CC BY
60
Гриценко В.А., Журлов О.С., Андрейчев В.В.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург
E-mail: vag59@mail.ru
АНАЛИЗ ВЗАИМОСВЯЗИ СЕРОРЕЗИСТЕНТНОСТИ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ СО СПОСОБНОСТЬЮ К БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЮ
В статье представлены материалы о вариабельности 45 штаммов Escherichia coli от пациентов с инфекционно-воспалительными заболеваниями урогенитального тракта и желчевыводящих путей по серорезистентности, интегральным физико-химическим параметрам (гидрофоб-ность, электрокинетический потенциал - z-потенциал) и способности к формированию биопленок. Установлено, что биопленкообразующие культуры и «биопленочная» фракция эшерихий менее устойчивы к бактерицидной активности сыворотки и более гидрофобны, чем изоляты E. coli, не формирующие биопленки, и клетки из «планктонной» фракции.
Ключевые слова: Escherichia coli, биопленки, планктонные клетки, серорезистентность, гид-
рофобность, z-потенциал.
Введение
Способность бактерий образовывать биопленки многими исследователями рассматривается как важное свойство, обеспечивающее выживание микроорганизмов в неблагоприятных условиях (высушивание, повышенная инсоляция и др.), а также при их контакте с антибиотиками и дезинфектантами [1-3]. Считается, что формирование микроорганизмами биопленок имеет отношение к патогенезу многих инфекционно-воспалительных заболеваний, в том числе, ассоциированных с катетерами и имплантатами [4, 5]. Вместе с тем данные о влиянии биопленкообразования на устойчивость бактерий, в частности Escherichia coli как возбудителей внекишечных эшерихиозов (воспалительная патология моче- и желчевыводящих путей, сепсис, нозокомиальные инфекции и др.) [6, 7], к различным эффекторам иммунитета макроорганизма пока немногочисленны и противоречивы, что определяет актуальность исследований, направленных на изучение взаимосвязи между указанными свойствами.
Целью настоящей работы явился анализ взаимосвязи серорезистентности и интегральных физико-химических характеристик (гидро-фобность, электрокинетический потенциал) эшерихий, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях урогенитального тракта и желчевыводящих путей, с их способностью образовывать биопленки.
Материалы и методы исследования
Исследования выполнены на 45 штаммах Escherichia coli из коллекции ИКиВС УрО РАН, выделенных из урогенитального тракта и мочи
у больных с простатитом, сальпингоофоритом, пиелонефритом и циститом, а также из желчи от пациентов с инфекционно-воспалительной патологией желчевыводящих путей (гнойный холангит, холецистит). Идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам с использованием наборов «EnteroTest I и II» (LaChema, Чехия) [8].
Образование биопленок эшерихиями изучали с помощью «планшетного метода» [9], путем выращивания штаммов E. coli в 150 мкл мя-сопептонного бульона (МПБ) в 96-луночной полистироловой планшете в течение 24 ч при 37°С, удаления из лунок планктонных клеток, окрашивания биопленок 1% раствором крис-таллвиолета, промывания лунок дистиллированной водой, внесения в них 96% этанола и замера с помощью фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) оптической плотности (OD) надосадочной жидкости при длине волны (л) 540 нм. Интенсивность окрашивания соответствовала степени пленкообразования исследуемых культур эшерихий.
При определении серорезистентности, гид-рофобности и электрокинетического потенциала эшерихий использовали суточные агаровые культуры E. coli, а также клетки из разных фракций бульонных культур эшерихий, инкубированных в лунках полистироловой планшеты. Планктонную фракцию клеток E.coli отбирали путем изъятия из лунок 100 мкл надосадочной части МПБ, содержащей взвешенные бактерии; биопленочную фракцию клеток эшерихий получали путем добавления к осадку 100
мкл 15М раствора NaCl и механической дезинтеграции пленок. Обе фракции клеток трижды отмывали 15М раствором NaCl (30 мин, 3000 об/мин) и стандартизовали по OD на фотоэлектроколориметре КФК-2 (Россия) при л=540 нм.
Серорезистентность эшерихий оценивалась по методике [10] с использованием в опыте 50% сыворотки крови человека (пул от 20 здоровых доноров), а в контроле - 15М раствора NaCl путем замера с помощью фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) оптической плотности (OD) опытных и контрольных взвесей при л=540 нм и расчета индекса резистентности к бактерицидной активности сыворотки (И-РБАС,%) по следующей формуле: И-РБАС=ODо/ODк*100, где ODо и ODx - оптические плотности опытных и контрольных взвесей бактерий соответственно.
Для оценки степени гидрофобности эшери-хий использовали метод разделения взвеси клеток E. coli в двухфазной системе «жидкость-жидкость» с несмешивающимися водными фазами в 0,15М растворе NaCl, обогащенными полиэти-ленгликолем (PEG 6000; с конечной концентрацией 4,5%) и декстраном (Т500; с конечной концентрацией 6,2%), что обеспечивало средний уровень межфазного поверхностного натяжения [11, 12]. Эмульгирование смеси производили непосредственно после добавления в нее бактерий путем интенсивного встряхивания на вор-тексе (2000 об/мин) в течение 120 сек при комнатной температуре. О гидрофобности бактерий судили по показателю гидрофильно-липо-фильного баланса (ГЛБ), который рассчитывали по формуле: ГЛБ=Lg(ODpEG/ODDextran), где ODpEG и ODDextran - оптические плотности верх-
ней (гидрофобной, обогащенной PEG 6000) фазы и нижней (гидрофильной, обогащенной декстраном Т500) фазы соответственно, замеренных с помощью фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) при л=540 нм.
Измерение электрокинетического потенциала (z-потенциала, mV) клеток E. coli осуществляли амплитудно-частотным методом [13] с использованием Дзетометра-1М (Россия) в обычном режиме его работы (напряжение - 10 В, частота -0,2 Гц) путем измерения амплитуды колебаний 50 бактериальных клеток в микроэлектрофорети-ческой камере (размеры: 22г22 мм, высота 0,2 мм) и вычисления средних значений z-потенциала для конкретного данного штамма по аппроксимированной формуле Смолуховского [14].
Обработку данных осуществляли методами вариационной статистики и корреляционного анализа [15].
Результаты исследования
Изученные штаммы E. coli оказались вариабельными по способности образовывать биопленки. Меньшая часть (35,6±7,2%) культур эше-рихий не образовывала биопленки, а 64,4±7,2% изолятов E. coli были способны к биопленкооб-разованию (OD>0,2). Причем среди последних биопленкообразующих изолятов E. coli имелись культуры как со слабой (OD<0,6), так и с высокой (OD>0,6) экспрессией данного признака (42,2±7,4 и 22,2±6,3% штаммов соответственно).
Сопоставление выраженности других характеристик (серорезистентность, степень гид-рофобности и величина z-потенциала) у эше-рихий с учетом их способности к биопленкооб-разованию выявило ряд достоверных (p<0,05) межгрупповых отличий E. coli (таблица).
Таблица. Cерорезистентность и физико-химические свойства эшерихий с учетом их способности к биопленкообразованию
Характеристики бактерий Штаммы E. coli Всего (n=45)
Не образующие биопленки (П=16) Образующие биопленки (n=29)
И-РБАС. % 60.0-132.4 4.3-130.6 4.3-132.4
104.1i4.5 76.6i7.5* 86.4i5.4
ГЛБ. уел. ед. -2.13...+0.38 -0.79i0.24 -1.71 +1.93 -0.39i0.15* -2.13...1.93 -0.53i0.13
z-потенциал, mV -12.5.-29.9 18.9i1.2 -10.5...-33.6 -18.5i1.0 -10.5.-33.6 -18.7i0.8
Примечание: в числителе - диапазон варьирования признака; в знаменателе - средние значения; И-РБАС - индекс резистентности к бактерицидной активности сыворотки; ГЛБ - гидрофильно-липофильный баланс; * - достоверные отличия между группами (р<0,05)
Так, эшерихии, склонные к биопленкообра-зованию, были менее устойчивы к бактерицидной активности сыворотки (И-РБАС=76,6±7,5%) и обладали более высокой степенью гидрофобнос-ти (ГЛБ=-0,39±0,15 усл. ед.), чем изоляты Е. еоИ, не образующие биопленки (И-РБАС=104,1±4,5% и ГЛБ=-0,79±0,24 усл. ед. соответственно), но практически не отличались друг от друга по величине 7-потенциала. При этом минимальный уровень серорезистентности (И-РБАС=72,4±9,1%) демонстрировали изоляты эшерихий, образующие «толстые» биопленки (ОБ>0,6), а гидрофобность клеток «планктонных» фракций биопленкообразующих штаммов (ГЛБ=-0,68±0,08) была сопоставима с гидрофоб-ностью эшерихий, не обладающих способностью образовывать биопленки (р>0,05).
Результаты корреляционного анализа также указывали на наличие у кишечных палочек достоверных (р<0,05) взаимосвязей их способности образовывать биопленки с уровнем серорезистентности (г=-0,36) и ГЛБ (г=0,31), а кроме того на обратную зависимость уровня устойчивости эше-рихий к бактерицидной активности сыворотки от степени их гидрофобности (г=-0,46).
Для экспериментального подтверждения взаимосвязи биопленкообразования кишечных палочек с их серорезистентностью и физикохимическими свойствами на 9 штаммах Е. еоИ, формирующих выраженные биопленки (ОБ>0,6), проведено определение указанных
свойств у клеток эшерихий, препаративно отобранных из планктонной и биопленочной фракций (рисунок).
Установлено, что «планктонные» клетки Е. еоИ в сравнении с «биопленочными» были в 1,2 раза устойчивее к бактерицидной активности сыворотки крови и в 1,7 раза более гидрофильны (р<0,05), но достоверно не отличались по 7-потенциалу. Кроме того, в специальной серии опытов с использованием этих же штаммов Е. еоИ показано, что механическая дезинтеграция биопленок практически не изменяла уровень серорезистентности эшерихий.
Обсуждение
При развитии многих эндогенных бактериальных инфекций, включая внекишечные эше-рихиозы, ключевыми этапами патогенеза являются гематогенная диссеминация микроорганизмов и колонизация ими тканей инфицированных органов [7]. Реализация указанных процессов критически зависит от способности возбудителей выживать при контакте с эффекторами иммунитета (в частности, системой комплемента сыворотки крови) и адгезироваться на поверхности клеток макроорганизма (в том числе, с последующим образованием микроколоний и биопленок) [6, 16, 17]. В этой связи понятно повышенное внимание к указанным характеристикам эшерихий как приоритетных возбудителей инфекционно-воспалительных
а)
25 И-РБАС, %
ь
б)
в)
15
10
пл
0
-0,05
-0,1
-0,15
-0,2
-0,25
пл
ГЛБ (усл.ед.)
-10 -
-15 -
-20 -
-25 -
пл
z-пoтенциaл, тМ
Обозначения: ПЛ - клетки планктонной фракции; БП - клетки биопленочной фракции; * - достоверные отличия между группами (р<0,05)
Рисунок. Характеристика клеточных фракций Е. соїі по серорезистентности (а); гидрофобности (б) и z-потенциалу (в)
процессов в урогенитальном тракте и желчевыводящей системе.
Приведенные в работе данные свидетельствуют не только о вариабельности E. coli по серорезистентности, интегральным физико-химическим характеристикам (гидрофобность, z-потенциал) и способности к биопленкообразова-нию, что отражает их фенотипическое разнообразие и отчасти может быть обусловлено коллекционным хранением бактериальных культур, но и об определенных взаимосвязях между этими признаками, представляющих интерес в нескольких аспектах. Так, еще раз подтверждена обратная зависимость уровня устойчивости эше-рихий к комплементопосредованной бактерицидной активности сыворотки крови от степени гидрофобности E. coli, указывающая на существенное значение состояния гидратированнос-ти клеточной стенки грамотрицательных бактерий в детерминации их серорезистентности [12]. Однако другой интегральный физико-химический показатель (z-потенциал) эшерихий слабо влиял как на их устойчивость к сыворотке, так и на их склонность к формированию биопленок, хотя считается, что образующийся при этом эк-зополисахаридный матрикс не только сообщает микроколонии дополнительный отрицательный заряд, но и ограждает бактерии от губительного действия ряда антимикробных веществ [4, 5]. В то же время выявлена обратная корреляционная связь серорезистентности эшерихий с их способностью образовывать биопленки, которая, на
первый взгляд, может показаться парадоксальной, поскольку биопленкообразование «традиционно» связывают с повышенной устойчивостью микроорганизмов к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам, волюнтаристически перенося эти представления на защиту бактерий от других антимикробных веществ, в том числе, выполняющих функцию эффекторов иммунитета макроорганизма [2, 3]. Полученные результаты заставляют усомниться в правомерности такой безусловной экстраполяции, не учитывающей видовую принадлежность и источник выделения бактерий, а также особенности механизмов взаимодействия разных эффекторных систем с ними. Отсюда очевидна необходимость дальнейшего изучения роли биопленкообразо-вания у патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов при их контакте с конкретными гуморальными эффекторами иммунитета, что позволит объективно оценить вклад данного свойства возбудителей в патогенез инфекционно-воспалительных заболеваний разной этиологии. В этом смысле, обнаруженный более высокий уровень серорезистентности у «планктонных» E. coli, в сравнении с «биопленочными» эшерихиями, представляется патогенетически вполне целесообразным, так как именно клетки, не ассоциированные тесно с биопленкой возбудителей, участвуют в гематогенной диссемина-ции внутри макроорганизма, при которой неминуема их встреча с системой комплемента сыворотки крови [6, 7].
------------------------------ 21.06.2011
Список литературы:
1. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999. 284: 1318-1322.
2. Oie S., Huang Y., Kamiya A., Konishi H., and Nakazawa T.. Efficacy of disinfectants against biofilm cells of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. 1996. Microbios. 85: 223-230.
3. Lewis K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2001. 4: 999-1007.
4. Davey M.E., O’Toole G.A.. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. and Molec. Biol. Rev. 2000. 12: 847-867.
5. Ong C.Y., Ulett G.C., Mabbett A. N. et all.. Identification of type 3 fimbriae in uropathogenic Esherichia coli reveals a role in biofilm formation. J. Bacteriol. 2008. 3: 1054-1063.
6. Гриценко В.А., Брудастов Ю.А., Журлов О.С. Серорезистентность энтеробактерий, выделенных из различных источников. Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. 3: 3-6.
7. Гриценко В.А., Иванов Ю.Б. Роль персистентных свойств в патогенезе эндогенных инфекций. Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2009. 4: 66-71.
8. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования/ Под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982. 464 с.
9. O’Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Ann. Rev. Microbiol. 2000, 54: 49-79.
10. Бухарин О.В., Брудастов Ю.А., Гриценко В.А., Дерябин Д.Г. Роль способности бактерий к инактивации факторов естественной противоинфекционной резистентности в их устойчивости к бактерицидному действию крови (сыворотки крови). Бюлл. экспер. биол. и медиц. 1996. 2: 174-176.
11. Magnusson K.E., Stendahl O., Tagesson C., Edebo L., Johansson G. The tendency of smooth and rough Salmonella typhimurium bacteria and lipopolysaccharide to hydrophobic and ionic interaction, as studied in aqueous polymer two-phase systems. Acta Pathol. Microbiol. Scand. (B). 1977. 85: 212-218.
12. Брудастов Ю.А., Гриценко В.А., Журлов О.С., Чертков К.Л. Характеристика гидрофобных свойств бактерий при их взаимодействии с сывороткой крови. Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. 4: 73-77.
13. Soni K.A., Balasubramanian A. K., Beskok A., Pillai S. D. Zeta Potential of Selected Bacteria in Drinking Water When Dead, Starved, or Exposed to Minimal and Rich Culture Media. Curr. Microbiol. 2008. 56: 93-97.
14. Журлов О.С., Гриценко В.А., Брудастов Ю.А. Влияние температуры культивирования на физиологические и физикохимические свойства Escherichia coli K12. Вестник Оренбургского государственного университета. 2009. 12: 106-110.
15. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.
16. Ofek I., Doyle R.J. Bacterial adhesion to cells and tissues. Chapman Hall, 1994. Inc., New York, N.Y.
17. Pratt L.A., Kolter R.. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol. Microbiol. 1998. 30: 285-293.
Работа выполнена в рамках совместного проекта организаций УрО, СО и ДВО РАН
Сведения об авторах:
Гриценко Виктор Александрович,заведующий лабораторией клеточного симбиоза
Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук (г. Оренбург), доктор медицинских наук, профессор Журлов Олег Сергеевич, старший научный сотрудник лаборатории клеточного симбиоза
Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии
наук (г. Оренбург), кандидат медицинских наук Андрейчев Виталий Васильевич, заочный аспирант Института клеточного и внутриклеточного
симбиоза Уральского отделения Российской академии наук (г. Оренбург), врач-дерматовенеролог ММУЗ Муниципальная городская клиническая больница им. Н.И. Пирогова, г. Оренбург 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел.: (3532) 770512, е-mail: vag59@mail.ru
UDC 579.22
Gritsenko V.A., Zhurlov O.S., Andreychev V.V.
The Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis UB RAS, Orenburg
ANALISIS OF INTERCONNECTION OF SERUMRESISTENCE AND PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF ESCHERICHIA COLI WITH THEIR ABILITY TO FORM BIOFILMS
The article includes materials about variability of 45 strains Escherichia coli from patients with infectious-inflammatory diseases of an urogenital tract and biliary ways to serumresistence, integral physico-chemical properties (hydrophobicity, electrokinetic potential - z-potential) and ability to form biofilms. Bacterial isolates forming biofilms and «biofilm« fraction of E. coli are less resistant to bactericidal activity of serum and more hydrophobic, than isolates E. coli not forming biofilms, and cells from «planktonic» fraction was established.
Key words: Escherichia coli, biofilms, planktonic cells, serumresistence, hydrophobicity, z-potential.
