CC BY
117
Экспериментальная биология и медицина УДК 576.851.49
АНАЛИЗ ВЗАИМОСВЯЗИ СЕРОРЕЗИСТЕНТНОСТИ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭШЕРИХИЙ С ИХ СПОСОБНОСТЬЮ ОБРАЗОВЫВАТЬ БИОПЛЕНКИ
© Гриценко В.А., Журлов О.С., Иванов Ю.Б., Гриценко Я.В.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург
E-mail: vag59@mail.ru
На 45 штаммах Escherichia coli, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях урогенитального тракта и желчевыводящей системы человека, показана вариабельность бактерий по серорезистентности, интегральным физико-химическим параметрам (гидрофобность, электрокинетический потенциал) и способности к формированию биопленок. Установлено, что биопленкообразующие культуры и "биопленочная" фракция эшерихий менее устойчивы к бактерицидной активности сыворотки и более гидрофобны, чем изоляты E. coli, не формирующие биопленки, и клетки из "планктонной" фракции.
Ключевые слова: Escherichia coli, биопленки, серорезистентность, гидрофобность, z-потенциал.
ANALYSIS OF THE CORRELATION BETWEEN SERORESISTANCE AND PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF ESCHERICHIA COLI WITH THEIR ABILITY OF FORMING BIOFILMS
Gritsenko V.A., Zhurlov O.S., Ivanov Y.B., Gritsenko Ya.A.
Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis UrB RAS, Orenburg
45 strains of Escherichia coli, isolated from patients with infectious-inflammatory pathologies of urogenital tract and bile passages, were characterized by variability of seroresistance, cumulative physico-chemical parameters (hydrophobic, electro-kinetic potential) and abilities of forming biofilms.It was established that the bacterial cultures with abilities of forming biofilms and "biofilm" faction of E. coli cells are less resistant to the serum bactericidal activities and more hydrophobic than the isolates of E. coli, not forming a biofilm as well as the cells of the "plankton" faction.
Keywords: Escherichia coli, biofilm, seroresistance, hydrophobic, z-potential.
Способность бактерий образовывать биопленки многими исследователями рассматривается как важное свойство, обеспечивающее выживание микроорганизмов в неблагоприятных условиях (высушивание, повышенная инсоляция и др.), а также при их контакте с антибиотиками и дезинфектантами [7, 12, 9]. Считается, что формирование микроорганизмами биопленок имеет отношение к патогенезу многих инфекционновоспалительных заболеваний, в том числе ассоциированных с катетерами и имплантатами [8, 13]. Вместе с тем данные о влиянии биопленко-образования на устойчивость бактерий, в частности Escherichia coli как возбудителей внекишеч-ных эшерихиозов (воспалительная патология урогенитального тракта и желчевыводящих путей, сепсис, нозокомиальные инфекции и др.) [2, 4], к различным эффекторам иммунитета макроорганизма пока немногочисленны и противоречивы [14], что определяет актуальность исследований, направленных на изучение взаимосвязи между указанными свойствами.
Целью настоящей работы явился анализ взаимосвязи серорезистентности и интегральных физико-химических характеристик (гидрофобность, электрокинетический потенциал) эшерихий, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях урогенитального тракта и желчевы-
водящих путей, с их способностью образовывать биопленки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования выполнены на 45 штаммах Escherichia coli, выделенных от больных с инфекционно-воспалительной патологией из мочи и урогенитального тракта (пиелонефрит, цистит, простатит, сальпингоофорит и др.), а также с заболеваниями желчевыводящей системы (гнойный холангит, холецистит) и хранящихся в коллекции ИКВС УрО РАН. Идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам с использованием систем "ENTEROTest" (LaChema, Чехия).
Образование биопленок эшерихиями изучали с помощью "планшетного метода" [14], путем выращивания штаммов E. coli в 150 мкл мясопеп-тонного бульона (МПБ) в 96-луночной полисти-роловой планшете в течение 24 ч при 37°С, удаления из лунок планктонных клеток, окрашивания биопленок 1% кристалвиолета, промывания лунок дистиллированной водой, внесения в них 96% этанола и замера с помощью планшетного фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) оптической плотности (OD) надосадочной
жидкости при длине волны 540 нм. Интенсивность окрашивания соответствовала степени пленкообразования исследуемыми культурами эшерихий.
Для определения серорезистентности, гидро-фобности и электрокинетического потенциала эшерихий использовали суточные агаровые культуры E. coli, а также клетки из разных фракций бульонных культур эшерихий, инкубированных в лунках планшеты. Планктонную фракцию клеток E. coli отбирали путем изъятия из лунок 100 мкл надосадочной части МПБ, содержащей взвешенные бактерии; биопленочную фракцию эшерихий получали путем добавления к осадку 100 мкл 15М раствора NaCl и механической деструкции (диспергирование) пленок. Обе фракции клеток трижды отмывали 15М раствором NaCl (30 мин, 3000 об/мин) и стандартизовали по OD на фотоэлектроколориметре КФК-2 (Россия) при длине волны А,=540 нм.
Серорезистентность эшерихий оценивалась по методике [3] с использованием в опыте 50% сыворотки крови человека (пул от 20 здоровых доноров), а в контроле - 15М раствора NaCl путем замера с помощью планшетного фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) оптической плотности (OD) опытных и контрольных взвесей при длине волны 540 нм и расчета индекса резистентности к бактерицидной активности сыворотки (И-РБАС, %) по следующей формуле: И-РБАС=ODо/ODк*100, где ODо и ODк - оптические плотности опытных и контрольных взвесей бактерий соответственно.
Для оценки степени гидрофобности эшерихий использовали метод разделения взвеси клеток E. coli в двухфазной системе "жидкость-жидкость" с несмешивающимися водными фазами в 0,15М растворе NaCl, обогащенными полиэтиленглико-лем (PEG 6000; с конечной концентрацией 4,5%) и декстраном (Т500; с конечной концентрацией 6,2%), что представляет собой средний уровень межфазного поверхностного натяжения [1, 10]. Эмульгирование смеси производили непосредственно после добавления в нее бактерий путем интенсивного встряхивания в течение 120 сек при комнатной температуре на вортексе (2000 об/мин). О гидрофобности бактерий судили по показателю гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ), который рассчитывали по формуле: ГЛБ=Lg(ODpEG/ODDextran), где ODpeg и ODoextran -оптические плотности верхней (гидрофобной, обогащенной PEG 6000) фазы и нижней (гидрофильной, обогащенной декстраном Т500) фазы соответственно, замеренных с помощью спектрофотометра (СФ-46, А,=541 нм, ширина кюветы 1 см).
Измерение электрокинетического потенциала (z-потенциала, mV) клеток E. coli осуществляли амплитудно-частотным методом [16] с использованием Дзетометра-1М (Россия) в обычном режиме его работы (напряжение - 10 В, частота -0,2 Гц) путем измерения амплитуды колебаний 50 бактериальных клеток в микроэлектрофоретиче-ской камере (размеры: 22x22 мм, высота 0,2 мм) и вычисления средних значений z-потенциала для конкретного данного штамма по аппроксимированной формуле Смолуховского [5].
Обработку данных осуществляли методами вариационной статистики и корреляционного анализа[6].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изученные штаммы E. coli оказались вариабельными по способности образовывать биопленки: большую часть выборки (64,4±7,2% изолятов) составили биопленкообразующие эшерихии (0D>0,2), а 35,6±7,2% культур кишечной палочки не образовывали биопленки. Причем среди биопленкообразующих изолятов E. coli имелись культуры как со слабой (0,2<0D<0,6), так и с высокой (OD>0,6) экспрессией данного признака (42,2±7,4 и 22,2±6,3% штаммов соответственно). Сопоставление выраженности других характеристик у биопленкообразующих E. coli и эшерихий без этого свойства выявило достоверные (p<0,05) межгрупповые отличия E. coli по уровню сероре-зистентности и степени гидрофобности (табл.). Эшерихии, склонные к биопленкообразованию, были менее устойчивы к бактерицидной активности сыворотки (И-РБАС=71,5±6,5%) и обладали более высокой степенью гидрофобности (ГЛБ=-0,42±0,2 усл. ед.), чем не образующие биопленки штаммы E. coli (И-РБАС=95,4±2,8%; ГЛБ=-0,76±0,3 усл. ед.; соответственно).
Результаты корреляционного анализа, проведенного внутри всей выборки E. coli и в группе биопленкообразующих культур кишечной палочки, также указывали на наличие у эшерихий достоверных взаимосвязей их способности образовывать биопленки с серорезистентностью и гид-рофобностью (r=0,39-0,47, p<0,05), а кроме того, на обратную зависимость уровня устойчивости E. coli к сыворотке крови от степени их гидро-фобности (r=-0,50, p<0,05).
Для экспериментального подтверждения взаимосвязи биопленкообразования эшерихий с их серорезистентностью и физико-химическими свойствами на 9 штаммах кишечной палочки, формирующих выраженные биопленки (OD>0,6), проведено определение указанных свойств у клеток E. coli, препаративно отобранных из планктонных и биопленочных фракций.
Таблица 1
Характеристика вариабельности эшерихий по серорезистентности и физико-химическим свойствам (с учетом их способности к биопленкообразованию)
Характеристики Изученные штаммы E. coli (n=45)
бактерий Не образующие биопленки (n= 16) Образующие биопленки (n= 29) Всего
Доля штаммов, % 35,6±7,2 64,4±7,2 100
И-РБАС, % 60,0-105,2 4,3-100,2 4,3-100
95,4±2,8 71,5±6,5* 80,0±4,6
ГЛБ, усл. ед. -2,13 - +0,93 -0,76±0,3 -1,71- +2,04 -0,42±0,2* -2,13-2,04 -0,54±0,1
z-потенциал, mV -12,5- -29,9 18,9±1,2 -10,5- -33,6 -18,5± 1,0 -10.5—-33,6) -18,7±0,8
Примечание: И-РБАС - индекс резистентности к бактерицидной активности сыворотки; ГЛБ - гидрофильно-липофильный баланс; в числителе - диапазон варьирования признака; в знаменателе - средние значения; * - достоверные отличия между группами (р<0,05).
а)
б)
в)
25 И-РБАС, %
20
15
10
-f-
ПЛ
0
-0,05
-0,1
-0,15
-0,2
-0,25
ПЛ
ГЛБ (усл.ед.)
-10
-15
-20
-25
ПЛ
z-потенциал, mV
Рис. 1. Характеристика клеток E. coli из разных фракций по: а) серорезистентности (И-РБАС, %); б) гидрофобности (ГЛБ, усл. ед.) и в) z-потенциалу (mV).
Примечание: но оси абсцисс - выраженность признака; ПЛ - планктонные клетки (светлые столбики); БП - биопленочные клетки (темные столбики); * - достоверные отличия между группами (р<0,05).
Установлено, что "планктонные" клетки Е. соИ в сравнении с "биопленочными" были в 1,2 раза устойчивее к бактерицидной активности сыворотки крови (р<0,05) и в 1,7 раза более гидрофильнее (р<0,05), но достоверно не отличались поz-потенциалу (рис.). В специальной серии опытов с использованием этих же штаммов Е. соИ было показано, что эшерихии в «интактных» биопленках и во взвешенном состоянии после механической дезинтеграции биопленок практически не отличались по уровню своей серорези-стентности и степени гидрофобности.
При развитии многих эндогенных бактериальных инфекций, включая внекишечные эшери-
хиозы, ключевыми этапами патогенеза являются гематогенная диссеминация микроорганизмов и колонизация ими тканей инфицированных органов [3, 4]. Реализация указанных процессов критически зависит от способности возбудителей выживать при контакте с эффекторами иммунитета (в частности, системой комплемента сыворотки крови) и адгезироваться на поверхности клеток макроорганизма (в том числе, с последующим образованием микроколоний и биопленок) [11, 15]. В этой связи понятно повышенное внимание к указанным характеристикам эшери-хий как приоритетных возбудителей инфекцион-
0
5
5
0
но-воспалительных процессов в урогенитальном тракте и желчевыводящей системе человека.
Приведенные в работе данные, с одной стороны, свидетельствуют о вариабельности E. coli по серорезистентности, интегральным физикохимическим характеристикам (гидрофобность, z-потенциал) и способности к биопленкообразова-нию, что отражает их фенотипическое разнообразие и отчасти может быть обусловлено коллекционным хранением бактериальных культур, с другой стороны, отражают наличие определенных взаимосвязях между этими признаками, что представляет определенный интерес в нескольких аспектах. Так, еще раз подтверждена обратная зависимость уровня устойчивости эшерихий к ком-плементопосредованной бактерицидной активности сыворотки крови от степени гидрофобности E. coli, указывающая на существенное значение состояния гидратированности клеточной стенки грамотрицательных бактерий в детерминации их серорезистентности [1]. Однако другой интегральный физико-химический показатель (элек-трокинетический потенциал) эшерихий слабо влиял как на их устойчивость к сыворотке, так и на их склонность к формированию биопленок, хотя считается, что образующийся при этом экзо-полисахаридный матрикс не только сообщает микроколонии дополнительный отрицательный заряд, но и ограждает бактерии от губительного действия ряда антимикробных веществ [8, 13]. В то же время выявлена обратная корреляционная связь серорезистентности эшерихий с их способностью образовывать биопленки, которая на первый взгляд может показаться парадоксальной, поскольку биопленкообразование "традиционно" связывают с повышенной устойчивостью микроорганизмов к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам, «волюнтаристически» без должной экспериментальной проверки перенося эти представления на защиту бактерий от других антимикробных веществ, в том числе выполняющих функцию эффекторов иммунитета макроорганизма [12]. Полученные результаты заставляют усомниться в правомерности такой безусловной экстраполяции, не учитывающей видовую принадлежность бактерий и особенности механизмов взаимодействия разных эффекторных систем с ними. Отсюда очевидна необходимость дальнейшего изучения роли биопленкообразования у патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов при их контакте с конкретными гуморальными эффекторами иммунитета, что позволит объективно оценить вклад данного свойства возбудителей в патогенез инфекционновоспалительных заболеваний разной этиологии. В этом смысле, обнаруженный более высокий уровень серорезистентности у "планктонных" клеток
E. coli, в сравнении с "биопленочными" эшери-хиями, представляется патогенетически вполне целесообразным, так как именно они участвуют в гематогенной диссеминации возбудителей внутри макроорганизма, при которой неминуема их встреча с системой комплемента сыворотки крови
[9].
(Работа выполнена в рамках совместного проекта организаций УрО и ДВО РАН и гранту РФФИ № 11-04-97102-р_поволжье_а).
ЛИТЕРАТУРА
1. БрудастовЮ.А., Гриценко В.А., Журлов О.С., Чертков К.Л. Характеристика гидрофобных свойств бактерий при их взаимодействии с сывороткой крови // Журн. микробиол., эпи-демиол. и иммунобиол. - 1997. - № 4. - С. 73-77.
2. Брудастов Ю.А., Гриценко В.А., Кудря Е.В., Васильева Л.В. Сравнительный анализ устойчивости энтеробактерий к желчи // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2002. - № 3. - С. 65-67.
3. Бухарин О.В., Брудастов Ю.А., Гриценко В.А., Дерябин Д.Г. Роль способности бактерий к инактивации факторов естественной противоинфекционной резистентности в их устойчивости к бактерицидному действию крови (сыворотки крови). // Бюлл. экспер. биол. и медиц. - 1996. - № 2. -С. 174-176.
4. Гриценко В.А., Брудастов Ю.А., Журлов О.С. Серорези-стентность энтеробактерий, выделенных из различных источников. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.
- 1999. - № 3. - С. 3-6.
5. Журлов О.С., Гриценко В.А., Брудастов Ю.А. Влияние температуры культивирования на физиологические и физикохимические свойства Escherichia coli K12 // Вестник ОГУ. -2009. - № 12. - С. 106-110.
6. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990. - 212 с.
7. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. -1999. - N284. - P. 1318-1322.
8. DaveyM.E., O’Toole G.A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics // Microbiol. and Molec. Biol. Rev. - 2000.
- N12. - P. 847-867.
9. Lewis K. Riddle of biofilm resistance // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2001. - N4. - P. 999-1007.
10. Magnusson K.E., Stendahl O., Tagesson C., Edebo L., Johansson G. The tendency of smooth and rough Salmonella typhi-murium bacteria and lipopolysaccharide to hydrophobic and ionic interaction, as studied in aqueous polymer two-phase systems // Acta Pathol. Microbiol. Scand. (B). - 1977. - N85. -P. 212-218.
11. Ofek I., Doyle R.J. Bacterial adhesion to cells and tissues // N.Y.: Chapman Hall, 1994.
12. Oie S., Huang Y., Kamiya A., Konishi H., Nakazawa T. Efficacy of disinfectants against biofilm cells of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Microbios. - 1996. -N85. - P. 223230.
13. Ong C.Y., Ulett G.C., Mabbett A. N. et al. Identification of type 3 fimbriae in uropathogenic Escherichia coli reveals a role in biofilm formation // J. Bacteriol. - 2008. - N3. - P. 1054-1063.
14. O’Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - N54.
- P. 49-79.
15. Pratt L.A., Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili // Mol. Microbiol. - 1998. - N30. - P. 285-293.
16. Soni K.A., Balasubramanian A. K., Beskok A., Pillai S. D. Zeta Potential of Selected Bacteria in Drinking Water When Dead, Starved, or Exposed to Minimal and Rich Culture Media // Curr Microbiol. - 2008. - N 56. - P. 93-97.
