах ввд -2 до 2-го.
Для трансмембранного потенцалу, вимряного на зародках в'юна за шкубаци в середовишах олова та цинку, розрахована кроскореляцина функця, достов1рн1 значення яко! перебувають у межах ввд 1 до 5-го лага (рис. 6в). В1зуально крива характеризуеться коливанням, яке припадае на ввд'емне значення зсуву. Максимальна амплтуда коливання кроскореляц1йно! функци припадае на зсув у 30 хв (лаг 3) ! становить 0,66 (Р = 0,05).
Рис. 6. Крос-корелограми часових рядв трансмембранного потенцалу зародкових клпиц iнкубованих за р1зного складу середовиша: ТМП - трансмембранний погенпiал зародк1в в'юна, iнкубованих у розчин Гольтфретера, ТМП (нжель) -трансмембранний потенцал зародк1в в'юна, шкубованих у розчит, шо мстив 10-5 М нжелю, ТМП (кобальт) - трансмембранний потенцал зародив в'юна, шкубованих у розчит, шо мстив 10-4 М кобальту, ТМП (олово) - трансмембранний потенциал зародив в'юна, шкубованих у розчит, шо мстив 10-4 М олова, ТМП (цинк) - трансмембранний потенцал зародив в'юна, шкубованих у розчит, шо мстив 10-5 М цинку
1з метою в1зуального зображення сили взаемодо м1ж двома сигналами трансмембранного потенцалу зародково! клпини по-будовано чотири кореляцiйнi плеяди для часових зсув!в, р!вн 180, 240, 300 та 360 хв. Загальний вигляд кореляциних плеяд показано як центри, об'еднат сгрiлками, як! вказують на силу та напрям кореляц^йного зв'язку (рис. 7). Для цього попарно розглядали вс1 можлив1 шляхи взаемодгй м!ж параметрами, шо описують генерацию трансмембранного потенцалу та регуляторних чинниив на досл!джуваному часовому пром!жку, та позначали числами 1-5. В!дстан1 м!ж цими символами пропорпiйнi значенням коефщен-
тш кpocкopеляцiй для невного моменту часового зcyвy, де cnna та нагрямок кpocкopеляцiнoï фyнкцiï мають кoнкpетне значення.
Рис. 7. Кореляцйна плеяда: 1 - трансмембранний потенциал
зародив в'юна, шкубованих у розчит Гольтфретера, 2 - трансмембранний потенцал зародив в'юна, шкубованих у розчит, що мстив 10-5 М нжелю, 3 - трансмембранний потенцал зародюв в'юна, шкубованих у розчит, що мстив 10-4 М кобальту,
4 - трансмембранний потенцал зародив в'юна, шкубованих у розчит, що мстив 10-4 М олова, 5 - трансмембранний потенЦал зародив в'юна, шкубованих у розчит, що мстив 10-5 М цинку, стршками позначено зв'язок м1ж параметрами
Обговорення
Числент лiтературнi дат вказують, що iони важких метапiв здатт викликати порушення ембрiонапьного розвитку у рiзних видах органiзмiв, наприклад, безхребетних (Sisman, 2011; Gallo et al., 2016; Gallo, 2018), риб (Blewett et al., 2016; Blewett & Leonard, 2017), чи молкlCкiв (Ringwood et al., 2010). Наипдками негативного впливу на метаболiчнi процеси в ембрiогенезi, зумовленi юна-ми нiкелю, кобальту, олова та цинку, стали сповшьнення розвитку (Behra, 1993; Blewett & Leonard, 2017), виникнення морфолопчних та функцiонапьних аномалш (Dineley et al., 2003; Hwang et al., 2012; Tualla & Bitacura, 2016), або смерп зародка (Cavas, 2008; Cai et al., 2012; Kucukoglu et al., 2013).
Автокореляцйний та кроскореляцiйний аналiзи продемонст-рували змiну перюдв коливань трансмембранних потенцiалiв зародив, iнкубованих у середовищах з iонами важких металв, якi можна вважати регуляторними чинниками iон-транспортувальних систем плазматично! мембрани клпини.
Автокорелограма - симетрична функцiя, значення яко! зале-жить вiд часових зсувiв. Таким чином, у рая збiльшення кiлькостi лагiв крива автокореляци прямуе до нуля. Суттевих великих зна-чень автокореляцiйна функцiя набирае до певного критичного лага. Ддя зародкових клпин в'юна, iнкубованих у середовищi Гольтфретера, вiн рiвний 30 хв. Збiльшення величини критичного лага для автокорелограм трансмембранних потенцатв зародив, шку-бованих у середовищi з iонами важких метапiв, вказуе на зростан-ня перiоду коливань. Показники збiльшення перюдв коливань, яи проанапiзовано з автокореляцiйних функцiй трансмембранних по-тенцiапiв зародив, iнкубованих iз нкелем, кобальтом i оловом, збгаються з даними Boyko & Sanagursky (2000) про вплив iонiв важких меташв на динамжу трансмембранного потенцалу у ран-ньому ембрiональному розвитку.
Отримат результати кроскореляцiйного анапiзу сввдчать, що поширення флуктуацiй кроскореляцiй зi складною динамжою ви-никае за часових зсумв як у прямому, так i зворотному напрямi. Коливний ефект чпко видно лише за да iонiв цинку на зародюж об'екти, хоча значення коефiцiентiв не виходять за межi довiрчого штервалу. Наявнiсть тюного кроскореляцiйного зв'язку за малих
значень часових зсувгв вказуе на те, що юни важких металтв впли-вають на динамчт змши трансмембранного потенцiалу.
За наявносп iонiв нжелю та кобальту в середовищах шкубацц бластомери в'юна, максимального достсгарного значення кроско-реляцiя набирала за нульового лага. Пояснення цього факту поля-гае в тому, що нкель порушуе iонний обмш (Blewett & Leonard, 2017). За до нжелю на ембрiони морських ïжакiв Strvngylocentro-tus purpuratus виявлено зниження концентрацiï калiю та гцдви-щення рiвня натрiю, що вказуе на шпбування №+,К+-ЛТРази (Tellis et al., 2014). 1они кобальту блокують К+-канали, №+-канали та змiнюють фiзичний стан лiпiдноï фази плазматичноï мембрани (Cai et al., 2012). Крм того, кобальт у концентраци 10-6 M iнгiбуе №+,К+-ЛТРазну активнiсть (Kaplia, 2016), що, тим самим, зумов-люе деполяризацию мембрани.
Отримаи результати кроскореляцшного аналiзу свiдчать, що за наявносп iонiв олова в середовищ iнкубацiï зародкiв, макси-мальних достсгарних значень коефщенти кореляцiï набирають за незначних часових зсувiв. Очевидно, такий ефект зумовлений впливом олова на потенщал-кероват iоннi канали (Tomaszewski & Busselberg, 2008), хоча це питання потребуе подальшого вивчення.
У рая наявносп iонiв цинку в середовищ iнкубацiï зародк1в максимальних достсгарних значень коефшкнти кроскореляцiй набирали за незначних часових зсувгв. Такий результат, можливо, е наслвдком впливу цинку на системи мембранно1 сигналiзацiï (MacDonald, 2000), а також щдтверджуе той факт, що цинк та шш1 двовалентт капони алостерично регулюють лтанд-кероваш юнт канали або шпбуюгь юнн канали (Zimmermann et al., 2012).
Коефщенти кроскореляцц - малошформативн1 показники за великих часових зсувгв, осюльки 1х значення не виходять за меж дов!рчих !нтервал!в, тобто губляться значення того чи шшого чин-ника на живу систему.
Осильки розрахован кроскореляцiï належать до одна системи, яка являе собою зародковий об'ект, i вщображають стан ввдповщних ш елеменпв у час!, вони можуть бути використаи для побудови структурно-функцюнальних схем - кореляциних плеяд. У запропонованих схемах наявт зворотш зв'язки. Побудовай ко-реляцит плеяди використовуються у подальшому для моделю-вання структурними ргвняннями. Отже, 1х можна застосувати для якиного опису параметрiв системи, а також 1х будують для створення математичних моделей для юлькснок) дослвдження.
Висновки
Наведено результати аналiзу часових рядв трансмембранних потенцiалiв зародкових клпин, шкубованих за р!зного складу се-редовища. Отриманi в межах дослвдження результати пщтверджу-ють iснування тюного взаемозв'язку мгж наявнiстю у середовиш^ шкубаци зародкових клпини у ранньому ембрiогенезi юнв нже-лю, кобальту, олова та цинку на величину зареестрованого трансмембранного потенциалу. Перюд коливань трансмембранного потенциалу вщмшний вщ норми за д]Й регуляторних чинникв. Значення цих величин бшьшг поргвняно з такими для норми, що, ймо-в!рно, викликано однаковими механiзмами регулювання трансмембранного потенцалу. Отримат результати мають прикладне значення для подальших досл1джень взаемодй р!зних гараметрiв метаболiзму у складних системах i дозволяють застосувати мате-матичнi подходи для прогнозування послщовносп 1х взаемодiй.
References
Abdelalim, E. M. (2013). Molecular mechanisms controlling 1he cell cycle in
embryonic stem cells. Stem Cell Reviews and Reports, 9(6), 764-773. Barghouth, P. G., Thiruvalluvan, M., & Oviedo, N. J. (2015). Bioeledrical regulation of cell cycle and the planarian model system. Biochimica et Biophysica Acta, 1848(10), 2629-2637. Behra, R. (1993). In vitro effects of cadmium, zinc and lead on calmodulin-depen-dent actions in Oncorhynchus mykiss, Mytilus sp., and Chlamydomonas reinhardtii. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 24(1), 21-27.
Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., & Levin, M. (2009). Bioelectric controls of cell proliferation: Ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell Cycle, 8(21), 3519-3528.
Blewett, T. A., & Leonard, E. M. (2017). Mechanisms of nickel toxicity to fish and invertebrates in marine and estuarine waters. Environmental Pollution, 223, 311-322.
Blewett, T. A., Smith, D. S., Wood, C. M., & Glover, C. N. (2016). Mechanisms of nickel toxicity in the highly sensitive embryos of the sea urchin Evechinus chloroticus, and the modifying effects of natural organic matter. Environmental Science and Technology, 50(3), 1595-1603.
Boiko, N., & Sanagursky, D. (2000). Dynamika transmembrannoho potentsialu za-rodkiv v'yuna v umovakh vplyvu ioniv vazhkykh metaliv [Dynamics of transmembrane potential of germ breeding in conditions of influence of heavy metal ions]. Visnyk of Lviv University. Series Biological, 25, 3-7 (in Ukrainian).
Box, G. E. P., Jenkins, G. M., & Reinsel, G. C. (2013). Time series analysis: Forecasting and control. John Wiley and Sons, Inc.
Cai, G., Zhu, J., Shen, C., Cui, Y., Du, J., & Chen, X. (2012). The effects of cobalt on the development, oxidative stress, and apoptosis in zebrafish embryos. Biological Trace Element Research, 150(1), 200-207.
Cavas, T. (2008). In vivo genotoxicity of mercury chloride and lead acetate: Micronucleus test on acridine orange stained fish cells. Food and Chemical Toxicology, 46, 352-358.
Dineley, K. E., Votyakova, T. V., & Reynolds, I. J. (2003). Zinc inhibition of cellular energy production: Implications for mitochondria and neurodegeneration. Journal of Neurochemistry, 85, 563-570.
Fabricio Neta, A. B., do Nascimento, C. W. A., Biondi, C. M., van Straaten, P., & Bittar, S. M. B. (2018). Natural concentrations and reference values for trace elements in soils of a tropical volcanic archipelago. Environmental Geochemistry and Health, 40(1), 163-173.
Gallo, A. (2018). Toxicity of marine pollutants on the ascidian oocyte physiology: An electrophysiological approach. Zygote, 26(1), 14-23.
Gallo, A., Boni, R, Buttino, I., & Tosti, E. (2016). Spermiotoxicity of nickel nano-particles in the marine invertebrate Ciona intestinalis (ascidians). Nanotoxi-cology, 10(8), 1096-1104.
Galyk, G. V. (2017). Vplyv ioniv vazhkykh metaliv na metabolizm zarodkovykh klityn [The impact of heavy metals on the metabolism of germ cells]. Experimental and Clinical Physiology and Biochemistry, 1, 58-65 (in Ukrainian).
Gevorgyan, G. A., Mamyan, A. S., Hambaryan, L. R, Khudaverdyan, S. K., & Vaseashta, A. (2016). Environmental risk assessment of heavy metal pollution in Armenian river ecosystems: Case study of Lake Sevan and Debed River catchment basins. Polish Journal of Environmental Studies, 25(6), 2387-2399.
Goyda O. A. (1993). Biofizicheskiye aspekty rannego ontogeneza zhivotnykh [Biophysical aspects of early ontogenesis of animals]. Naukova Dumka, Kyiv (in Russian).
Hwang, U. K., Park, J. S., Kwon, J. N., Heo, S., Oshima, Y., & Kang, H. S. (2012). Effect of nickel on embryo development and expression of metallothionein gene in the sea urchin (Hemicentrotus pulcherrimus). Journal Faculty of Agriculture Kyushu University, 57(1), 145-149.
Ivashkiv, L., Hraduk, M., & Sanagursky, D. (2001). Analiz kros-korelyatsiy u chasovykh zminakh fizyko-khimichnykh pokaznykiv rozvytku zarodkiv v'yuna [Analysis of cross-correlations in temporary changes of physical and chemical parameters of loach germs' development]. Visnyk of Lviv University. Series Biological, 27, 3-11.
Jezierska, B., Lugowska, K., & Witeska, M. (2008). The effects of heavy metals on embryonic development of fish (a review). Fish Physiology and Biochemistry, 35(4), 625-640.
Jitar, O., Teodosiu, C., Oros, A., Plavan, G., & Nicoara, M. (2015). Bioaccumulation of heavy metals in marine organisms from the Romanian sector of the Black Sea. New Biotechnology, 32(3), 369-378.
Kaplia, A. A. (2016). The influence of heavy metal ions, spermine and sodium nitroprusside on ATP-hydrolases of cell membranes of rat colon smooth muscle. Ukrainian Biochemical Journal, 88(4), 20-28.
Kucukoglu, M., Binokay, U. S., & Boga Pekmezekmer, A. (2013). The effects of zinc chloride during early development in zebrafish (Brachydanio rerio). Turkish Journal of Biology, 37, 158-164.
MacDonald, R. S. (2000). The role of zinc in growth and cell proliferation. The Journal of Nutrition, 130(5), 1500S-1508S.
Marzan, L. W., Hossain, M., Mina, S. A., Akter, Y., & Masudul Azad Chowdhury, A. M. (2017). Isolation and biochemical characterization of heavy-metal resistant bacteria from tannery effluent in Chittagong city, Bangladesh: Bioreme-diation viewpoint. The Egyptian Journal of Aquatic Research, 43(1), 65-74.
Reversade, B., & De Robertis, E. M. (2005). Regulation of ADMP and BMP2/4/7 at opposite embryonic poles generates a self-regulating morphogenetic field. Cell, 123, 1147-1160.
Ringwood, A. H., McCarthy, M., Bates, T. C., & Carroll, D. L. (2010). The effects of silver nanoparticles on oyster embryos. Marine Environmental Research, 69, 49-51.
Sanagursky, D. I., & Goyda, E. A. (1980). Opisaniye biologicheskikh struktur s pozitsiy ikh organizatsii [Description of biological structures from the perspective of their organization]. Bionics Issues, 24, 100-105 (in Russian).
Sisman, T. (2011). Early life stage and genetic toxicity of stannous chloride on zebrafish embryos and adults: toxic effects of tin on zebrafish. Environmental Toxicology, 26(3), 240-249.
Tellis, M. S., Lauer, M. M., Nadella, S., Bianchini, A., & Wood, C. M. (2014). The effects of copper and nickel on the embryonic life stages of the purple sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus). Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 67(3), 453-464.
Tomaszewski, A., & Busselberg, D. (2008). SnCl2 reduces voltage-activated calcium channel currents of dorsal root ganglion neurons of rats. NeuroToxico-logy, 29, 958-963.
Tualla, I. P. B., & Bitacura, G. (2016). Effects of cadmium and zinc on the gamete viability, fertilization, and embryonic development of Tripneustes gratilla (Linnaeus). Scientifica (Cairo), 8175213.
Zimmermann, I., Marabelli, A., Bertozzi, C., Sivilotti, L. G., & Dutzler, R. (2012). Inhibition of the prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel ELIC by divalent cations. PLoS Biology, 10(11), e1001429.
