CC BY
10
VВсероссийская научно-практическая конференция с международным участием «ГЕНЕТИКА ОПУХОЛЕЙ КРОВЕТВОРНОЙ СИСТЕМЫ -ОТ ДИАГНОСТИКИ К ТЕРАПИИ»
Цель. Изучить клональную гетерогенность у пациентов с лимфопролиферативными заболевания и клональность при отсутствии признаков опухоли.
Материалы и методы. Ретроспективный анализ данных клональности проведен у 2182 пациентов. Проспективный анализ — у 102 пациентов. Клональные реаранжировки выявляли с помощью метода ПЦР по протоколу ВЮМЕО-2 и последующим проведением фраг-ментного анализа. Селекция лимфоцитов крови проводилась при помощи магнитных частиц.
Результаты. По данным ретроспективного анализа — одновременное выявление В- и Т-клеточной клональности (четкие клональные пики и клональные пики на поли-клональном фоне — сомнительная монокло-нальная картина) отмечено у 121 из 2182 пациентов. В-клеточная клональность не выявлена ни в одном из случаев Т-клеточных лимфом и в 97% случаев ассоциирована с В-клеточной лимфомой (пациенты с АИТЛ исключены). Т-клеточная клональность, напротив, выявлена в 21% случаев В-клеточных лимфом. Среди всех неходжкинских лимфом выявление Т-клеточной клональности только в 17% случаев ассоциировано с Т-клеточной лимфомой. В единичных случаях одновременное выявление В- и Т-клональности может свидетельствовать о наличии нескольких опухолей (композитной лимфомы).
Клональная гетерогенность — наличие различных по длине в парах нуклеотидов клональ-ных продуктов в различных органах и тканях у одного пациента была отмечена нами при исследовании пациентов с ангиоиммунобласт-
Санкт-Петербург 26-27 апреля 2019 г.
ной Т-клеточной лимфомой (АИТЛ). У 76 % (20 из 26) больных клональные продукты полностью или частично отличались от выявленных в материале лимфатического узла. После выполнения селекции на СЭ4 и СЭ8 лимфоциты, показано, что часть клональных Т-лимфоцитов принадлежит к СЭ8+ популяции лимфоцитов и не имеет отношения к опухоли. В группе здоровых доноров и добровольцев у 35,5 % (18 из 62) человек в крови определялось преобладание одной или нескольких популяций Т-лимфоцитов. Разделив их на СБ8+ популяцию и СЭ8- популяции, мы показали, что у 10 из 12 обследованных доноров в СЭ8+ популяции лимфоцитов обнаружены моноклональные реаранжировки генов ТСЯ (п=7), сомнительные моноклональные реаранжировки (п=1) или олигоклональные реаранжировки (п=2). Если в общей популяции был выявлен доминирующий пик, то он же доминировал в СЭ8+ популяции. При этом у большинства обследованных (у 8 из 12) оставшаяся популяция клеток (СЭ8-) была поликлональной.
Выводы. Таким образом, В-клеточная клональность является более важным диагностическим критерием наличия В-клеточной лимфомы, в отличие от Т-клеточной клональности, при диагностике Т-клеточной лимфомы. СЭ8+ лимфоциты, имеющие клонально перестроенные гены ТСЯ, могут персистировать в течение длительного времени и выявляются не только при аутоиммунных заболеваниях, неопухолевых гематологических заболеваниях, но и у пациентов с лимфомами и у здоровых лиц и не имеют отношения к опухоли.
Т. Н. Субботина1,2, А. А. Карнюшка1, И. Е. Маслюкова1
1 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский федеральный университет», г. Красноярск
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный Сибирский научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства России», г. Красноярск
АНАЛИЗ УРОВНЯ АЛЛЕЛЬНОИ НАГРУЗКИ СОМАТИЧЕСКОМ МУТАЦИЕИ С. 1849 G>T (V617F) В ГЕНЕ JAK2 С ПОМОЩЬЮ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ
«MINOR VARIANT FINDER»
Введение. Соматические мутации в опухолевых клетках могут служить диагностическими и прогностическими маркерами, а также определять чувствительность к противораковым препаратам. Известно, что при использовании метода Сэнгера для анализа соматических му-
таций существуют проблемы, связанные как с количественной оценкой уровня присутствия мутантного аллеля (что важно при онкогема-тологических патологиях), так и с интерпретацией результатов в образцах ДНК с уровнем нагрузки мутантным аллелем менее 15-20 %.
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XV, № 2, 2019
В тоже время достаточно часто, в том числе и при онкогематологических заболеваниях, соматические мутации (драйверные или ассоциированные с неблагоприятным прогнозом течения заболевания) присутствуют в небольшом количестве исследуемых аллелей. Это диктует необходимость использования более чувствительных молекулярно-генетических методов или дополнительного программного обеспечения (ПО). Новое ПО «Minor Variant Finder» для генетических анализаторов фирмы Applied Biosystems предлагается как удобное в использовании ПО для поиска малопред-ставленных вариантов соматических мутаций, а также подходящее для оценки уровня ал-лельной нагрузки соматическими мутациями. Наиболее часто встречающейся драйверной мутацией среди пациентов с хроническими миелопролиферативными неоплазиями (ХМН) является мутация c.1849 G>T (V617F) в 14 эк-зоне гена JAK2.
Целью Определение уровня аллельной нагрузки соматической мутацией c.1849 G>T (V617F) в гене JAK2 с помощью программы «Minor Variant Finder» в образцах ДНК от пациентов с диагнозом ХМН.
Материалы и методы. Исследовали образцы ДНК 5 пациентов с диагнозом ХМН и разным уровнем аллельной нагрузки ранее выявленной мутации c.1849 G>T (V617F) в гене JAK2. ДНК выделяли из лейкоцитов венозной крови с использованием набора реагентов GeneJET™ (ThermoFisherScientific). Участок гена JAK2 (377bp) амплифицировали, используя прай-меры JAK2_F (5>-CAAAGCACATTGTATCCTCA-3>) и JAK2_R (5>-AGTCCTACAGTGTTTTCAGT-3>). Продукт ПЦР очищали ExoSAP-IT. Секвенирующую ПЦР с прямого и обратного праймеров, а также очистку полученного продукта проводили с использованием наборов BigDyeTerminatorv3.1 и BigDyeXTerminator. Пробы подвергали капиллярному электрофорезу на генетическом анализаторе 3500. Полученные сиквенсы срав-
нивали с референсной последовательностью гена JAK2 (NM_004972.3) и контролями для обоих праймеров в программе «Minor Variant Finder» (Applied Biosystems, США) для определения уровня аллельной нагрузки мутацией c.1849 G>T (V617F) в 14 экзоне гена JAK2. В качестве контроля использовали ДНК пациента без вышеуказанной мутации.
Результаты. Важно отметить, что ПО «Minor Variant Finder» имеет существенное ограничение и может быть использовано для поиска малопредставленных вариантов соматических мутаций и определения уровня аллельной нагрузки только при анализе однонуклеотидных замен и не может быть использовано в случае indel мутаций. При анализе мутации c.1849 G>T (V617F) в 14 экзоне гена JAK2 указанное ПО удобно использовать как для поиска малопредставленных вариантов, так и для определения уровня аллельной нагрузки данной мутацией. Уровень аллельной нагрузки мутацией c.1849 G>T при использовании ПО «Minor Variant Finder» у пациента № 1 составил 5,1 % и 4,7 %; № 2-11,0 % и 19,1 %; № 3-14,1 % и 17,7 %; № 4-12,0 % и 12,8 %; № 5-41,2 % и 37,8 % с прямого и обратного праймеров, соответственно. Ранее данный показатель для выбранных пяти образцов ДНК был определен либо методом пиросеквенирования, либо ПЦР-РВ и составил 5,2, 10,5, 15,7, 14,3 и 35,2 %, соответственно.
Выводы. ПО «Minor Variant Finder» может быть использовано для выявления малопредставленных вариантов и оценки уровня аллельной нагрузки соматической мутации c.1849 G>T (V617F) в 14 экзоне гена JAK2. Важно отметить, что использование ПО «Minor Variant Finder» позволяет увеличить выявляемость соматических мутаций, поскольку в случае присутствия в образце ДНК менее 20 % мутантного аллеля и анализе результатов секвенирования по Сен-геру без применения данного ПО нельзя быть уверенным в наличии мутации.
